Viabilidad mejorada para cultivos de hidrogel 3D Ex vivo de xenoinjertos derivados del paciente en una plataforma microfluídica perfundida

Resumen

Este protocolo demuestra métodos para permitir el cultivo in vitro extendido de xenoinjertos derivados del paciente (PDX). Un paso mejora la viabilidad general de los cultivos de racimos multicelulares en hidrogeles 3D, a través de la eliminación directa de células individuales no viables. Un paso secundario demuestra las mejores prácticas para el cultivo de PDX en una plataforma microfluídica perfundida.

Resumen

Los xenoinjertos derivados del paciente (PDX), generados cuando el tejido tumoral resecado del paciente se injerta directamente en ratones inmunocomprometidos, permanecen biológicamente estables, preservando así las características moleculares, genéticas e histológicas, así como la heterogeneidad del tumor original. Sin embargo, el uso de estos modelos para realizar una multitud de experimentos, incluyendo la detección de drogas, es prohibitivo tanto en términos de costo como de tiempo. Los sistemas de cultivo tridimensionales (3D) son ampliamente vistos como plataformas en las que las células cancerosas conservan su integridad biológica a través de interacciones bioquímicas, morfología y arquitectura. Nuestro equipo tiene una amplia experiencia en el cultivo de células PDX in vitro utilizando matrices 3D compuestas de ácido hialurónico (HA). Con el fin de separar las células estromales fibroblastas de ratón asociadas con los PDX, utilizamos el cultivo de rotación, donde las células estromales se adhieren a la superficie de las placas tratadas con cultivo de tejidos mientras flotan las células tumorales PDX disociadas y se autoasocien en cúmulos multicelulares. También flotan en el sobrenadante son células simples, a menudo muertas, que presentan un desafío en la recolección de clústeres PDX viables para la encapsulación aguas abajo en hidrogeles para el cultivo celular 3D. Con el fin de separar estas células individuales de los cúmulos de células vivas, hemos empleado centrifugación de gradiente de paso de densidad. El protocolo descrito aquí permite el agotamiento de células individuales no viables de la población sana de grupos celulares que se utilizarán para la experimentación in vitro. En nuestros estudios, incorporamos los cultivos 3D en placas microfluídicas que permiten la perfusión media durante el cultivo. Después de evaluar los cultivos resultantes utilizando un ensayo de viabilidad basado en imágenes fluorescentes de células purificadas frente a no purificadas, nuestros resultados muestran que este paso de separación adicional redujo sustancialmente el número de células no viables de nuestros cultivos.

Introducción

Durante la última década, el campo de la investigación del cáncer ha demostrado un renovado entusiasmo por los xenoinjertos derivados del paciente (PDX) como una herramienta para evaluar la dependencia de las vías de las células cancerosas y la susceptibilidad a los medicamentos¹. Los modelos PDX más comunes se establecen mediante implantación subcutánea u ortotópica de células tumorales humanas (un fragmento tumoral, un grupo de células derivadas de tumores disociadas o una muestra de células tumorales circulantes aisladas (CTC)) en un huésped de roedores. Si la "toma" tumora tiene éxito, las células del xenoinjerto proliferarán, vascularizará....

Protocolo

El tejido tumoral se obtuvo con el consentimiento del paciente y de acuerdo con un protocolo aprobado de la Junta de Revisión Institucional (IRB). Los xenoinjertos fueron implantados, cultivados y cosechados de acuerdo con un protocolo aceptado del Comité Institucional de Cuidado y Uso animal (IACUC).

NOTA: Todo el trabajo debe realizarse en un armario de seguridad biológica estéril para mantener la esterilidad. Todos los pasos deben llevarse a cabo a temperatura ambiente a menos que se especifique lo contrario.

1. Preparación de materiales para el procesamiento DE PDX

1. Fórceps de autoclave y mango de bi....

Resultados

Se preparó un balancín de perfusión programable en una incubadora de cultivo celular de agua estándar, y se prepararon placas microfluídicas de dos carriles en un gabinete de bioseguridad estándar para la carga (Figura 1). Un tumor MDA-PCA-118b PDX se amplió in vivo, se recolectó cuando había alcanzado un tamaño máximo, y se disociaba como se describe en la sección 2 del protocolo para crear una suspensión de lodos de las células, en aproximadamente un estado de una sola célula (

Discusión

Aquí describimos un método para procesar y cultivar células tumorales derivadas de PDX viables en un sistema de cultivo 3D perfundido y de alto rendimiento. Mientras que este protocolo utiliza tejido PCa PDX, es igualmente eficaz para otros tumores de origen epitelial. Las características tumorales varían entre las líneas PDX individuales incluso dentro del mismo tejido de origen (próstata, mama, etc.). Algunas líneas PCa PDX son más fibrosas y difíciles de aislar las células viables, mientras que otras son más celulares.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
1N NaOH			cualquier grado de cultivo de tejidos adecuado
60 mm placas
de tejidos redondas cualquier placa de cultivo de tejidos de 6 pocillos			adecuada cualquier
70 y micro adecuado; Filtros de células m	Centrífuga	431751	Corning o equivalente
	Eppendorf	5810R con rotor y cangilones adecuados para tubos de centrífuga cónicos de 15/50 mL	o
equivalente Solución de centrifugación en gradiente de densidad	Millipore Sigma	P1644	Percoll
Dimetilsulfóxido cualquier grado de cultivo de	tejidos adecuado
disociación	StemCell Technologies	07921	ACCUMAX
DMEM-F12	ThermoFisher Scientific	11039021	o pinzas
kit de hidrogel HA	ESI BIO	GS311	HyStem (ácido hialurónico-SH y PEGDA)
Hanks Balanced Salt Solution	Lonza	10-527F	o equivalente
Inactivado por calor suero fetal bovino	Atlanta Biologicals	S11150
Hemocitómetro	Fisher Scientific	02-671-51B Hausser BrightLine	o equivalente
Hoechst 33342	ThermoFisher Scientific	H1398	o equivalente
Software de procesamiento de imágenes	Oxford Instruments	Imaris 9.3	o equivalente
Kit de viabilidad/citotoxicidad de células vivas/muertas (Calcein-AM/ Homodímero de etidio-1)	ThermoFisher Scientific	L3224	o equivalente
Placa de cultivo microfluídico	Mimetas	9603-400-B	OrganoPlate de 2 carriles
	Nikon	A1R	o equivalente
Pipeta multicanal	Eppendorf	3125000036	o
equivalente Tejido			tumoral derivado de PDXobtenido bajo la aprobación del IRB para tejido humano y la aprobación de la IACUC para el huésped animal
Penicilina-estreptomicina	ThermoFisher Scientific	15140-122	o equivalente
Balancín de perfusión	Mimetas	OrganoPlate Perfusion Rocker Mini
tiras de pH (pH 5-9)			cualquier
solución salina tamponada con fosfato	adecuada Lonza	17-516F	o equivalente
		afeitar	cualquier
agitador xy giratorio	Agitador orbital VWR Advanced 3500	o
bisturí equivalente mango			cualquier
pipeta de repetición monocanal	Eppendorf	22260201
		tubos de centrífuga cónicos de 15 ml cualquier tubo de centrífuga cónico	adecuado
Estéril, 50 ml tubos de

de cultivoSolución de enzimas de equivalentes, cualquier adecuado Microscopio Hojas de adecuado adecuada Estéril, centrífuga cónicos