En el presente protocolo, explicamos cómo procesar y cultivar fácilmente células mononucleares amídricas de seres humanos sanos sometidos a amigdalectomía quirúrgica parcial para estudiar las respuestas inmunitarias innatas tras la activación, imitando la infección viral en los tejidos de la mucosa.
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Artículo de método
Aislamiento de células mononucleares tonitarias para estudiar las respuestas inmunitarias innatas ex vivo en un tejido linfático mucoso humano
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En este artículo
Resumen
Resumen
El estudio de las células aisladas de los tejidos linfoide asociados a la mucosa (MALT) permite comprender la respuesta de las células inmunitarias en patologías que implican inmunidad a la mucosa, ya que pueden modelar interacciones huésped-patógeno en el tejido. Mientras que las células aisladas derivadas de los tejidos fueron el primer modelo de cultivo celular, su uso se ha descuidado porque el tejido puede ser difícil de obtener. En el presente protocolo, explicamos cómo procesar y cultivar fácilmente células mononucleares amiglares (TMC) a partir de amígdalas humanas sanas para estudiar las respuestas inmunitarias innatas tras la activación, imitando la infección viral en los tejidos de la mucosa. El aislamiento de los TMC de las amígdalas es rápido, porque las amígdalas apenas tienen epitelio y producen hasta miles de millones de todos los principales tipos de células inmunitarias. Este método permite la detección de la producción de citoquinas utilizando varias técnicas, incluyendo inmunoensayos, qPCR, microscopía, citometría de flujo, etc., similar al uso de células mononucleares periféricas (PBMC) de la sangre. Además, los TMC muestran una mayor sensibilidad a las pruebas de drogas que los PBMC, que deben ser considerados para futuros ensayos de toxicidad. Por lo tanto, las culturas de TMCs ex vivo son un modelo mucoso fácil y accesible.
Introducción
Los estudios sobre órganos humanos están restringidos debido a la accesibilidad, así como razones éticas obvias. Sin embargo, son esenciales para comprender plenamente la complejidad de la biología humana. Los cultivos de células aisladas (cultivos primarios o líneas celulares) son un sistema estándar en los estudios de biología celular debido a su disponibilidad. Si bien los cultivos celulares aislados han permitido descubrimientos sobresalientes, el uso de líneas celulares se ha visto un mayor escrutinio porque no imitan completamente la biología de órganos in vivo. Sin embargo, el cultivo de células tridimensionales o explantes de tejidos es altamente complejo
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Protocolo
Los especímenes no se recogen específicamente con fines de investigación y el estudio no se considera invasivo. Sin embargo, la recolección de amígdalas humanas requiere la aprobación ética de las autoridades locales pertinentes. En nuestro caso, fue aprobado por el Comité de Protección de las Personas (IDRCB/EUDRACT: 2018A0135847). Además, se solicita el consentimiento de cada paciente o representante legal para obtener los datos personales de los donantes (por ejemplo, sexo, edad, antecedentes de infecciones de oto sexual) que puedan ayudar a interpretar los resultados experimentales.
1. Manejo del tejido toniglar humano
- Poner l....
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Resultados
Primero caracterizamos el perfil inmune de las células presentes en el cultivo y analizamos la cantidad de TMC. Hemos fenotipado los TMC de amígdalas con citometría de flujo. Como se muestra en la Figura 1,todos los principales tipos de células inmunitarias presentes en los PBMC a partir de sangre fueron representan en los TMC de las amígdalas. Sin embargo, en los TMC la frecuencia de todos los tipos de células, excepto las células B, era menor que en los PBM.......
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Discusión
Las amígdalas humanas representan un modelo integrador y fisiológico ex vivo para estudiar las respuestas inmunitarias innatas en la interfaz mucosa, porque imitan el papel de un órgano linfoide secundario. Curiosamente, la composición celular de los TMC es similar a las PBMC e incluye todas las principales poblaciones celulares, aunque su porcentaje puede ser diferente de los PBMC de la sangre (Figura 1). También se pueden encontrar poblaciones adicionales, ya que todas las respuestas inmun.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por la Agence National de la Recherche sur le SIDA et les Hépatites ANRS (J-P. H) para los experimentos y la beca N.B. (AAP 2017 166). N.S. reconoce el apoyo de la ANRS para la beca (AAP 2016 1), la Organización Europea de Biología Molecular EMBO for Fellowship (LT 834 2017), el programa de financiación de startups "Baustein" de la Facultad de Medicina de la Universidad de Ulm (LSBN.0147) y el Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG (SM 544/1 1).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Rejilla de acero de 10 mallas - 1910 y micro; m | Dutscher 198586 | Para poner en el filtro de celdas Cellector | |
| 60 mallas rejilla de acero - 230 µ m | Dutscher | 198591 | Para poner en el filtro de células Cellector |
| 70 µ m blanco Filtros de celdas ClearLine | Dutscher | 141379C | |
| Anios Excell D detergente | Dutscher | 59852 | |
| Solución antibiótica detergente, 100x | Thermo Fisher | 15140122 | 100 U/mL Penicilium y 100 μ g/mL de estreptomicina - para añadir a los medios de cultivo |
| BD FalconTM Tubos de fondo redondo, 5 mL | BD Biosciences | 352063 | FACS Tubos Filtro de |
| células Cellector, 85 mL y 37 mm de diámetro | Dutscher | 198585 | |
| CellTiter-Glo (CTG) Ensayo de viabilidad de células luminiscentes | Promega | G7572 | |
| Centrífuga 5810 R | Eppendorf | ||
| Tubos cónicos Falcon 50 mL | Dutscher | 352070 | |
| Pinzas curvas | Dutscher | 711200 | |
| Dimetilsulfóxido (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | Sin calcio y magnesio |
| EnVision | PerkinElmer | Mide la luminiscencia | |
| Suero fetal bovino (FBS) | Para añadir a los medios de cultivo | ||
| Marcadores de fluorescencia anticuerpos | Ver Tabla 1 | ||
| Mortero de vidrio | Dutscher | 198599 | |
| Hepes (1 M) | Thermo Fisher | 15630056 | uso en incubadora |
| mM | |||
| Panel de respuesta antivirus humano LEGENDplex BioLegend | 740390 | Inmunoensayo basado en perlas | |
| Lymphoprep | StemCell | 7801 | Medio de gradiente de densidad |
| Mr. Contenedor escarchado | Thermo Fisher | 5100-0001 | Contenedor de congelación lenta |
| Pierce 16% Formaldehído (p/v), sin metanol | Thermo Fisher | 28908 | |
| Resiquimod (R848) | InvivoGen | tlrl-r848 | TLR7/8 agonista |
| RPMI-1640 Medio | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| SPL Placa de cultivo celular, 150 mm x 25 mm (SPL150) | Dutscher | 330009 | |
| Cuchilla quirúrgica estéril N° 23 | Dutscher | 132523 | |
| UltraComp eBeads Perlas de compensación | Thermo Fisher | 01-2222-41 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 Para hacer tampón de lavado en PBS |
Referencias
- Taylor, M. W. A History of Cell Culture. Viruses and Man: A History of Interactions. , 41-52 (2014).
- Scherer, W. F., Syverton, J. T., Gey, G. O.
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Reimpresiones y permisos
