Caracterización de la diferenciación in vitro de los queratinocitos primarios humanos por análisis de ARN-Seq

Jos G.A. Smits; Jieqiong Qu; Hanna Niehues; Huiqing Zhou

doi:10.3791/60905

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Artículo de método

Caracterización de la diferenciación in vitro de los queratinocitos primarios humanos por análisis de ARN-Seq

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DOI:

10.3791/60905

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16 de mayo de 2020

Jos G.A. Smits^*¹ , Jieqiong Qu^*¹ , Hanna Niehues² , Huiqing Zhou¹^,³

¹Department of Molecular Developmental Biology, Faculty of Science, Radboud Institute for Molecular Life Sciences, Radboud University, Nijmegen, The Netherlands, ²Department of Dermatology, Radboud University Medical Center, Radboud Institute for Molecular Life Sciences, Nijmegen, The Netherlands, ³Department of Human Genetics, Radboud University Medical Center, Nijmegen, The Netherlands

^* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Aquí se presenta un procedimiento escalonado para la diferenciación in vitro de queratinocitos primarios humanos por inhibición del contacto seguido de caracterización a nivel molecular por el análisis de ARN-seq.

Resumen

Los queratinocitos primarios humanos se utilizan a menudo como modelos in vitro para estudios sobre la diferenciación epidérmica y enfermedades relacionadas. Se han notificado métodos para la diferenciación in vitro de queratinocitos cultivados en formas sumergidas bidimensionales (2D) utilizando diversas condiciones de inducción. Aquí se describe un procedimiento para el método de diferenciación de queratinocitos in vitro 2D por inhibición del contacto y posterior caracterización molecular por ARN-seq. En resumen, los queratinocitos se cultivan en medio de queratinocitos definidos complementados con factores de crecimiento hasta que son totalmente confluentes. La diferenciación es inducida por contactos estrechos entre los queratinocitos y se estimula aún más excluyendo los factores de crecimiento en el medio. Utilizando análisis de ARN-seq, se muestra que ambos 1) queratinocitos diferenciados exhiben firmas moleculares distintas durante la diferenciación y 2) el patrón de expresión génica dinámica se asemeja en gran medida a las células durante la estratificación epidérmica. En cuanto a la comparación con la diferenciación normal de queratinocitos, los queratinocitos portadores de mutaciones del factor de transcripción p63 exhiben morfología alterada y firmas moleculares, consistentes con sus defectos de diferenciación. En conclusión, este protocolo detalla los pasos para la diferenciación de queratinocitos in vitro 2D y su caracterización molecular, con énfasis en el análisis bioinformático de los datos de ARN-seq. Debido a que la extracción de ARN y los procedimientos de ARN-seq han sido bien documentados, no es el foco de este protocolo. El procedimiento experimental de diferenciación in vitro de queratinocitos y tubería de análisis bioinformático se puede utilizar para estudiar eventos moleculares durante la diferenciación epidérmica en queratinocitos sanos y enfermos.

Introducción

Los queratinocitos primarios humanos derivados de la piel humana se utilizan a menudo como modelo celular para estudiar la biología de la epidermis¹^,²^,³^,⁴. La estratificación de la epidermis se puede modelar por diferenciación de queratinocitos, ya sea en una moda monocapa sumergida 2D o 3D aire-lift modelo organotípico²^,³^,⁵^,⁶^,⁷. Aunque los modelos 3D se han vuelto cada vez más im....