En este protocolo, describimos procedimientos para analizar cualitativa y cuantitativamente fenotipos del desarrollo en ratones asociados con defectos cardíacos congénitos.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Análisis de defectos cardíacos congénitos en embriones de ratón utilizando métodos histológicos cualitativos y cuantitativos
En este artículo
Resumen
Resumen
Los defectos cardíacos congénitos (CHD) son el tipo más común de defecto congénito en los seres humanos, afectando hasta el 1% de todos los nacimientos vivos. Sin embargo, las causas subyacentes de la ENFERMEDAD de Haya todavía se entienden mal. El ratón en desarrollo constituye un modelo valioso para el estudio de la CHD, ya que los programas de desarrollo cardíaco entre ratones y humanos están altamente conservados. El protocolo describe en detalle cómo producir embriones de ratón de la etapa gestacional deseada, métodos para aislar y preservar el corazón para el procesamiento posterior, métodos cuantitativos para identificar tipos comunes de CHD por histología (por ejemplo, septal ventricular defectos, defectos interauriculares, conducto arterial patentado) y métodos cuantitativos de histomorfometría para medir fenotipos comunes de compactación muscular. Estos métodos articulan todos los pasos involucrados en la preparación, recolección y análisis de muestras, permitiendo a los científicos medir correctamente y reproduciblemente la CHD.
Introducción
Las CHD son el tipo más común de defecto de nacimiento en humanos y son la principal causa de muertes relacionadas con defectos de nacimiento1,2,3,4,5,6. Aunque alrededor del 90% de los niños recién nacidos sobreviven a la enfermedad coronaria, con frecuencia se asocia con una morbilidad significativa e intervenciones médicas a lo largo de los años, imponiendo una pesada carga sobre la vida de los pacientes y el sistema de salud7,
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
Todos los animales utilizados en los experimentos a los que se hace referencia en este documento fueron tratados utilizando las directrices de cuidado animal del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Estatal de Michigan (IACUC).
1. Acoplamiento cronometrado de ratones C57BL6/J para la producción de embriones
- Una vez que los ratones hayan alcanzado la edad reproductiva (6-8 semanas), colóquelos en formato de cría de harem (es decir, dos hembras por cada macho). Plasíquelos para la cría en algún momento de la tarde o de la noche.
NOTA: Los ratones a menudo se reproducen dentro de 1 h después de que l....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
El índice de compactación muscular se comparó entre corazones que se desarrollaron bajo dos ambientes diferentes, un control y un grupo experimental. Estos protocolos se utilizaron para analizar cuantitativamente la compactación del tejido muscular, lo que permitió el análisis estadístico. Se demostró que la compactación muscular se redujo significativamente en los corazones experimentales en relación con los embriones que se desarrollaron en condiciones no experimentales.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Este protocolo explora las técnicas involucradas en el análisis del desarrollo cardíaco en corazones embrionarios. Algunas limitaciones de este método son la destreza física requerida para las técnicas preparatorias, que pueden requerir práctica, y habilidad con imágenes de microscopio. Si las rodajas obtenidas en el criostato son desordenadas, la tinción de hematoxilina y eosina no será clara, o si las imágenes tomadas en el microscopio tienen mala iluminación, entonces el método utilizado con ImageJ no funcionará. Una .......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores no tienen revelaciones que reportar.
Agradecimientos
El Laboratorio Aguirre es apoyado por el Instituto Nacional del Corazón, Pulmón y Sangre de los Institutos Nacionales de Salud bajo el número de premio K01HL135464 y por la Asociación Americana del Corazón bajo el número de premio 19IPLOI34660342.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Tubo(s) cónico(s) de 15 mlFisher | Scientific | # 1495970C | |
| C57BL/6J Ratones | Jackson Labs | C57BL/6J - stock 000664 | |
| Frascos de tinción Coplin (x6) | VWR Scientific | # 25457-006 | |
| cubreobjetos 24X50MM #1.5 | VWR Scientific | # 48393-241 | |
| Cryostat - Leica CM3050S | Leica | N/A | |
| Plato(s) de disecciónFisher | Scientific | # 50930381 | |
| Dumont #5 - Pinzas finas (x2) | Fine Science Tools | # 11254-20 | |
| Eosina Y Solution | Millipore Sigma | # HT110116-500ML | |
| Alcohol etílico (puro, 200 grados) | Fisher Scientific | # BP2818-500 | |
| Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) | Millipore Sigma | # E9884-100G | |
| Eukitt | Millipore Sigma | # 03989-100ML | |
| Tijeras Finas | Fine Science Tools | # 14060-10 | |
| Microscopio Estereoscópico Fluorescente Leica M165 FC | Leica | N/A | |
| Glycine | Millipore Sigma | # 410225-250G | |
| Pinzas Graefe | Fine Science Tools | # 11052-10 | |
| Graphpad Prisma 8 Software | Graphpad | ||
| ImageJ Software | ImageJ | ||
| Kimwipes | Fisher Scientific | # 06666A | |
| Solución de hematoxilina de Mayer | Millipore Sigma | # MHS16-500ML | |
| Punta(s) de micropipeta - p200 | Fisher Scientific | # 02707448 | |
| Microsoft Excel Software | Microsoft | ||
| OCT Compound | VWR Scientific | # 102094-106 | |
| Microscopio Olympus CkX53 | Pinceles Olympus | ||
| (al menos 2) | |||
| Paraformaldehído | VWR Scientific | # 0215014601 | Convertir en solución al 4% (disuelto en PBS) |
| Pipeta(s) PasteurFisher | Scientific | # 13-711-7M | |
| Penicilina-estreptomicina | ThermoFisher Scientific | # 15140122 | |
| solución salina tamponada con fosfato (PBS) | ThermoFisher Scientific | # 70011044 | Diluir de 10 a 1 veces antes de usar |
| Scale | Mettler Toledo | # MS1602TS | |
| Scale | Mettler Toledo | # MS105 | |
| Mango de bisturí #3 | VWR Scientific | # 10161-918 | |
| Hojas de bisturí | VWR Scientific | # 21909-612 | |
| Molde cuadrado | VWR Scientific | # 100500-224 | Para moldes OCT |
| Sacarosa | Millipore Sigma | # S9378-500G | |
| Superfrost Plus Slides | Fisher Scientific | # 1255015 | |
| Tijeras quirúrgicas | Fine Science Tools | # 14002-14 | |
| Hojas de micrótomo desechables Tissue-Tek Accu-Edge | VWR Scientific | # 25608-964 | |
| Báscula | de viaje Acculab | VIC 5101 | |
| Xileno | Millipore Sigma | 214736-1L |
Referencias
- Kathiresan, S., Srivastava, D. Genetics of human cardiovascular disease. Cell. 148 (6), 1242-1257 (2012).
- Sun, R., Liu, M., Lu, L., Zheng, Y., Zhang, P. Congenital Heart Disease: Causes, Diagnosis, Symptoms, and Treatments. Cell Biochemistry and Biophysics. 72
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
