El objetivo de este protocolo es manipular directamente los receptores del área tegmental ventral para estudiar su contribución a la liberación de dopamina de subsectores.
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Artículo de método
Infusión y estimulación combinadas con voltamperometría cíclica de exploración rápida (CIS-FSCV) para evaluar la regulación del receptor del área tegmental ventral de la dopamina fásica
* These authors contributed equally
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Resumen
Resumen
La liberación de dopamina fásica (DA) desde el área tegmental ventral (VTA) al núcleo accumbens juega un papel fundamental en el procesamiento de recompensas y el aprendizaje por refuerzo. Comprender cómo las diversas entradas neuronales en la liberación de DA fásica de control VTA puede proporcionar una mejor imagen de los circuitos que controlan el procesamiento de recompensas y el aprendizaje por refuerzo. Aquí, describimos un método que combina infusiones de cánula intra-VTA de agonistas farmacológicos y antagonistas con liberación de DA fásica evocada por estimulación (infusión y estimulación combinadas, o CIS) medida por voltamperometría cíclica de exploración rápida in vivo (FSCV). Usando CIS-FSCV en ratas anestesiadas, se puede evocar una respuesta da fásica estimulando eléctricamente el VTA con un electrodo bipolar equipado con una cánula mientras se registra en el núcleo accumbens core. Los agonistas o antagonistas farmacológicos se pueden infundir directamente en el sitio de estimulación para investigar el papel específico de los receptores VTA en la conducción de la liberación de DA fásica. Un beneficio importante de CIS-FSCV es que la función del receptor VTA se puede estudiar in vivo, basándose en estudios in vitro.
Introducción
La liberación de dopamina fásica (DA) desde el área tegmental ventral (VTA) al núcleo accumbens (NAc) juega un papel vital en los comportamientos relacionados con la recompensa. Las neuronas VTA DA cambian de un disparo tónico (3-8 Hz) a un disparo en forma de ráfaga (>14 Hz)1, que produce la liberación fásica de DA en el NAc. El VTA expresa una variedad de receptores somatodendríticos que están bien posicionados para controlar el cambio de tónico a disparo de ráfaga2,3,4,5. Identificar cuál de estos receptores, y sus....
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Protocolo
Todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con la Guía de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y fueron aprobados por Elizabethtown College y el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Yale (IACUC). Este protocolo es específico para la preparación de ratas anestesiadas que utilizan CIS-FSCV.
1. Preparaciones prequirúrgicas
- Preparación de la solución de electrodos
- Para hacer la solución de relleno de electrodos, prepare una solución de acetato de potasio de 4 M con cloruro de potasio de 140 mM16.
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Resultados
CIS-FSCV se utilizó para estudiar la función de los receptores VTA N-metil-D-aspartato (NMDAR), los receptores nicotínicos de acetilcolina (nAChR) y los receptores muscarínicos de acetilcolina (mAChRs) en la conducción de la liberación de DA fásica en el núcleo de NAc. La Figura 2 muestra datos representativos para un control negativo, infusión de solución salina al 0,9%, antes (basal) y 9 min después de la infusión (solución salina). La .......
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Discusión
CIS-FSCV ofrece una oportunidad única para investigar los mecanismos del receptor VTA subyacentes a la liberación de DA fásica. Hay dos pasos críticos para garantizar una grabación adecuada. En primer lugar, se debe lograr un registro de referencia estable, con poca deriva en la señal DA evocada. Una forma importante de aumentar la probabilidad de establecer una grabación estable es asegurarse de que el electrodo haya tenido suficiente tiempo para circular tanto a 60 Hz como a 10 Hz (generalmente 15 minutos a 60 Hz y 10 .......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
El trabajo fue apoyado por Elizabethtown College (R.J.W, M.L. y L.M.), por una beca de posgrado de NSF (R.J.W.) y por la Escuela de Medicina de Yale (N.A.).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Solución de llenado de electrodos/Suministros | |||
| Micropipeta | World Precision Instruments | MF286-5 (calibre 28) | |
| Acetato de potasio | Sigma | 236497-100G | |
| Cloruro de potasio | Sigma | P3911-25G | |
| Suministros de electrodos | |||
| Fibra de carbono | Thornel | T650 | |
| Extractor de electrodos | Narishige International | PE-22 | Nota: también se pueden utilizar extractores horizontales |
| Sistemas capilares de vidrio | A-M | 626000 | |
| Alambres aislados para electrodos | Weico Alambre y cable incorporados | UL 1423 | Longitud; 10 cm; diámetro, 0,4 mm; debe hacerse a medida; el material aislante debe cubrir 5 cm del alambre |
| Microscopio óptico (para ver y cortar el electrodo) | Fischer Scientific | M3700 | |
| Pin | Phoenix Enterprises | HWS1646 | Para soldar en el cable del electrodo aislado y el electrodo de referencia; se conecta a la cabecera |
| Masilla | Alcolin | 23922-1003 | Se utiliza para colocar el electrodo mientras se corta la fibra de carbono |
| Scalpal Blade | World Precision Instruments | 500239 | Para cortar fibra de carbono a la longitud adecuada |
| Silver Wire | Sigma | 327026-4G | |
| FSCV Hardware/Software | |||
| Jaula de Faraday | U-Line | H-3618 (36" x 24" x 42") | |
| Potenciostat | Univ. of N. Carolina, Electronics Facility | ||
| Electrodo estimulante | PlasticsOne | MS303/2-A/SPC | al realizar el pedido, solicite un corte de 22 mm por debajo del pedestal |
| TarHeel HDCV Software | Universidad de Carolina del Norte-Chapel Hill | - | https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/ para la información de pedidos |
| UEI breakout box | Univ. of N. Carolina, Electronics Facility | https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/ para realizar pedidos información | |
| Fuente de alimentación UEI | Univ. de Carolina del Norte, Instalación de Electrónica | https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/ para pedir información | |
| Estimulador Hardware | |||
| Aislador de estímulos neurológicos | Digitimer Ltd. | DS4 | Neurolog 800A |
| Suministros de infusión/estimulaciónBomba de | |||
| infusión New Era Bomba de jeringa | NE-300 | ||
| Cánula interna | de plásticosOne | C315I/SPC INTERNA 33GA Jeringa | |
| de microlitros | Hamilton | 80308 | |
| Tubo | de plásticosOne | C313CT/ TUBO PKG 023 X 050 PE50 | |
| Surgical SuppliesSoporte para | |||
| cánula | Kopf Instruments | 1776 P-1 | |
| Aplicadores de punta de algodón | Vitality Medical | 806 | |
| Portaelectrodos | Kopf Instruments | 1770 | |
| Almohadilla térmica | Kent Scientific | RT-0501 | |
| Povidona Yodo | Vitality Medical | 29906-004 | |
| Tornillos Tornillos de | anclaje óseo de almacenamiento/paquete de 100 | 1,59 mm de diámetro exterior, 3,2 mm de largo | |
| Referencia de alambre de plata con AgCl | InVivo Metric | E255A | |
| Gasa cuadrada | Vitality Medical | ||
| Stereotax | Kopf Instruments | modelo 902 (barra de doble brazo) | |
| Suministros histológicos | |||
| Formulina | Sigma | 1004960700 | |
| Fuente de alimentación | BK Precision | 9110 | |
| Sacarosa | Sigma | 80497 | |
| Microelectrodo de tungsteno | MicroProbes | WE30030.5A3 | |
| Medicamentos para infusiones | |||
| ((2R)-amino-5-fosfonovalérico | ácido Sigma Aldrich | A5282 | |
| N-metil-D-aspartato | Sigma Aldrich | M3262 | |
| Clorhidrato de mecamilamina (M9020-5mg) | Sigma Aldrich | M9020 | |
| Hidrobromuro de escopolamina (S0929-1g) | Sigma Aldrich | S0929 |
Referencias
- Grace, A. A., Bunney, B. S. The control of firing pattern in nigral dopamine neurons: burst firing. Journal of Neuroscience. 4 (11), 2877-2890 (1984).
- Lester, D. B., et al. Midbrain acetylcholine and glutamate receptors modulate accumbal dopamin....
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Reimpresiones y permisos
