Muestreo y análisis de señales de olor animal

Resumen

Hemos desarrollado una metodología eficaz para el muestreo y análisis de señales de olor con el fin de comprender cómo se pueden utilizar en la comunicación animal. En particular, utilizamos la microextracción de fase sólida del espacio de la cabeza junto con la cromatografía de gases y la espectrometría de masas para analizar los componentes volátiles de los olores y las marcas de olor de los animales.

Resumen

Hemos desarrollado una metodología eficaz para el muestreo y análisis de señales de olor, mediante el uso de microextracción en fase sólida del espacio de la cabeza junto con cromatografía de gases-espectrometría de masas, para entender cómo se pueden utilizar en la comunicación animal. Esta técnica permite el análisis semicuantitativo de los componentes volátiles de las secreciones de olores al permitir la separación e identificación tentativa de los componentes de la muestra, seguido del análisis de las relaciones de área de pico para buscar tendencias que pudieran significar compuestos que pudieran estar involucrados en la señalización. Las fortalezas clave de este enfoque actual son el rango de tipos de muestras que se pueden analizar; la falta de necesidad de cualquier preparación o extracción de muestras complejas; la capacidad de separar y analizar los componentes de una mezcla; la identificación de los componentes detectados; y la capacidad de proporcionar información semicuantitativa y potencialmente cuantitativa sobre los componentes detectados. La principal limitación de la metodología se refiere a las propias muestras. Dado que los componentes de interés específico son volátiles, y estos podrían perderse fácilmente, o alterar sus concentraciones, es importante que las muestras se almacenen y transporten adecuadamente después de su recolección. Esto también significa que las condiciones de almacenamiento y transporte de muestras son relativamente costosas. Este método se puede aplicar a una variedad de muestras (incluyendo orina, heces, cabello y secreciones de olor de glándulas olfativas). Estos olores consisten en mezclas complejas, que ocurren en una gama de matrices, y por lo tanto requieren el uso de técnicas para separar los componentes individuales y extraer los compuestos de interés biológico.

Introducción

Se sabe muy poco acerca de los cambios químicos que sustentan las señales olfativas en animales¹, también debido a los desafíos metodológicos en el registro y cuantificación de perfiles químicos volátiles de olores². Hay varios escollos potenciales cuando se trabaja con matrices químicas altamente complejas; estos incluyen al tomar muestras y analizar las muestras de olor^3.

En el Rosalind Franklin Science Center de la Universidad de Wolverhampton, estamos llevando a cabo el análisis de olores y marcas de olor para comprender cómo pueden ser utilizados por los animales. Combinamos la semioquímica con la ecología del comportamiento, la endocrinología y la citología para mejorar nuestra comprensión del papel que desempeñan las señales olfativas en la comunicación animal.

Hemos desarrollado una metodología y luego analizado olores y marcas de una variedad de especies, incluidos varios primates no humanos (es decir, lémures coronados, lémures de volantes rojos, macacos japoneses, babuinos olivares, chimpancés) y otros mamíferos (es decir, gatos, vacas). Hemos recogido y analizado una variedad de muestras, incluyendo orina, heces, cabello y secreciones de olor de glándulas olfativas. Estos olores y marcas de olor consisten en mezclas complejas de compuestos y, por lo tanto, cualquier metodología utilizada para su análisis debe incluir alguna forma de técnica de separación. Como se ilustra, también se producen en una serie de matrices que requiere el uso de técnicas para extraer los componentes de interés.

Estudios previos de Vaglio et al.⁴ y otros autores⁵ utilizaron la extracción dinámica del espacio de cabeza (DHS) con cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS), mientras que la extracción directa con disolvente⁶ y las extracciones complejas^{con disolventes 7} también se han utilizado. En particular, el muestreo dinámico del espacio de cabeza implica purgar el espacio de cabeza con un volumen conocido de gas inerte que, en última instancia, elimina todos los compuestos volátiles con la excepción de aquellos que muestran una fuerte afinidad por la matriz de la muestra (por ejemplo, compuestos polares en muestras acuosas).

Para la metodología actual, hemos adoptado la técnica de microextracción en fase sólida del espacio de la cabeza (HS-SPME) junto con GC-MS. En particular, hemos desarrollado y mejorado la metodología ya utilizada por Vaglio et al. en su anterior laboratorio GC-MS^8,9,10.

Las técnicas de extracción sin solventes son muy efectivas para analizar compuestos pequeños y altamente volátiles (que de lo contrario se pueden perder fácilmente de una muestra) porque estos métodos inmovilizan los compuestos en un soporte de fase estable y sólido. El HS-SPME utiliza una fibra recubierta con un polímero adsorbente para capturar compuestos volátiles en el espacio de la cabeza de la muestra o para extraer compuestos disueltos por inmersión en un fluido biológico acuoso¹¹. La capa del polímero no ata los compuestos fuertemente, por lo tanto calentando en el puerto de la inyección de la CROMATOGRAFÍA GASEOSA pueden ser quitados. Este método es más potente que las técnicas de extracción con disolventes y también más eficaz que el DHS.

En el enfoque actual, las muestras están contenidas dentro de viales de vidrio. Estos viales se calientan a una temperatura de 40 °C para simular la temperatura corporal del animal con el fin de promover que los componentes volátiles de la marca de olor ocupen el espacio de la cabeza del vial. Una fibra SPME, recubierta con 65 μm de material sorbente de polidimetilsiloxano/divinilbenceno (PDMS/DVB), se expone al entorno del espacio de la cabeza y los componentes volátiles de la muestra se adsorben en la fibra. Al calentar la fibra en el puerto de entrada de un GC-MS, los componentes volátiles se desorben de la fibra y luego se separan por el GC. Los patrones de fragmentación espectral de masa se obtienen para cada componente utilizando la EM. Mediante la comparación de estos espectros de masas con las bases de datos espectrales de masas, puede ser posible identificar tentativamente los componentes de la marca de olor. A través del uso de un auto-muestreador, somos capaces de analizar múltiples muestras en lotes de una manera consistente.

Dado que cada tipo de fibra SPME tiene una afinidad diferente con los productos químicos polares, la fibra generalmente se elige dependiendo de la polaridad y / o peso molecular de los compuestos químicos objetivo. Además, las condiciones de GC se cambian dependiendo del tipo de columna gc y las características de los compuestos químicos objetivo.

Esta técnica permite el análisis semicuantitativo de los componentes volátiles de las marcas de olores al permitir la separación e identificación tentativa de los componentes en la muestra, seguida del análisis de las relaciones de área de pico para buscar tendencias que podrían significar componentes de la marca de olores que pueden estar involucrados en la señalización.

Los puntos fuertes clave de este enfoque actual son:

• El rango de tipos de muestra que se pueden analizar.
• No se requiere preparación de muestras complejas ni extracciones.
• La capacidad de analizar componentes volátiles.
• La capacidad de separar los componentes de una mezcla.
• Poder identificar los componentes detectados.
• La capacidad de proporcionar información semicuantitativa y potencialmente cuantitativa sobre los componentes detectados.

Protocolo

1. Recogida de muestras

1. Olores de muestra que son uno de los siguientes:
   1. Recolectar liberadas espontáneamente por sujetos de estudio habituados (por ejemplo, primates de zoológicos) a través de la marca de olores en papel de filtro estéril (por ejemplo, secreciones de olor de glándulas olfativas) o directamente en viales (por ejemplo, orina).
   2. Recoger frotando hisopos de algodón estériles después de la formación de los sujetos de estudio mediante el uso de entrenamiento de refuerzo positivo.
   3. Recoger frotando hisopos de algodón estériles después de la sedación de los sujetos de estudio.
2. Coloque las muestras en viales estériles de vidrio transparente taponados con tapa de tornillo de 10 ml y selle con tapas rematadas con tornillo que incorporen septos FTFE / silicona. Guárdelos inmediatamente a -20 °C.
   NOTA: Es vital usar equipos de protección personal limpios, como guantes de nitrilo; cambiarlos con frecuencia; evitar el contacto directo de la piel con muestras y viales. Se prefiere utilizar viales nuevos; sin embargo, en el caso de viales usados, es vital pre-limpiar los viales, y luego usar el mismo protocolo.
3. Tome espacios en blanco ambientales cada vez que se recogen marcas de olor. Por ejemplo, recopile los medios de muestreo (por ejemplo, papel de filtro o hisopo) y un vial de espacio de cabeza que están expuestos al medio ambiente mientras se realiza el muestreo.

2. Preparación de la muestra

1. Prepare las muestras en el campo cortando con una cuchilla un cuadrado aproximado de 10 milímetros de un papel de filtro olor-marcado, o la cabeza del hisopo, y colocándolo en un frasco tornillo-atornillado-tapado del espacio de la cabeza.
2. Después de que cada muestra haya sido preparada, deseche o limpie la cuchilla utilizada para cortar el medio de muestreo utilizando una toallita antibacteriana apropiada y/o alcohol y séquela bien.
3. Almacene todas las muestras a -20 °C.
   NOTA: Se prefiere a -20 °C o de lo contrario tan bajo como sea posible en la práctica en el campo.

3. Preparación para el análisis

1. Retire las muestras del congelador y deje que se calienten naturalmente a temperatura ambiente durante al menos 1 h.
2. Configure el método analítico en el GC-MS de la siguiente manera:
   1. Para las condiciones de análisis de SPME, siga las instrucciones del fabricante para acondicionar las fibras SPME antes del primer uso: pre-condición de la fibra (260 °C durante 5 min), incubación de la muestra (40 °C durante 2 min), tiempo de extracción (15 min), tiempo de desorción (2 min) y post-condición de la fibra (260 °C durante 20 min).
   2. Utilice las siguientes condiciones de GC: columna (HP5-MS 30 m x 0,25 mm; 0,25 μm), temperatura del inyector (270 °C), caudal (1 mL/min), modo de inyección (sin división), perfil de horno GC (45 °C durante 2 min; 4 °C/min a 170 °C; 20 °C/min a 300 °C), línea de transferencia MSD (280 °C).
      Nota : para mejorar entre la coherencia de tiempo de retención de la muestra el método analítico es el tiempo de retención bloqueado).
   3. Utilice las siguientes condiciones msd: retardo del disolvente (2,5 min) y rango de exploración (29 a 400 amu).
      NOTA: En^protocolosanteriores se utilizó un rango de 10 a 400.
3. Asegúrese de que el suministro de gas de purga a la unidad de acondicionamiento de fibra esté encendido.
   NOTA: Es vital que el conjunto SPME esté instalado correctamente en el muestreador automático y que esté alineado con las bandejas del muestreador automático, la unidad de acondicionamiento de fibra y el puerto de entrada GC. La alineación incorrecta podría resultar en daños o destrucción de la fibra SPME.

4. Análisis

1. Coloque un vial vacío en el espacio de la cabeza (para que actúe como un sistema en blanco) en la primera posición de la bandeja del muestreador automático GC-MS. Coloque el espacio en blanco del ambiente en la segunda posición de la bandeja del muestreador automático. Coloque las muestras para su análisis en las posiciones posteriores de la bandeja de muestra automática.
2. Cree una secuencia analítica para analizar cada muestra dentro de la bandeja de muestras.
   1. En la pantalla de inicio de MassHunter, seleccione Sequence | Secuencia de carga.
   2. Complete la tabla de secuencias para todos los espacios en blanco y muestras insertando la información adecuada. Guarde la tabla de secuencia completada.
      Nota : la información exacta de la tabla de secuencia dependerá de los laboratorios de formato para la tabla. La información mínima normalmente incluiría el tipo de muestra, el nombre de la muestra, la ubicación y el número del vial, el método analítico y la ubicación y el nombre del archivo de datos (la asignación de un nombre de archivo de datos que coincida con el nombre de la muestra ayuda al procesamiento de datos futuro). Se pueden agregar muestras adicionales a la secuencia durante el análisis.
3. Ejecute la secuencia seleccionando Secuencia | Secuencia de ejecución.
4. Después del análisis, devuelva las muestras al congelador lo antes posible.
   NOTA: puede ser posible volver a analizar las muestras, pero debe tenerse en cuenta que algunos componentes volátiles pueden haber sido totalmente extraídos durante el análisis inicial y algunos compuestos pueden haber sufrido descomposición térmica y bacteriana a 40 °C, por lo que el cromatograma resultante puede no ser completamente representativo del marcado de olor original.

5. Análisis de datos

NOTA: El análisis inicial de los datos incluye la integración de cromatogramas para obtener datos de tiempo de retención y área de pico junto con la identificación tentativa de picos utilizando el software ChemStation y las bases de datos espectrales de masas NIST (Instituto Nacional de Estándares y Tecnología), versión MSD F.01.01.2317. El análisis de datos se puede llevar a cabo manualmente o a través de un método semiautomatizado. Si se utiliza el método semiautomatizado, a veces es beneficioso realizar un grado de análisis manual de datos para verificar las identificaciones tentativas.

1. Abra el archivo de datos haciendo clic en el archivo apropiado en la barra de navegación de la izquierda. El cromatograma iónico total (TIC) se mostrará en la ventana superior de la pantalla de análisis de datos.
2. Para integrar las TIC mediante el integrador RTE, seleccione Cromatograma | Integrar.
3. Ajuste los parámetros de integración para que se integren los picos que son mayores que 3 x ruido de línea de base. Seleccione | cromatograma Parámetros de integración de ms signal. En el cuadro de salida, ajuste el área de pico mínima según corresponda (1.0 produce resultados aceptables en nuestros ejemplos).
4. Para identificar picos y generar un informe de resumen, seleccione Exportar informes | Informe de resultados de búsqueda de biblioteca a XLS.
   NOTA: Las bibliotecas espectrales que se buscarán junto con el número de coincidencias de biblioteca que se mostrarán deben estar preestablecidas dentro del software antes de que se pueda realizar una búsqueda en la biblioteca.
5. El informe de hoja de cálculo resultante contiene datos de integración para cada pico y una coincidencia de biblioteca espectral tentativa para asignar la identidad. Normalmente, la coincidencia calidad de biblioteca/biblioteca debe ser >80 para aceptar la identificación provisional. Guarde la hoja de cálculo.
6. Identifique un pico directamente desde el TIC.
   1. Elija el pico de interés.
   2. Si el pico es pequeño, acerque dibujando un cuadro alrededor del pico manteniendo presionado el botón izquierdo del ratón, estire el cuadro sobre el pico y suéltelo.
   3. Coloque la línea del cursor para que esté en el punto más alto del pico (o justo después).
   4. Haga doble clic en el botón derecho del ratón y el espectro de masa para el pico aparecerá en la ventana inferior de la pantalla de análisis de datos.
   5. Para buscar en la biblioteca espectral, mueva el cursor a cualquier lugar de la ventana espectral y haga doble clic en el botón derecho del ratón. Los resultados de la búsqueda de la biblioteca aparecerán en una nueva ventana.
   6. Para eliminar el ruido de fondo de un espectro de interés, primero haga doble clic en el botón derecho del ratón en el pico en cuestión. A continuación, haga doble clic en el botón derecho del ratón en un área sin picos inmediatamente delante del pico de interés. Seleccione | cromatograma Restar espectros. El espectro restado se mostrará en la ventana inferior de la pantalla de análisis de datos y mostrará '(-)' junto a los datos de SCAN en el encabezado de la ventana.

Resultados

Siguiendo este protocolo, identificamos tentativamente un total de 32 compuestos químicos volátiles a partir del análisis de 14 marcas de olor ano-genitales liberadas espontáneamente en papel de filtro por lémures rojizos(Varecia variegata rubra)y comparamos perfiles de olor con características del señalizador^12. Los compuestos volátiles naturales, tales como hidrocarburos, terpenos, alcoholes del terpeno y cetonas, estaban presentes dentro de estos perfiles e incluyeron los compuestos qu...

Discusión

El uso de muestras de control, tanto los controles ambientales creados en el momento de la recolección de muestras como los espacios en blanco del sistema, son cruciales para la interpretación de las muestras de marcas de olor. Los picos atribuidos al entorno de muestreo o al sistema instrumental deben excluirse de las muestras de marcas de olores para que solo los picos de interés se incluyan en cualquier interpretación. Estos controles también pueden desempeñar un papel en la evaluación y supervisión de la "salud" de l...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Viales de muestreador automático de 10 ml	Agilent	5188-5392	Viales de rosca de 10 ml con
tapones de vial de 18 mm	Agilent	8010-0139	Magnético con tabiques de PTFE/silicona
Muestreador automático	Agilent	GC120 PAL Columna
capilar	Agilent	HP5-MS	30 m x 0,25 mm; 0,25 y micro; m
Software de análisis de datos	Agilent-ChemStation
Cromatógrafo de gases	Agilent	7890B
Septos de entrada	Agilent	5182-3442	Merlin microseal
Detector selectivo de masas	Agilent	5977A Software de
informes		Microsoft-Excel
Biblioteca espectral	NIST	-	Biblioteca espectral de masas NIST/EPA/NIH Programa
búsqueda de bibliotecas espectrales	NIST-MS		Search v.2.2
Liner de entrada sin división	Agilent	5190-4048
Fibras SPME	Agilent	SU57345U	65 µ m Fibra PDMS/DVB

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