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Summary

El objetivo de este protocolo es analizar la división celular en tejido intacto mediante microscopía celular viva y fija utilizando esperamorcitos meióticos Drosophila. El protocolo demuestra cómo aislar testículos enteros e intactos de larvas de Drosophila y pusias tempranas, y cómo procesarlos y montarlos para microscopía.

Abstract

El análisis experimental de las células que se dividen en tejidos y órganos vivos y intactos es esencial para nuestra comprensión de cómo la división celular se integra con el desarrollo, la homeostasis tisular y los procesos de la enfermedad. Los espermatocitos drosofílicos sometidos a meiosis son ideales para este análisis porque (1) los testículos enteros de Drosophila que contienen espermatocitos son relativamente fáciles de preparar para la microscopía, (2) el gran tamaño de los espermatocitos los hace muy adecuados para imágenes de alta resolución, y (3) potentes herramientas genéticas de Drosophila se pueden integrar con el análisis in vivo. Aquí, presentamos un protocolo de fácil acceso para la preparación de testículos enteros de larvas drosophila tercera instar y pupupas tempranas. Describimos cómo identificar esperamorcitos meióticos en testículos enteros preparados y cómo imaginarlos vivir por microscopía de lapso de tiempo. También se proporcionan protocolos para la fijación e inmunostainización de testículos enteros. El uso de testículos larvales tiene varias ventajas sobre los protocolos disponibles que utilizan testículos adultos para el análisis de espermatocitos. Lo más importante es que los testículos larvales son más pequeños y menos llenos de células que los testículos adultos, y esto facilita en gran medida la toma de imágenes de alta resolución de los espermatocitos. Para demostrar estas ventajas y las aplicaciones de los protocolos, presentamos resultados que muestran la redistribución del retículo endoplasmático con respecto a los microtúbulos del husillo durante la división celular en un solo espertacito que se muestra mediante microscopía confocal de lapso de tiempo. Los protocolos se pueden combinar con la expresión de cualquier número de proteínas etiquetadas fluorescentes u marcadores de orgánulos, así como mutaciones genéticas y otras herramientas genéticas, haciendo que este enfoque sea especialmente potente para el análisis de los mecanismos de división celular en el contexto fisiológico de tejidos y órganos enteros.

Introduction

La división celular se estudia a menudo utilizando líneas celulares cultivadas en el cultivo¹. Si bien hemos obtenido una gran cantidad de información y comprensión inestimables de los mecanismos fundamentales de estos estudios², las células cultivadas en el cultivo no pueden recapitular completamente la fisiología de la división celular como ocurre en el tejido vivo intacto. Por ejemplo, en los tejidos y órganos intactos, las células deben dividirse en el lugar correcto y en el momento adecuado para que las células de la progenie estén adecuadamente situadas dentro del tejido, de modo que puedan someterse a una adecuada diferenciación o programas funcionales, y para que la proliferación celular esté adecuadamente coordinada con el crecimiento tisular o la homeostasis^3. En el caso de las células cultivadas en cultivo, por otro lado, la división celular está generalmente regulada por factores de crecimiento en el medio de cultivo^4,y por lo tanto no podemos aprender de estas células cómo factores ambientales in vivo como la arquitectura de tejidos o la señalización del desarrollo influyen en el proceso de división. También es importante tener en cuenta que muchas de las líneas celulares utilizadas para estudiar la división celular, como las células HeLa y U2OS, se derivaron de tumores metastásicos^5. Por lo tanto, muchos aspectos de la fisiología básica de estas células cancerosas, como los mecanismos reguladores del ciclo celular y la estabilidad cromosómica, probablemente han sido alterados en comparación con las células sanas. La comprensión completa de la fisiología de la división celular, por lo tanto, depende de nuestra capacidad para estudiar células divisorias en sus entornos nativos in vivo que preservan los mecanismos reguladores fisiológicos y la arquitectura de los tejidos.

Los avances en la comprensión de cómo funciona la división celular dentro de los tejidos y órganos intactos se ven obstaculizados por dificultades inherentes al análisis in vivo o ex vivo. En primer lugar, puede ser difícil o imposible acceder a las células divisorias para el análisis microscópico dentro de órganos grandes o tejidos gruesos. En segundo lugar, a menudo es difícil predecir cuándo las células individuales se dividirán in vivo. En tercer lugar, la fisiología tisular puede deteriorarse rápidamente durante el cultivo ex vivo. En este protocolo, describimos métodos fácilmente accesibles para el análisis en vivo y fijo de los espermatocitos Drosophila melanogaster a medida que se someten a divisiones celulares meióticas dentro de testículos totalmente intactos. Estas células son ideales para el análisis vivo y ex vivo porque son fácilmente accesibles con métodos ópticos estándar como la microscopía confocal, se dividen en momentos y ubicaciones predecibles, y los testículos intactos se pueden mantener en cultivo ex vivo durante aproximadamente 24 horas. Además, los espermatocitos Drosophila son células redondas grandes (aproximadamente de 20 a 30 m de diámetro) que no cambian de forma cuando se dividen, por lo que son ideales para imágenes de alta resolución y lapso de tiempo de componentes celulares como el aparato del husillo y los orgánulos citoplasma. Aunque estas células sufren meiosis en comparación con la mitosis, muchos de los procesos esenciales de división celular son muy similares entre estos dos mecanismos de división celular⁶. Estas ventajas, combinadas con potentes herramientas genéticas Drosophila, han hecho de los espermatocitos Drosophila un modelo ampliamente utilizado para el análisis ex vivo de procesos esenciales de división celular incluyendo la formación y regulación de husillos, la citokinesis, y la remodelación y partición de orgánulos^{7,,8,9,,10,11}.

Los espermacitos son células que se encuentran en la etapa meiótica de la espermatogénesis. En Drosophila,la espermatogénesis comienza con un grupo de células madre germinales que se encuentran en una pequeña región o “hub” en un polo del testículo^12,,13. Estas células se dividen por una mitosis asimétrica, dando lugar a un solo espermatogonio diferenciado. Luego, la espermatogonia se somete a cuatro mitosis síncronas para producir un grupo de 16 células que permanecen estrechamente asociadas dentro de un solo quiste. En esta etapa, las células pasan de un ciclo celular mitético a un ciclo celular meiótico y se conocen como espermatocitos. Los espermacitos pasan alrededor de dos a tres días en una etapa G2 extendida del ciclo celular, durante la cual crecen dramáticamente y experimentan cambios citológicos en la preparación para las dos divisiones meióticas y posterior espermiogénesis^13,,14. Todo el grupo de 16 espermatocitos dentro de un solo quiste entonces entra en la primera división meiótica al mismo tiempo. Por lo tanto, varios esperamorcitos meióticos se pueden crear imágenes simultáneamente a medida que avanzan a través de la división celular. La primera división meiótica continúa durante aproximadamente 1,5 h y es seguida casi inmediatamente por la segunda división meiótica, produciendo 64 espermatozoides totales que pasan a diferenciarse en espermatozoides maduros.

Una ventaja única de usar espermacitos para estudiar la división celular en vivo, tejido intacto es que los grupos o quistes de las células progresan constantemente a través de las diferentes etapas de la espermatogénesis, y las células en todas las etapas de la espermatogénesis generalmente se pueden identificar en cualquier testículo dado (ver Figura 3A). Por lo tanto, es relativamente fácil encontrar células meióticas en testículos enteros. Por lo general, centramos nuestros análisis en la primera en lugar de la segunda meiosis porque estas células son mucho más grandes y más susceptibles a las imágenes de alta resolución, pero todo el proceso que abarca ambas divisiones meióticas se puede tomar imágenes con éxito. También debe tenerse en cuenta que el protocolo general para la preparación y el cultivo de testículos se puede utilizar para analizar otros procesos de espermatogénesis, así, como la célula madre mitotica anterior o divisiones espermatogoniales o los cambios citológicos que se producen a medida que los espermatozoides maduran en espermatozoides^15. Muchos de estos aspectos de la espermatogénesis están muy conservados entre Drosophila y los seres humanos^16.

Los espermatocitos drosófilos comienzan a alcanzar la fase meiótica de la espermatogénesis durante la tercera etapa larval instar del desarrollo de Drosophila ¹³. Por lo tanto, los testículos aislados de las etapas del ciclo de vida a partir de larvas de tercera estrella e incluyendo pupas y adultos se pueden utilizar para el análisis de la división de espermacitos. Varios protocolos excelentes están disponibles para la extracción de testículos de moscas macho adultas para análisis vivos y fijos de espermatogénesis^17,18,19. Estos protocolos pueden ser preferibles para estudiar etapas tardías de la espermatogénesis o si se deben utilizar marcadores genéticos que solo son visibles en adultos. El protocolo se centra en cambio en la preparación de testículos a partir de larvas y pupae tempranas, porque los testículos en estas etapas tienen varias ventajas que son específicamente pertinentes para el análisis de la división celular por microscopía de lapso de tiempo de alta resolución. En primer lugar, los testículos de larvas y pusias son más pequeños que los de adultos, y las células dentro del órgano están menos llenas. Debido a esto, los espermismocitos divisorios a menudo se pueden tomar imágenes cerca de la superficie externa de los testículos larvales, sin tener que penetrar a través de múltiples capas de tejido de dispersión de luz. En segundo lugar, los testículos adultos se mueven rítmicamente debido a las contracciones de los órganos accesorios conectados, y estos movimientos hacen que la toma de imágenes de lapso de tiempo de células individuales sea un desafío. Y en tercer lugar, los testículos larvales son ventajosos cuando se estudian mutaciones genéticas que causan letalidad pupal o adulta. Nuestros métodos están optimizados para el cultivo a largo plazo de testículos en la etapa del microscopio, lo que permite la toma de imágenes de múltiples rondas de división celular o la progresión de células individuales a través de múltiples etapas de espermatogénesis en la misma preparación. También describimos un protocolo para la fijación y la inmunomanchación de testículos enteros. En general, nuestros protocolos son particularmente útiles para aquellos interesados en estudiar la división celular en tejido intacto, y la capacidad de combinar el análisis de espermatocitos con herramientas genéticas Drosophila altamente manejables hace de este un enfoque especialmente poderoso.

Protocol

1. Preparar animales, herramientas y medios para la disección Cruz a las moscas macho y hembra para obtener progenie del genotipo deseado. Los marcadores transgénicos útiles para la identificación y puesta en escena de los espermatocitos meióticos incluyen GFP-tubulina para etiquetar el husillo meiotico y RFP-histone 2A para etiquetar los cromomasomas8. Utilice de cinco a diez hembras por cruz y mantenga cruces en alimentos de mosca estándar en viales en una incubadora de 25 oC hasta que las larvas de la tercera estrella comiencen a gatear por los lados del vial (4-5 días). Las primeras puas blancas comenzarán a formarse un día después. Consigue dos pares de fórceps rectos con puntas finas. Asegúrese de que las puntas sean afiladas, incluso en longitud, y rectas(Figura 1A). Utilice estos fórceps solo para disecciones y tapa con puntas de pipeta de 10 ml cuando no esté en uso. Prepare una herramienta de bisturí. Inserte el extremo romo de un pasador de insecto de acero anodizado negro en un soporte de pasador y gire el tornillo del soporte para fijar el pasador en su lugar. Usando un par de fórceps y bajo un microscopio de disección, agarre el pasador de insectos en el medio y dóblelo para formar un ángulo interno de 135o(Figura 1B). El extremo afilado es para cortar tejido, mientras que el borde se utiliza para transferir testículos entre gotas de medios. Tapa con una punta de pipeta de 1.000 ml cuando no esté en uso. Trabajando en una campana de cultivo de tejido, prepare alícuotas de 5 ml de los medios de Schneider y guárdelas a 4 oC hasta el momento de su uso. Cuando esté listo para comenzar las disecciones, caliente una alícuota media de 5 ml a temperatura ambiente. A continuación, transfiera el medio de disección calentado a una jeringa de 10 ml y conecte un filtro de jeringa de 0,22 m. 2. Disección de testículos de larvas y puas precoces Utilice la jeringa de filtro llena de medios para expulsar tres gotas de medios (50 ml cada una) en la parte superior, media e inferior de un portaobjetos de vidrio. Utilice una sonda de disección para transferir de cinco a diez terceras larvas instar o puas tempranas (pugas que todavía son blancas o amarillas) a la gota superior. Agitar suavemente las larvas y puepue en los medios con la sonda de diseción para eliminar cualquier alimento o escombros. Bajo un microscopio de disección, gire una sola larva o pupa de su lado con una sonda de disección para identificar los dos testículos bilaterales si están presentes, que aparecen como estructuras translúcidas de forma ovalada en el tercio posterior del cuerpo(Figura 2A, B). Los animales que carecen de testículos son hembras y deben ser desechados. Cuando se encuentre una larva o pupa macho y esté limpia, muévala a la segunda gota de medios. Repita hasta que se hayan transferido 3 o 4 larvas masculinas y/o pupae a la segunda gota de medios. Trabajando en la segunda gota de medios, agarra una sola larva macho o pupa con un par de fórceps en su región media, justo antes de los testículos. Usa el segundo par de fórceps para desgarrar suavemente al animal por la mitad. Sostenga el extremo posterior de la larva o pupupa hacia abajo en el tobogán de vidrio con un par de fórceps. Comenzando justo al lado de los fórceps, empuje hacia abajo en la cutícula usando el borde de la herramienta del bisturí y mueva el bisturí hacia el extremo cortado del animal. Esto expulsará los órganos internos del animal, que incluyen las tripas, cuerpos de grasa y testículos. Tome suavemente separar los testículos del resto de los órganos. Los testículos son órganos claros de forma ovalada incrustados en cintas de cuerpo gordo(Figura 2C). Transfiera los testículos de uno en uno a la tercera gota de medios. Para lograr esto, inserte el borde del bisturí debajo del cuerpo gordo, levante el tejido fuera del medio y muévalo rápidamente a la tercera gota. Alternativamente, si no hay suficiente cuerpo de grasa todavía unido a los testículos para levantar con éxito el tejido, transferir suavemente el tejido utilizando una pipeta Pasteur de vidrio que ha sido prehumedecida con medios de disección. Utilice el extremo afilado de la herramienta del bisturí para cortar suavemente el exceso de grasa del cuerpo de los testículos, dejando sólo un pequeño borde de cuerpo de grasa alrededor de los bordes(Figura 2C). No es necesario eliminar todo el cuerpo de grasa, y tratar de hacerlo probablemente resultará en dañar o romper de los testículos. Repita los pasos anteriores para todas las larvas masculinas en el tobogán de vidrio. Continúe con el paso 3 o el paso 5. 3. Pruebas de montaje para imágenes microscópicas en vivo NOTA: Este procedimiento de montaje fue adaptado de un protocolo recientemente publicado para la toma de imágenes de los neuroblastos cerebrales larvales de Drosophila 20. Puede encontrar más detalles en esta referencia. Utilice la jeringa de filtro para depositar una sola gota de los medios de Schneider (alrededor de 30 ml) en el centro de un plato de cultivo permeable al gas de 50 mm. Utilice una pipeta Pasteur prehumedecida para transferir los testículos preparados a la gota del plato permeable al gas. Los testículos generalmente flotarán a la superficie de la gota. Utilice la herramienta del bisturí para empujar suavemente los testículos hacia abajo sobre la membrana permeable al gas. Tenga cuidado de no romper la membrana permeable al gas con el punto afilado del bisturí. Empuje todos los testículos al centro de la gota. Utilice una jeringa de 1 ml llena de aceite de halocarbono para hacer cuatro gotas de aceite, aproximadamente 30 l cada una, en la membrana permeable al gas. Espaciar las gotas de aceite alrededor de la gota de medios que contienen los testículos para que correspondan a las cuatro esquinas de un cubreobjetos de vidrio de 22 mm. Alinee las esquinas de un cubreobjetos de vidrio de 22 mm con las cuatro gotas de aceite de halocarbon y baje suavemente el cubreobjetos sobre el medio y el aceite. Deje que el cubreobjetos se asiente y que los medios que contienen los testículos se propaguen entre las gotas de aceite. Retire el exceso de medios para permitir que el cubreobjetos se asiente sobre la superficie de los testículos. Mientras observa los testículos bajo un microscopio de disección, inserte la esquina de una delicada toallita de tarea en el medio bajo el cubreobjetos para eliminar una pequeña cantidad de líquido. Retirar suficientes medios hasta que el cubreobjetos de vidrio sólo hace contacto con la superficie de los testículos más grandes. Es fundamental no eliminar demasiados medios y bajar demasiado el cubreobjetos, ya que esto ejercerá presión sobre los testículos y hará que se rompan (ver Figura 5). 4. Imágenes en vivo de los espermacitos meióticos NOTA: Los espermatocitos se pueden crear imágenes utilizando un microscopio confocal de disco giratorio o de escaneo láser. El sistema debe tener una velocidad y sensibilidad adecuadas para evitar el fotoblanqueo de proteínas fluorescentes o fotodaños del tejido. Coloque una gota de aceite de inmersión en el cubreobjetos de vidrio justo encima de los testículos. Voltee el plato y colóquelo en la etapa del microscopio y mueva el objetivo del microscopio (40x o 60x) en el aceite hasta que esté justo debajo de los testículos. Utilice la luz transmitida para encontrar un solo testículo y ponerlo en foco. Mientras captura imágenes rápidas con el confocal, mueva el testis alrededor para examinar la organización de las celdas. Un extremo de los testículos tendrá muchas células pequeñas y densamente empaquetadas. Este extremo contiene las células madre germinales y la espermatogonia. Avanzando hacia el otro extremo del órgano, identifique células progresivamente más grandes organizadas en racimos o quistes discretos. Estas células grandes son los espermacitos(Figura 3A). Si toma imágenes de GFP-tubulina, identifique los espermatocitos que iniciarán la meiosis dentro de 30-60 min por la presencia de dos asteres de microtúbulos brillantes (es decir, centrosomas) ubicados en la corteza de la célula(Figura 3B, C). Una vez que se haya identificado un quiste de espermatocitos meióticos, configure los parámetros de adquisición para capturar pilas z de imágenes a lo largo del tiempo. Típicamente, la adquisición de 15–20 imágenes separadas 1,5 m en la dimensión z es suficiente para capturar el volumen completo de varios espermacitos dentro del mismo quiste. Adquiera pilas z completas cada 2 minutos si toma imágenes de toda la primera división meiótica, que tarda aproximadamente 1,5 horas. Es posible utilizar tasas de adquisición más rápidas, especialmente si sólo se va a analizar un evento específico de meiosis. Sin embargo, tenga cuidado de no causar fotoblanqueo o fotodaño debido a la exposición repetida de la muestra a la excitación láser. Utilice un sistema de control de enfoque continuo y automático para evitar la deriva focal durante el largo período de adquisición. Por lo general, no es necesario controlar la temperatura de la muestra en la etapa del microscopio, suponiendo una temperatura ambiente de aproximadamente 22-23 oC. Si hay control de temperatura disponible, mantenga la muestra a 25 oC en la etapa del microscopio. Si no se encuentran espermatocitos meióticos, almacene la muestra durante varias horas o durante la noche en una incubadora e imagen de 25 oC de nuevo. 5. Fijación e inmunomancha A partir del paso 2.10 anterior, utilice una pipeta Pasteur de vidrio para transferir los testículos a un pozo en un plato de desconexión de vidrio de 9 pozos que contenga 0,5 ml de paraformaldehído al 8% en PBSTx (solución salina tamponada de fosfato con 0,3% de tritón X-100). Asegúrese de que los testículos están colocando en la parte inferior del plato.NOTA: Paraformaldehyde es tóxico y debe manipularse con guantes en una campana de humo. Fijar los testículos durante 20 minutos a temperatura ambiente. Transfiera los testículos a un pozo que contenga 0,5 ml PBSTx. Lavar durante 5 min con agitación suave. Repita el paso de lavado en nuevos pozos con PBSTx fresco dos veces más. Diluir el anticuerpo primario a la concentración deseada en 0,5 ml de PBSTx que contiene 5% de albúmina sérica bovina (BSA) en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Transfiera los testículos de la placa de desguace de vidrio de 9 metros a la sonda de anticuerpos primarios diluidos e incubadurante durante la noche a 4oC con una suave mecedora o nueces. Lave los testículos en 0,5 ml de PBSTx durante 5 minutos en un pozo de un plato de diselación de vidrio de 9 pozos. Repita el paso de lavado con PBSTx fresco dos veces más. Diluir el anticuerpo secundario en 250 ol de PBSTx que contiene 5% de BSA y dispensar en un pozo limpio de un plato de disificación de vidrio de 9 pozos. Si lo desea, agregue DAPI al ADN de manchas. Transfiera los testículos al pozo que contiene anticuerpos secundarios, cubra con una envoltura de plástico e incubar en la oscuridad con agitación suave durante 4 horas a temperatura ambiente. Transfiera los testículos a un pozo limpio lleno de 0,5 ml de PBSTx. Lavar con PBSTx fresco dos veces durante 5 minutos y una tercera vez durante 30 min. 6. Montaje de testículos fijos Transfiera los testículos del último lavado a un portaobjetos de microscopía de vidrio utilizando una pipeta Pasteur. Si es necesario, utilice el borde de la herramienta del bisturí para empujar los testículos hacia abajo sobre la superficie de la diapositiva. Utilice la esquina de una delicada toallita de tarea para eliminar el exceso de líquido de los testículos. Retire tanto líquido como sea posible. Aplique una gota de 30–50 l de medio de montaje de microscopía a los testículos. Coloque un cubreobjetos de 22 mm en la gota del medio de montaje y deje que el cubreobjetos se asiente y el medio de montaje se extienda por debajo de la cubierta. Aplique una presión suave al cubreobjetos si es necesario para exprimir el exceso de medio de montaje y dejar que el cubreobjetos descanse sobre la superficie de los testículos. Use esmalte de uñas para sellar los bordes de la cubierta.

Representative Results

Cuando este protocolo se ejecuta con éxito, los testículos permanecerán completamente intactos para la toma de imágenes mediante microscopía confocal u otros métodos de microscopía de fluorescencia. Como se ve en la Figura 3A,se preserva la organización celular de los testículos, y la progresión de la diferenciación celular de un extremo del testículo al otro incluyendo espermatogonia, espermatocitos, y espermicidas haploides es visible. La GFP-tubulina es un marcador útil para …

Discussion

Hemos descrito un protocolo para la preparación de testículos de Drosophila pupálida larvales o tempranas, optimizado para imágenes en vivo a largo plazo de la división celular de los espermatozoides. Este es un método poderoso para el análisis de la división celular en el contexto fisiológico del tejido intacto. El poder de este método se expande aún más cuando se combina con herramientas genéticas drosofílicas, como mutaciones genéticas específicas, supresión mediada por ARN específi…

Materials

5" Dissecting Probe	Fisher	08-965-A
5.75" Glass Pasteur Pipet	Fisher	13-678-20A
Bovine Serum Albumin (BSA)	Fisher	BP9703-100
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11252-20	Straight forcepts with fine tips
Frosted Microscope Slides	Fisher	12-544-2	Slides for mounting fixed tissue, with frosted writing surface
Halocarbon oil 700	Sigma	H8898-100 mL
Lumox Dish 50	Sarstedt	SAR946077410	Gas-permeable tissue culture dish
Microscope Cover Glass	Fisher	12-541-B	22×22 mm, #1.5 glass coverslip
Minutien Pins	Fine Science Tools	26002-15	Insect pins used to make scalpel tool
Nickel Plated Pin Holder	Fine Science Tools	26018-17
Paraformaldehyde 32% Solution, EM Grade	Electron Microsocopy Sciences	15714
Plan Beveled Edge Microscope Slides	Fisher	12-549-5	Slides used for dissections
PYREX Spot Plates	Fisher	13-748B	9-well glass dissecting dish
Schneider's Drosophila medium	Fisher	21720-024
Syringe Filter, 0.22 µm	EMD Millipore	SLGS033SB
Triton X-100	Fisher	BP151-500
Vectashield	Vector Labs	H-1000	Microscopy mounting medium