Conjugaciones BODIPY convencionales para microscopía de superresolución de células vivas y seguimiento de una sola molécula

Santosh Adhikari; Chiranjib Banerjee; Joe Moscatelli; Elias M. Puchner

doi:10.3791/60950

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Artículo de método

Conjugaciones BODIPY convencionales para microscopía de superresolución de células vivas y seguimiento de una sola molécula

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DOI:

10.3791/60950

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8 de junio de 2020

Santosh Adhikari¹ , Chiranjib Banerjee^*¹ , Joe Moscatelli^*¹^,² , Elias M. Puchner¹

¹School of Physics and Astronomy, University of Minnesota, Twin Cities, Physics and Nanotechnology (PAN), ²Middlebury College

^* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Los conjugados BODIPY convencionales se pueden utilizar para la microscopía de localización de células vivas de una sola molécula (SMLM) a través de la explotación de sus dimers de estado de tierra de formación transitoria y cambio de rojo. Presentamos un protocolo SMLM optimizado para rastrear y resolver lípidos neutros subcelulares y ácidos grasos en mamíferos vivos y células de levadura a escala de longitud nanoscópica.

Resumen

Las técnicas de microscopía de localización de molécula única (SMLM) superan el límite de difracción óptica de la microscopía de fluorescencia convencional y pueden resolver las estructuras intracelulares y la dinámica de las biomoléculas con una precisión de 20 nm. Un requisito previo para SMLM son los fluoróforos que pasan de un estado oscuro a un estado fluorescente para evitar la superposición espacio-temporal de sus funciones de propagación de puntos en cada uno de los miles de marcos de adquisición de datos. Los BODIPYs son tintes bien establecidos con numerosos conjugados utilizados en la microscopía convencional. La formación transitoria de dimers de estado de tierra BODIPY (D_II)de cambio rojo da como resultado una emisión brillante de molécula única que permite la microscopía de localización de molécula única (SMLM). Aquí presentamos un protocolo simple pero versátil para SMLM con conjugados BODIPY convencionales en levaduras vivas y células de mamíferos. Este procedimiento se puede utilizar para adquirir imágenes de superresoría y para rastrear estados únicos BODIPY-D_II para extraer información espacio-temporal de conjugados BODIPY. Aplicamos este procedimiento para resolver las gotas lipídicas (LD), los ácidos grasos y los lisosomas en las células vivas de levadura y mamíferos en la escala de longitud nanoscópica. Además, demostramos la capacidad de imagen multicolor con tintes BODIPY cuando se utilizan junto con otras sondas fluorescentes. Nuestros resultados representativos muestran la distribución espacial diferencial y la movilidad de los ácidos grasos BODIPY y los lípidos neutros en levaduras en condiciones de alimentación y ayuno. Este protocolo optimizado para SMLM se puede utilizar con cientos de conjugados BODIPY disponibles comercialmente y es un recurso útil para estudiar procesos biológicos a nanoescala mucho más allá de las aplicaciones de este trabajo.

Introducción

Las técnicas de microscopía de localización de una sola molécula (SMLM) como la microscopía de reconstrucción óptica estocástica (STORM) y la microscopía de localización fotoactivada (PALM) han surgido como métodos para generar imágenes de superresolución con información más allá del límite de difracción óptica de Abbe^1,^,² y para el seguimiento de la dinámica de biomoléculas individuales^3,^,⁴. Uno de los requisitos para las sondas compatibles con SMLM es la capacidad de controlar el número de fluoróforos activos en cualquier momento para evitar la super....