En el presente protocolo, explicamos cómo procesar y cultivar fácilmente células mononucleares amídricas de seres humanos sanos sometidos a amigdalectomía quirúrgica parcial para estudiar las respuestas inmunitarias innatas tras la activación, imitando la infección viral en los tejidos de la mucosa.
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Artículo de método
Aislamiento de células mononucleares tonitarias para estudiar las respuestas inmunitarias innatas ex vivo en un tejido linfático mucoso humano
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Resumen
Resumen
El estudio de las células aisladas de los tejidos linfoide asociados a la mucosa (MALT) permite comprender la respuesta de las células inmunitarias en patologías que implican inmunidad a la mucosa, ya que pueden modelar interacciones huésped-patógeno en el tejido. Mientras que las células aisladas derivadas de los tejidos fueron el primer modelo de cultivo celular, su uso se ha descuidado porque el tejido puede ser difícil de obtener. En el presente protocolo, explicamos cómo procesar y cultivar fácilmente células mononucleares amiglares (TMC) a partir de amígdalas humanas sanas para estudiar las respuestas inmunitarias innatas tras la activación, imitando la infección viral en los tejidos de la mucosa. El aislamiento de los TMC de las amígdalas es rápido, porque las amígdalas apenas tienen epitelio y producen hasta miles de millones de todos los principales tipos de células inmunitarias. Este método permite la detección de la producción de citoquinas utilizando varias técnicas, incluyendo inmunoensayos, qPCR, microscopía, citometría de flujo, etc., similar al uso de células mononucleares periféricas (PBMC) de la sangre. Además, los TMC muestran una mayor sensibilidad a las pruebas de drogas que los PBMC, que deben ser considerados para futuros ensayos de toxicidad. Por lo tanto, las culturas de TMCs ex vivo son un modelo mucoso fácil y accesible.
Introducción
Los estudios sobre órganos humanos están restringidos debido a la accesibilidad, así como razones éticas obvias. Sin embargo, son esenciales para comprender plenamente la complejidad de la biología humana. Los cultivos de células aisladas (cultivos primarios o líneas celulares) son un sistema estándar en los estudios de biología celular debido a su disponibilidad. Si bien los cultivos celulares aislados han permitido descubrimientos sobresalientes, el uso de líneas celulares se ha visto un mayor escrutinio porque no imitan completamente la biología de órganos in vivo. Sin embargo, el cultivo de células tridimensionales o explantes de tejidos es altamente complejo4,,5,,6. De hecho, un pedazo de tejido u órgano es altamente heterogéneo porque su composición celular difiere dependiendo de la localización en el tejido. Por lo tanto, el uso de bloques de tejido requiere el análisis de muchas réplicas técnicas y biológicas, lo que lleva a la necesidad de un gran número de donantes o pacientes.
Los tejidos linfoides asociados a la mucosa (MALT) son estructuralmente similares a los ganglios linfáticos pero tienen funciones únicas, porque su función principal es regular la inmunidad a la mucosa7. A diferencia de los ganglios linfáticos, que generalmente se encuentran a cierta distancia de los tejidos, el MALT generalmente se encuentra inmediatamente debajo del epitelio del tejido mucoso. Histológicamente, se componen principalmente de altas concentraciones de células B y T, pero también células que presentan antígenos como macrófagos y células dendríticas. MalT constituyen alrededor del 50% del tejido linfoide en el cuerpo humano. MALT se subdivide en nueve grupos dependiendo de su ubicación: GALT (gut-), BALT (bronchus-), NALT (nasal-), CALT (conjuntival), LALT (laringe-), SALT (piel-), VALT (vulvo-), O-MALT (organizado) y D-MALT (difuso). El O-MALT se compone principalmente de las amígdalas del anillo amigdal de Waldeyer y es el MALT8,,9. De hecho, las amígdalas ubicadas en la orofaringe constituyen la principal barrera que protege las vías digestivas y respiratorias de los microorganismos (potenciales) invasivos10. Además, las amígdalas están cubiertas por un epítelio escamoso estratificado fino no queratinizante, apoyado por una cápsula de tejido conectivo que contiene vasos sanguíneos, nervios y linfáticos, proporcionando un fácil acceso a las células inmunitarias11,12. Además, la amigdalectomía, el acto quirúrgico de extirpar amígdalas, es un procedimiento común realizado en niños con respiración desordenada del sueño, haciendo de las amígdalas un tejido fácilmente disponible13 en entornos fisiológicos.
Las amígdalas permiten el estudio de la respuesta de las células inmunitarias en patologías que implican inmunidad a la mucosa. De hecho, en la infección por el VIH, debido a que las amígdalas se componen de una alta concentración de células inmunitarias, son el principal objetivo de replicación viral, pero también producen una gran cantidad de citoquinas que no se detectan en la circulación14,,15. En estados estables, poblaciones raras de células innatas están presentes en varios tejidos mucosos, incluyendo las amígdalas, pero están esencialmente ausentes de la sangre.
Por lo tanto, las células mononucleares de las amígdalas (TMC) son un modelo más relevante y complejo que los PBMC y pueden responder a preguntas más profundas. Por otro lado, el uso de tejidos explantes puede ser complejo y no siempre relevante para los estudios inmunes innatos. Así, establecimos un modelo para estudiar la activación inmune de la mucosa utilizando LOS TMC16. Aquí, describimos un método para el aislamiento eficiente de los TMC de las amígdalas humanas frescas. Este método permite la recuperación de un gran número de células inmunitarias manteniendo su integridad para estudios ex vivos.
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Protocolo
Los especímenes no se recogen específicamente con fines de investigación y el estudio no se considera invasivo. Sin embargo, la recolección de amígdalas humanas requiere la aprobación ética de las autoridades locales pertinentes. En nuestro caso, fue aprobado por el Comité de Protección de las Personas (IDRCB/EUDRACT: 2018A0135847). Además, se solicita el consentimiento de cada paciente o representante legal para obtener los datos personales de los donantes (por ejemplo, sexo, edad, antecedentes de infecciones de oto sexual) que puedan ayudar a interpretar los resultados experimentales.
1. Manejo del tejido toniglar humano
- Poner las amígdalas de cada donante en un vial estéril de 50 ml que contenga 25 ml de PBS 1x y transportarlas a temperatura ambiente (RT) al laboratorio de acuerdo con las recomendaciones de la autoridad (utilice tres niveles de protección: viales, una caja de seguridad y una bolsa).
NOTA: Todo el procedimiento debe llevarse a cabo en un laboratorio de nivel de seguridad biológica 2. Todos los especímenes humanos deben manipularse con cuidado, ya que no han sido previamente calificados y pueden contener agentes infecciosos. -
Limpie todas las herramientas entre cada uso.
- Después de su uso, desmonte el colador celular y guárd europeo con todos los demás instrumentos (por ejemplo, pestle, fórceps) en un baño que contenga una solución de detergente (1/10 detergente de volumen en H2O) durante la noche.
- Cepille cada utensilio para extraer el tejido y lave con agua clara.
- Seque bien todas las piezas, luego prepare el colador celular (85 ml, 37 mm de diámetro) colocando una rejilla de acero de malla 60 en la parte superior de una rejilla de acero de malla de 10 y cierre firmemente el anillo.
- Coloque todas las herramientas en bolsas estériles y autoclave.
2. Disección del tejido toniglar humano y aislamiento de las células mononucleares tonúculas (TMC)
- Coloque el colador celular en un plato de cultivo celular de 150 x25 mm 2 (SPL150) y todos los instrumentos en otro SPL150 para mantenerlos estériles.
- Transfiera las amígdalas del vial al colador celular utilizando fórceps estériles. También verter en todo el PBS, que contiene algunas células que han salidado las amígdalas. Si es necesario, agregue más PBS para sumergir la cuadrícula.
NOTA: El tejido debe sumergirse en todo momento para evitar la desicación. - Retire el tejido cauterizado, sangriento y fibroma usando fórceps y un bisturí.
NOTA: Las amígdalas extraídas de los niños no necesitan este paso. - Cortar los tejidos en pequeños trozos de menos de 0,5 cm de diámetro utilizando el bisturí y las pinzas curvas. Corte todo el tejido para que las piezas pequeñas puedan sumergirse en todo momento.
- Coloque algunos trozos de tejido en el colador celular y rasparlos en la rejilla con un pestillo de vidrio hasta que sólo quede una capa muy delgada de estroma blanco. Retire y deseche el estroma para evitar obstruir la rejilla.
- Una vez que todos los tejidos han sido exprimidos a través de la rejilla, utilice una pipeta de 10 ml para transferir toda la suspensión celular a la rejilla y raspar una última vez.
- Transfiera la suspensión celular con una pipeta de 10 ml en un vial estéril. Lave la rejilla y el colador celular con PBS 1x. Deje reposar la suspensión de la célula durante 5 minutos en RT en el banco. Este paso permite la precipitación y la aglomeración del estroma sobrante, las células muertas y cualquier ADN liberado, y facilitará el siguiente paso.
- Coloque un tamiz estéril de 70 m encima de un nuevo vial de 50 ml (retirarlo cuidadosamente del sobre) y transferir suavemente la suspensión celular sobre él con una pipeta de 10 ml. No mezcle la suspensión, ya que con frecuencia hay un pellet presente. Si el tamiz está obstruido, utilice la parte posterior de una punta de pipeta estéril de 1 ml para rayar las células a través del tamiz. Cambie el tamiz tantas veces como sea necesario.
- Centrifugar las células a 250 x g durante 10 min a 4oC.
- Deseche el sobrenadante y resusppend el pellet mezclando suavemente el vial, luego resuspender las células en 35 ml de PBS.
- En un vial nuevo, coloque un nuevo tamiz de 70 m en la parte superior y transfiera la suspensión celular sobre él con una pipeta de 10 ml. Si el tamiz está obstruido, utilice la técnica detallada en el paso 2.7.
3. Aislamiento de los TMC por Gradiente de Densidad Celular
NOTA: Los TMC se pueden utilizar después del paso 2.10. Sin embargo, para obtener una solución celular más clara y eliminar otros desechos celulares y cualquier célula roja, se recomienda realizar un aislamiento de gradiente de densidad celular de las células mononucleares.
- Añadir 15 ml del medio de gradiente de densidad (d a 1,076 g/ml) en un nuevo vial de 50 ml. Vierta la solución de TMCs en la parte superior del medio de gradiente de densidad, teniendo cuidado de minimizar la mezcla de la suspensión con el medio de gradiente de densidad.
- Centrifugar la solución a 1.000 x g durante 30 minutos en RT con aceleración y ruptura.
- Retirar con una pipeta de 10 ml y desechar la capa superior (que contiene principalmente PBS 1x) sin alterar la interfaz entre los TMC y el medio de gradiente de densidad.
NOTA: Los TMC contienen un número bajo de eritrocitos, por lo tanto, la solución es clara. Por lo tanto, la interfaz entre la solución de TMCs en PBS y el medio de gradiente de densidad puede ser difícil de visualizar. En consecuencia, las células se pueden resuspendirse en RPMI 1640 complementadas con 20 mM HEPES (sin FBS) antes de que se realice el gradiente de densidad. - Retire los TMC con una punta de pipeta estéril de 1 ml y colóquelos en un nuevo vial de 50 ml.
- Lavar las células añadiendo 50 ml de PBS que contienen 2% de suero bovino fetal (FBS) y 2 mM EDTA y centrifugar el tubo a 250 x g durante 10 min a 4 oC para eliminar las plaquetas restantes.
- Repita el paso 3.5, pero centrifugar el tubo a 400 x g durante 10 min a 4 oC.
- Preparar el medio de cultivo (R10) complementando la RPMI 1640 con FBS inactivado al 10% con calor, 2 mM de L-glutamina y la solución antibiótica (100 U/ml peniciillium y 100 g/mL de estreptomicina).
- Resuspender los TMC en 10 ml de R10 y contar las células. En promedio, esta técnica produce 5 x 108-2 x 109 TCC por par de amígdalas. Las células ahora se pueden utilizar para investigaciones como PBMC a partir de sangre entera (por ejemplo, purificación de tipo celular específico, cultivo celular, citometría de flujo, RT-qPCR, congelación, etc.).
-
Si es necesario, congele las células para su uso posterior utilizando técnicas estándar para la congelación de células primarias.
- Cuente el número de celdas.
- Centrifugar las células y quitar el sobrenadante. Disolver el pellet en suficiente 100% FBS para una concentración final de 1 x 108 células/ ml, a continuación, añadir el mismo volumen de una solución 80% FBS + 20% DMSO. Las celdas estarán entonces en 5 x 107 células/ml. Este paso debe realizarse a 4 oC y la solución FBS y DMSO debe mantenerse a 4 oC antes de su uso.
- Distribuya 1 ml de la solución celular en criotubos y colóquelos en un recipiente de congelación lenta que haya estado a 4 oC durante la noche para controlar la velocidad de congelación celular. Colóquelo a -80oC.
- Para descongelar las células, coloque los crioviales en un baño caliente a 37 oC durante unos segundos con agitación constante. Tan pronto como las células comiencen a descongelarse, transfiérelas a 49 ml de R10 y centrífuga para eliminar el DMSO. Cuente las células y utilícelos como PBMC.
NOTA: Aunque congelar y descongelar los TMC eliminará los desechos, también dañará algunos tipos de células raras. Si hay grumos o escombros después de la descongelación, lo mejor es pasar la suspensión celular a través de un tamiz estéril de 70 m antes de usarlo.
4. Fenotipado de TMCs por citometría de flujo
- Recuperar 5 x 106 células de la solución anterior para cada panel de mezcla de anticuerpos que necesita ser probado y colocar en un tubo de citometría de 5 ml. Recupere 1 x 106 celdas para el control no detenido.
- Lavar las células en PBS y centrífuga a 400 x g durante 5 min a 4 oC. Resuspútelos en 500 oL de PBS (1 x 106 células/ml) e incubar con una mancha de viabilidad durante 30 min a 4oC en la oscuridad.
- Añadir 5 l de calor inactivado suero AB humano por 100 l de suspensión celular e incubar durante 15 min a 4 oC en la oscuridad.
- Lavar las células en PBS + 2% FBS + 2 mM EDTA (Wash Buffer) y centrífuga a 400 x g durante 5 min a 4 oC.
- Resuspender los TMC en 500 l de tampón de lavado que contenga los anticuerpos como se detalla en la Tabla 1. Incubar las células durante 30 min a 4oC en la oscuridad.
- Lavar las células en Wash Buffer y centrífuga a 400 x g durante 5 min a 4oC. Resuspender los TMC en 500 l de PBS que contienen 0.5% de paraformaldehído (PFA). Mantener en la oscuridad a 4 oC hasta la adquisición por citometría de flujo.
NOTA: PFA es peligroso. Utilice una solución comercial lista para usar para preparar la solución PFA del 0,5%.
| Anticuerpo | Clon | Fluorocromo | Empresa |
| Live-Dead | BV405 | ThermoFisher Scientific | |
| CD3 | SP34-2 | V500 | BD Pharmingen |
| CD8 | SK1 | Amcyan | BD Pharmingen |
| CD8 | BW135/80 | VioBlue | Miltenyi Biotec |
| CD4 | RPA-T4 | PE-Cy7 | BD Pharmingen |
| CD45 | HI30 | PerCP-cy5.5 | Bd |
| CD19 | HD237 | Ecd | Beckman Coulter |
| CD20 | 2H7 | Alexa Fluor 700 | BD Pharmingen |
| CD14 | M5E2 | PE-cy7 | BD Pharmingen |
| CD14 | M5E2 | Apc | BD Pharmingen |
| CD16 | 3G8 | APC-H7 | BD Pharmingen |
| CD56 | MEM188 | Pe | BD Pharmingen |
| CD123 | 7G3 | Pe | BD Pharmingen |
| BDCA-1 | L161 | Pacific Blue | BD Pharmingen |
| BDCA-3 | AD5-14H12 | Fitc | Miltenyi Biotec |
| BDCA-4 | AD5-17F6 | Apc | Miltenyi Biotec |
| HLA-DR | G646-6 | PerCP-cy5.5 | BD Pharmingen |
| CD11c | 3.9 | Alexa Fluor 700 | ebiociencias |
Tabla 1: Lista de anticuerpos para la caracterización celular por citometría de flujo.
5. Ejemplo de activación de los TMC y medición de la producción de citoquinas
- Diluir los TMC en el medio R10 para obtener una concentración de 2 x 106 células/ml.
- Distribuya 400.000 TMC en 200 l de R10 en una placa inferior redonda de 96 pozos.
- Para activar las células, agregue 5 g/ml del resiquimod agonista TLR7/8 (R848) durante la noche.
- Centrifugar las placas y recuperar el sobrenadante de los TMC y congelarlo para su posterior análisis. La producción de citoquinas se evaluará utilizando inmunoensayos basados en cuentas para cuantificar múltiples citoquinas solubles simultáneamente utilizando un citometro de flujo siguiendo el protocolo del fabricante.
- Evaluar la viabilidad de las células utilizando un ensayo de viabilidad celular luminiscente siguiendo el protocolo del fabricante. En resumen, añada 60 l de solución de viabilidad celular a los pocillos y mida la luminiscencia en un plazo de 10 min (adquisición durante 1 s/pozo).
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Resultados
Primero caracterizamos el perfil inmune de las células presentes en el cultivo y analizamos la cantidad de TMC. Hemos fenotipado los TMC de amígdalas con citometría de flujo. Como se muestra en la Figura 1,todos los principales tipos de células inmunitarias presentes en los PBMC a partir de sangre fueron representan en los TMC de las amígdalas. Sin embargo, en los TMC la frecuencia de todos los tipos de células, excepto las células B, era menor que en los PBM...
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Discusión
Las amígdalas humanas representan un modelo integrador y fisiológico ex vivo para estudiar las respuestas inmunitarias innatas en la interfaz mucosa, porque imitan el papel de un órgano linfoide secundario. Curiosamente, la composición celular de los TMC es similar a las PBMC e incluye todas las principales poblaciones celulares, aunque su porcentaje puede ser diferente de los PBMC de la sangre (Figura 1). También se pueden encontrar poblaciones adicionales, ya que todas las respuestas inmun...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por la Agence National de la Recherche sur le SIDA et les Hépatites ANRS (J-P. H) para los experimentos y la beca N.B. (AAP 2017 166). N.S. reconoce el apoyo de la ANRS para la beca (AAP 2016 1), la Organización Europea de Biología Molecular EMBO for Fellowship (LT 834 2017), el programa de financiación de startups "Baustein" de la Facultad de Medicina de la Universidad de Ulm (LSBN.0147) y el Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG (SM 544/1 1).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Rejilla de acero de 10 mallas - 1910 y micro; m | Dutscher 198586 | Para poner en el filtro de celdas Cellector | |
| 60 mallas rejilla de acero - 230 µ m | Dutscher | 198591 | Para poner en el filtro de células Cellector |
| 70 µ m blanco Filtros de celdas ClearLine | Dutscher | 141379C | |
| Anios Excell D detergente | Dutscher | 59852 | |
| Solución antibiótica detergente, 100x | Thermo Fisher | 15140122 | 100 U/mL Penicilium y 100 μ g/mL de estreptomicina - para añadir a los medios de cultivo |
| BD FalconTM Tubos de fondo redondo, 5 mL | BD Biosciences | 352063 | FACS Tubos Filtro de |
| células Cellector, 85 mL y 37 mm de diámetro | Dutscher | 198585 | |
| CellTiter-Glo (CTG) Ensayo de viabilidad de células luminiscentes | Promega | G7572 | |
| Centrífuga 5810 R | Eppendorf | ||
| Tubos cónicos Falcon 50 mL | Dutscher | 352070 | |
| Pinzas curvas | Dutscher | 711200 | |
| Dimetilsulfóxido (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | Sin calcio y magnesio |
| EnVision | PerkinElmer | Mide la luminiscencia | |
| Suero fetal bovino (FBS) | Para añadir a los medios de cultivo | ||
| Marcadores de fluorescencia anticuerpos | Ver Tabla 1 | ||
| Mortero de vidrio | Dutscher | 198599 | |
| Hepes (1 M) | Thermo Fisher | 15630056 | uso en incubadora |
| mM | |||
| Panel de respuesta antivirus humano LEGENDplex BioLegend | 740390 | Inmunoensayo basado en perlas | |
| Lymphoprep | StemCell | 7801 | Medio de gradiente de densidad |
| Mr. Contenedor escarchado | Thermo Fisher | 5100-0001 | Contenedor de congelación lenta |
| Pierce 16% Formaldehído (p/v), sin metanol | Thermo Fisher | 28908 | |
| Resiquimod (R848) | InvivoGen | tlrl-r848 | TLR7/8 agonista |
| RPMI-1640 Medio | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| SPL Placa de cultivo celular, 150 mm x 25 mm (SPL150) | Dutscher | 330009 | |
| Cuchilla quirúrgica estéril N° 23 | Dutscher | 132523 | |
| UltraComp eBeads Perlas de compensación | Thermo Fisher | 01-2222-41 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 Para hacer tampón de lavado en PBS |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
