Microwaving y fluorofore-Tyramida para inmunomanchado multiplex en las adrenales del ratón - Uso de anticuerpos primarios no conjugados de la misma especie anfitriona

Resumen

Se han establecido varios métodos diferentes para la inmunomanchación múltiple utilizando anticuerpos primarios de la misma especie huésped. Aquí, describimos el uso de desmontaje de anticuerpos mediados por microondas y de taquimida de fluoróforo para bloquear la reactividad cruzada de anticuerpos durante la inmunomancha multiplex en secciones suprarrenales de ratón incrustadas en parafina fija sin forfina.

Resumen

La inmunomancha es ampliamente utilizada en la investigación biomédica para mostrar el patrón de expresión celular de una proteína dada. La inmunomancha múltiple permite el etiquetado con múltiples anticuerpos primarios. Para minimizar la reactividad cruzada de anticuerpos, la inmunomancha múltiple mediante tinción indirecta requiere anticuerpos primarios sin etiquetar de diferentes especies huésped. Sin embargo, la combinación adecuada de diferentes especies de anticuerpos no siempre está disponible. Aquí, describimos un método de uso de anticuerpos primarios sin etiquetar de la misma especie huésped (por ejemplo, en este caso, ambos anticuerpos son de conejo) para la inmunofluorescencia múltiplex en secciones suprarrenales de ratón con incrustación de parafina fijada en formalina (FFPE). Este método utiliza el mismo procedimiento y reactivos utilizados en el paso de recuperación de antígenos para eliminar la actividad del complejo de anticuerpos primarios previamente manchado. Las diapositivas se teñieron con el primer anticuerpo primario utilizando un protocolo general de inmunomanchado seguido de un paso de unión con un anticuerpo secundario biotinilado. Luego, se utilizó un método de desarrollo de señal de avidina-biotina-peroxidasa con fluoróforo-tiramida como sustrato. La inmunoactividad del primer complejo de anticuerpos primarios se desprendía a través de la inmersión en una solución de citrato de sodio hirviendo por microondas durante 8 min. La deposición insoluble de fluoróforo-tiramida permaneció en la muestra, lo que permitió que la diapositiva se manchase con otros anticuerpos primarios. Aunque este método elimina la mayoría de las señales falsas positivas, puede quedar algún fondo de la reactividad cruzada de anticuerpos. Si las muestras se enriquecen con biotina endógena, se puede utilizar un anticuerpo secundario conjugado por peroxidasa para reemplazar el anticuerpo secundario biotintilado para evitar el falso positivo de la biotina endógena recuperada.

Introducción

En la inmunomancha múltiple, la tinción directa con anticuerpos primarios conjugados puede proporcionar resultados informativos. Sin el uso de anticuerpos secundarios, el método de tinción directa tiene un bajo riesgo de señales de colocalización falsas debido a la reactividad cruzada de anticuerpos. Sin embargo, los reporteros conjugados (fluoróforo, enzimas) o biotina en el anticuerpo primario limitan su uso futuro. Alternativamente, la inmunomancha indirecta generalmente proporciona señales más fuertes mediante el uso de un anticuerpo primario no conjugado con un anticuerpo secundario etiquetado. Idealmente, los anticuerpos primarios no conjugados utilizados en la ....

Protocolo

1. Manchado con el primer anticuerpo

1. Dewax y rehidratar los portaobjetos FFPE con 5 min asignados a cada uno de los siguientes pasos: xileno o reactivos equivalentes 3x, 100% etanol 2x, 95% etanol 1x, 70% etanol 1x, 50% etanol 1x, y agua destilada 2x.
   NOTA: Las diapositivas deben permanecer húmedas a partir de este paso de rehidratación hasta el montaje en el paso final.
2. Para la recuperación opcional de antígenos, coloque las diapositivas en 275 ml de solución de citrato de sodio hirviendo (10 mM, pH a 6,0) durante 8 min. Para mantener la solución hirviendo, coloque los portaobjetos planos en la parte inferior de una caja de punta de pipeta de 1....

Resultados

Los resultados se obtuvieron de muestras tratadas con todos los pasos descritos, incluido el paso 1.2 de recuperación de antígenos. Todos los anticuerpos secundarios utilizados aquí fueron biotinylados. El fluoróforo-tiramida se utilizó para desarrollar señales de los anticuerpos primarios primero y segundo. Las imágenes fueron capturadas utilizando un microscopio de fluorescencia equipado con un cubo FITC (para fluorescencia verde), un cubo TxRED (para Cy3) y un cubo DAPI (para DAPI).

Discusión

La inmunomancha múltiple es útil para examinar la colocalización celular de dos o más antígenos. Esta técnica ampliamente utilizada da resultados convincentes de colocación cuando los anticuerpos primarios se conjugan con diferentes reporteros (tinción directa). Sin embargo, la tinción directa generalmente proporciona señales más débiles en comparación con la tinción indirecta, que implica anticuerpos secundarios conjugados para detectar los anticuerpos primarios. En la tinción indirecta, un resultado de inmunomancha múl.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Medio de montaje antidecoloración	Vector Laboratories	H-1000
Burro biotinilado anti-ratón	JacksonImmuno	715-066-151	dilución 1:500
Burro biotinilado anti-conejo	JacksonImmuno	711-066-152	dilución 1:500
DAPI	BioLegend	422801	2 μ g/mL en agua destilada
Microscopio de fluorescencia	ECHO	Revolve 4
Estreptavidina conjugada con peroxidasa de rábano picante	JacksonImmuno	016-030-084	dilución 1:1.000
Horno microondas, 700 W	General Electric	JEM3072DH1BB
Ratón anti-CYP2F2	Santa Cruz	SC-374540	Dilución 1:250
Anti-TH	de ratónSanta Cruz	SC-25269	dilución 1:1.000
Suero de burro normal	JacksonImmuno	017-000-121	Suero al 2% en PBST
Conejo anti-20&alfa; HSD	Kerafast	EB4002	dilución 1:500
Conejo anti-3β HSD	TransGenic	KO607	dilución 1:250
Conejo anti-TH	NOVUS	NB300-109	dilución 1:1.000
Conejo anti-β-catenina	Abcam	ab32572	dilución 1:500
Estreptavidina Rábano picante Peroxidasa (SA-HRP)	JacksonImmuno	016-303-084	Dilución 1:1.000
TSA Cy3 Tiramida	PerkinElmer	SAT704B001EA	Dilución 1:100
TSA Fluoresceína Tiramida	PerkinElmer	SAT701001EA	dilución 1:100