Reportamos un protocolo para producir una membrana lipídica híbrida en la interfaz agua/aire dopando la bicapa lipídica con moléculas de cobre (II) 2,9,16,23-tetra-tert-butyl-29H,31H-phthalocyanine (CuPc). La membrana lipídica híbrida resultante tiene una estructura sándwich de lípidos/CuPc/lípidos. Este protocolo también se puede aplicar a la formación de otros nanomateriales funcionales.
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Artículo de método
Autoensamble de membranas lipídicas híbridas dopadas con moléculas orgánicas hidrófobas en la interfaz agua/aire
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Resumen
Resumen
Debido a sus propiedades únicas, incluyendo un espesor ultrafino (3-4 nm), resistencia ultra alta, fluidez y capacidad de autoensamblaje, las bicapas de lípidos se pueden funcionalizar fácilmente y se han utilizado en diversas aplicaciones como biosensores y biodispositivos. En este estudio, introdujimos una molécula orgánica plana: cobre (II) 2,9,16,23-tetra-tert-butyl-29H,31H-fthalocyanine (CuPc) a las membranas lipídicas de droga. La membrana híbrida CuPc/lipid se forma en la interfaz agua/aire por autoensamble. En esta membrana, las moléculas hidrofóbicas de CuPc se encuentran entre las colas hidrófobas de las moléculas de lípidos, formando una estructura sándwich de lípidos/CuPc/lípidos. Curiosamente, una bicala de lípidos híbridos estable al aire se puede formar fácilmente mediante la transferencia de la membrana híbrida a un sustrato de Si. Informamos de un método sencillo para incorporar nanomateriales en un sistema de bicapas de lípidos, que representa una nueva metodología para la fabricación de biosensores y biodispositivos.
Introducción
Como marcos esenciales de las membranas celulares, el interior de las células se separa del exterior por un sistema de bicapas lipídicas. Este sistema consiste en fosfolípidos anfifílicos, que se componen de éster fosfórico hidrófilo "cabezas" y ácidos grasos hidrófobos "colas". Debido a la notable fluidez y capacidad de autoensamblaje de las bicapas de lípidos en ambiente acuoso1,2, bicapas de lípidos artificiales se pueden formar utilizando métodos simples3,4. Varios tipos de proteínas de membrana, como canales iónicos, receptores de membrana y enzimas, se han incorporado a la bicapo de lípidos artificiales para imitar y estudiar las funciones de las membranas celulares5,6. Más recientemente, las bicapas lipídicas han sido dopadas con nanomateriales (por ejemplo, nanopartículas metálicas, grafeno y nanotubos de carbono) para formar membranas híbridas funcionales7,8,9,10,11,12,13. Un método ampliamente utilizado para la formación de tales membranas híbridas implica la formación de vesículas lipídicas dopadas, que contienen materiales hidrófobos como Au-nanopartículas modificadas7 o nanotubos de carbono11,y las vesículas resultantes se fusionan en bicapas de lípidos compatibles planares. Sin embargo, este enfoque es complejo y requiere mucho tiempo, lo que limita los usos potenciales de tales membranas híbridas.
En este trabajo, las membranas lipídicas se dopadan con moléculas orgánicas para producir membranas lipídicas híbridas que se formaron en la interfaz agua/aire por autoensamble. Este protocolo implica tres pasos: preparación de la solución mixta, formación de una membrana híbrida en la interfaz agua/aire, y la transferencia de la membrana a un sustrato De. En comparación con otros métodos notificados anteriormente, el método descrito aquí es más simple y no requiere instrumentación sofisticada. Usando este método, las membranas lipídicas híbridas estables al aire con un área más grande se pueden formar en un tiempo más corto. El nanomaterial utilizado en este estudio es una molécula orgánica semiconductora, cobre (II) 2,9,16,23-tetra-tert-butyl-29H,31H-fthalocyanine (CuPc), que es ampliamente utilizado en una serie de aplicaciones, incluyendo células solares, fotodetectores, sensores de gas y catálisis14,15. CuPc, una pequeña molécula orgánica con una estructura plana, tiene una alta afinidad por las "colas" del dúo de fosfolípidos con sus características hidrofóbicas. Otros grupos han informado de que las moléculas de CuPc pueden autoensamblarse en superficies de un solo cristal con la formación de estructuras altamente ordenadas16,17. Por lo tanto, es muy posible que las moléculas de CuPc podrían ser incorporadas en las bicapas de lípidos a través del autoensamble.
Proporcionamos una descripción detallada de los procedimientos utilizados para formar membranas y proporcionamos algunas sugerencias para implementar sin problemas este procedimiento. Además, presentamos algunos resultados presentativos de las membranas lipídicas híbridas, y discutimos posibles aplicaciones de este método.
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Protocolo
1. Preparación de una solución híbrida
- Lavar cuatro viales de vidrio desechables de 4 ml y tapones de tornillo (con sellos recubiertos de PTFE) en un baño ultrasónico durante 10 minutos en agua destilada (purificada con un sistema de filtración), seguida de etanol y cloroformo, respectivamente. Seque los viales y tapas de vidrio en una corriente de gas nitrógeno.
- En una guantera anaeróbica, prepare una solución de cuPc (10 mg/ml) en un vial de vidrio lavado disolviendo CuPc en polvo en cloroformo.
- Filtrar la solución de CuPc a través de una membrana de politetrafluoroetileno (PTFE) de 0,2 m.
- Conservar la solución filtrada en un vial de vidrio lavado lleno de nitrógeno y sellar el vial con parafilm.
- Sacar la solución de cloroformo de 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPhPC) comprada (25 mg/ml) del refrigerador de -80 oC y dejar que se caliente a temperatura ambiente.
- Revuelva la solución DPhPC utilizando un mezclador de vórtice a 2300 rpm durante 10 s.
- Enjuague una micro-jeringa de vidrio con cloroformo durante 5 veces.
- Transfiera 200 l de la solución de cloroformo DPhPC a un vial de vidrio prelavado utilizando la jeringa lavada. Evaporar el disolvente en el vial con una corriente suave de nitrógeno.
- Enjuague una micro-jeringa de vidrio 5 veces con cloroformo.
- Añadir 202,6 l de cloroformo al vial de vidrio con DPhPC utilizando la jeringa limpia.
- Agregue 47,4 l de solución filtrada de CuPc de 10 mg/ml a la solución DPhPC. La relación molar de DPhPC a CuPc debe ser 10:1.
- Enjuague la micro-jeringa de vidrio 5 veces con cloroformo.
- Añadir 250 l de hexano a la solución utilizando la jeringa. La concentración final de la solución debe ser de 10 mg/ml.
- Mezclar la solución preparada con un mezclador de vórtice a 2300 rpm durante 10 s.
- Filtrar la solución de CuPc a través de una membrana de politetrafluoroetileno (PTFE) de 0,2 m.
- Selle el vial de vidrio con parafilm. Colóquelo en una bolsa sellada con agarre lleno de nitrógeno y coloque la bolsa sellada con agarre en un congelador a -20 oC.
NOTA: Después del paso 1.13, el DPhPC y el CuPc se disolvieron en un disolvente mixto, que estaba compuesto de cloroformo y hexano (relación de volumen de 1:1). Además, la relación molar de DPhPC a CuPc no se limita a 10:1. Con una concentración constante de lípidos (10 mg/ml), se pueden utilizar diferentes proporciones molares. Según resultados experimentales anteriores, se prefiere un rango de 10:1 a 3:1 para formar una membrana lipídica híbrida de alta calidad.
2. Formación de una membrana híbrida en la interfaz agua/aire
- Corte los sustratos de Si (3 cm x 3 cm) de una oblea Si.
- Limpie los sustratos de Si de 3 cm x 3 cm en un baño ultrasónico durante 10 minutos en agua purificada, seguido de etanol y luego cloroformo. Tratar el sustrato de Si con un plasma O2 durante 5 minutos para eliminar los materiales orgánicos adsorbidos de la superficie y mejorar la hidrofilia.
- Lavar un vaso de precipitados de teflón con un diámetro interior de 7,5 cm con agua purificada que fluye durante 3 min.
- Coloque el sustrato de Si limpio en el vaso de precipitados de PTFE lavado. El sustrato se inclina en un ángulo de 30o a la horizontal.
- Vierta una cantidad suficiente de agua purificada en el vaso de precipitados de teflón hasta que todo el sustrato de Si esté sumergido.
- Saque la solución híbrida preparada del congelador y deje que se caliente a temperatura ambiente.
- Revuelva la solución híbrida utilizando un mezclador de vórtice a 2300 rpm durante 15 s.
- Enjuague una micro-jeringa de vidrio (50 l) 5 veces con cloroformo.
- Suelte 3-5 l de la solución híbrida sobre la superficie del agua utilizando la jeringa para formar una membrana lipídica híbrida flotante.
NOTA: Cuando se cae la solución, es importante mantener la gota cerca de (menos de 1 cm) de la superficie del agua. También debe tenerse en cuenta que una membrana híbrida de una sola capa no es visible a simple vista, pero la membrana híbrida multicapa aparece como película delgada de color azul. Para transferir la membrana híbrida multicapa al sustrato De, es importante dejar caer la solución mixta lo más cerca posible del sustrato De Si.
3. Transferencia de la membrana a un sustrato Si
- Después de la evaporación del disolvente orgánico (tomará menos de 2 segundos), bajar el nivel de agua a una velocidad de 3 mm / min mediante el bombeo del agua a través de un tubo de goma que es impulsado por una bomba peristáltica, para transferir la membrana híbrida flotante en el sustrato De.
- Una vez completado el proceso de transferencia (alrededor de 5 min), coloque el sustrato De en un limpiaparabrisas y deje que todo el agua residual se evapore.
NOTA: Bajar el nivel del agua a una velocidad tan baja sirve para minimizar la turbulencia del agua y para proteger la membrana.
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Resultados
La membrana formada tiene un color azul claro uniforme debido a la presencia de moléculas de CuPc. El área de la membrana de color es normalmente varios centímetros cuadrados. En la Figura 1A y Figura 1B,mostramos una imagen microscópica y una imagen del microscopio de fuerza atómica (AFM) (incluyendo un perfil de altura) de la membrana lipídica híbrida en un sustrato de Si. En la imagen AFM, la membrana en la parte superior izquierda es gruesa, con un espesor d...
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Discusión
En la solución precursora de la membrana híbrida, se utiliza un disolvente orgánico mezclado (cloroformo y hexano) en lugar de cloroformo puro para disolver los lípidos y cuPc. Si se utiliza cloroformo puro, la densidad de la solución precursora sería mayor que el agua. Por lo tanto, es muy probable que la solución se hunda en el fondo del agua en lugar de extenderse sobre la superficie del agua. La adición de hexano, un disolvente de baja densidad, a la solución precursora, garantiza que la solución flotará en la superf...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por el programa CREST de la Agencia Japonesa de Ciencia y Tecnología (JPMJCR14F3) y Grant in-Aids de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (19H00846 y 18K14120). Este trabajo se llevó a cabo en parte en el Laboratorio de Nanoelectrónica y Spintronics, Instituto de Investigación de Comunicación Eléctrica, Universidad tohoku.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Cloroformo | Wako Productos químicos | 033-08631 | |
| CuPc | Sigma-Aldrich | 423165 | |
| DPhPc | Avanti Polar Lipids | 850356C | |
| Viales de vidrio con tapón de rosca | Nichiden-Rike Glass Co., Ltd | 6-29801 | |
| Hexane | Wako Productos químicos | 084-03421 | |
| Filtros de membrana | Merck Millipore Ltd. | ||
| Microjeringa | Hamilton | 80530 | |
| Bomba peristáltica | Tokyo Rikakikai Co., Ltd. | ||
| Mezclador de vórtice | Scientific Industries, Inc. | SI-0286 |
Referencias
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