Artículo de método

Análisis de defectos cardíacos congénitos en embriones de ratón utilizando métodos histológicos cualitativos y cuantitativos

DOI:

10.3791/60926

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10 de marzo de 2020

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1Department of Biomedical Engineering, Michigan State University, 2Institute for Quantitative Health Sciences and Engineering, Michigan State University

En este artículo

Resumen

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En este protocolo, describimos procedimientos para analizar cualitativa y cuantitativamente fenotipos del desarrollo en ratones asociados con defectos cardíacos congénitos.

Resumen

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Los defectos cardíacos congénitos (CHD) son el tipo más común de defecto congénito en los seres humanos, afectando hasta el 1% de todos los nacimientos vivos. Sin embargo, las causas subyacentes de la ENFERMEDAD de Haya todavía se entienden mal. El ratón en desarrollo constituye un modelo valioso para el estudio de la CHD, ya que los programas de desarrollo cardíaco entre ratones y humanos están altamente conservados. El protocolo describe en detalle cómo producir embriones de ratón de la etapa gestacional deseada, métodos para aislar y preservar el corazón para el procesamiento posterior, métodos cuantitativos para identificar tipos comunes de CHD por histología (por ejemplo, septal ventricular defectos, defectos interauriculares, conducto arterial patentado) y métodos cuantitativos de histomorfometría para medir fenotipos comunes de compactación muscular. Estos métodos articulan todos los pasos involucrados en la preparación, recolección y análisis de muestras, permitiendo a los científicos medir correctamente y reproduciblemente la CHD.

Introducción

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Las CHD son el tipo más común de defecto de nacimiento en humanos y son la principal causa de muertes relacionadas con defectos de nacimiento1,2,3,4,5,6. Aunque alrededor del 90% de los niños recién nacidos sobreviven a la enfermedad coronaria, con frecuencia se asocia con una morbilidad significativa e intervenciones médicas a lo largo de los años, imponiendo una pesada carga sobre la vida de los pacientes y el sistema de salud7,

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Protocolo

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Todos los animales utilizados en los experimentos a los que se hace referencia en este documento fueron tratados utilizando las directrices de cuidado animal del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Estatal de Michigan (IACUC).

1. Acoplamiento cronometrado de ratones C57BL6/J para la producción de embriones

  1. Una vez que los ratones hayan alcanzado la edad reproductiva (6-8 semanas), colóquelos en formato de cría de harem (es decir, dos hembras por cada macho). Plasíquelos para la cría en algún momento de la tarde o de la noche.
    NOTA: Los ratones a menudo se reproducen dentro de 1 h después de que l....

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Resultados

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El índice de compactación muscular se comparó entre corazones que se desarrollaron bajo dos ambientes diferentes, un control y un grupo experimental. Estos protocolos se utilizaron para analizar cuantitativamente la compactación del tejido muscular, lo que permitió el análisis estadístico. Se demostró que la compactación muscular se redujo significativamente en los corazones experimentales en relación con los embriones que se desarrollaron en condiciones no experimentales.

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Discusión

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Este protocolo explora las técnicas involucradas en el análisis del desarrollo cardíaco en corazones embrionarios. Algunas limitaciones de este método son la destreza física requerida para las técnicas preparatorias, que pueden requerir práctica, y habilidad con imágenes de microscopio. Si las rodajas obtenidas en el criostato son desordenadas, la tinción de hematoxilina y eosina no será clara, o si las imágenes tomadas en el microscopio tienen mala iluminación, entonces el método utilizado con ImageJ no funcionará. Una .......

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Divulgaciones

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Los autores no tienen revelaciones que reportar.

Agradecimientos

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El Laboratorio Aguirre es apoyado por el Instituto Nacional del Corazón, Pulmón y Sangre de los Institutos Nacionales de Salud bajo el número de premio K01HL135464 y por la Asociación Americana del Corazón bajo el número de premio 19IPLOI34660342.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Tubo(s) cónico(s) de 15 mlFisherScientific# 1495970C
C57BL/6J RatonesJackson LabsC57BL/6J - stock 000664
Frascos de tinción Coplin (x6)VWR Scientific# 25457-006
cubreobjetos 24X50MM #1.5VWR Scientific# 48393-241
Cryostat - Leica CM3050SLeicaN/A
Plato(s) de disecciónFisherScientific# 50930381
Dumont #5 - Pinzas finas (x2)Fine Science Tools# 11254-20
Eosina Y SolutionMillipore Sigma# HT110116-500ML
Alcohol etílico (puro, 200 grados)Fisher Scientific# BP2818-500
Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)Millipore Sigma# E9884-100G
EukittMillipore Sigma# 03989-100ML
Tijeras FinasFine Science Tools# 14060-10
Microscopio Estereoscópico Fluorescente Leica M165 FCLeicaN/A
GlycineMillipore Sigma# 410225-250G
Pinzas GraefeFine Science Tools# 11052-10
Graphpad Prisma 8 SoftwareGraphpad
ImageJ SoftwareImageJ
KimwipesFisher Scientific# 06666A
Solución de hematoxilina de MayerMillipore Sigma# MHS16-500ML
Punta(s) de micropipeta - p200Fisher Scientific# 02707448
Microsoft Excel SoftwareMicrosoft
OCT CompoundVWR Scientific# 102094-106
Microscopio Olympus CkX53Pinceles Olympus
(al menos 2)
ParaformaldehídoVWR Scientific# 0215014601Convertir en solución al 4% (disuelto en PBS)
Pipeta(s) PasteurFisherScientific# 13-711-7M
Penicilina-estreptomicinaThermoFisher Scientific# 15140122
solución salina tamponada con fosfato (PBS)ThermoFisher Scientific# 70011044Diluir de 10 a 1 veces antes de usar
ScaleMettler Toledo# MS1602TS
ScaleMettler Toledo# MS105
Mango de bisturí #3VWR Scientific# 10161-918
Hojas de bisturíVWR Scientific# 21909-612
Molde cuadradoVWR Scientific# 100500-224Para moldes OCT
SacarosaMillipore Sigma# S9378-500G
Superfrost Plus SlidesFisher Scientific# 1255015
Tijeras quirúrgicasFine Science Tools# 14002-14
Hojas de micrótomo desechables Tissue-Tek Accu-EdgeVWR Scientific# 25608-964
Básculade viaje AcculabVIC 5101
XilenoMillipore Sigma214736-1L

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kathiresan, S., Srivastava, D. Genetics of human cardiovascular disease. Cell. 148 (6), 1242-1257 (2012).
  2. Sun, R., Liu, M., Lu, L., Zheng, Y., Zhang, P. Congenital Heart Disease: Causes, Diagnosis, Symptoms, and Treatments. Cell Biochemistry and Biophysics. 72

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