El objetivo de este protocolo es analizar la división celular en tejido intacto mediante microscopía celular viva y fija utilizando esperamorcitos meióticos Drosophila. El protocolo demuestra cómo aislar testículos enteros e intactos de larvas de Drosophila y pusias tempranas, y cómo procesarlos y montarlos para microscopía.
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Artículo de método
Preparación de pruebas de larvas y pupales de Drosophila para el análisis de la división celular en vivo, tejido intacto
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Resumen
Resumen
El análisis experimental de las células que se dividen en tejidos y órganos vivos y intactos es esencial para nuestra comprensión de cómo la división celular se integra con el desarrollo, la homeostasis tisular y los procesos de la enfermedad. Los espermatocitos drosofílicos sometidos a meiosis son ideales para este análisis porque (1) los testículos enteros de Drosophila que contienen espermatocitos son relativamente fáciles de preparar para la microscopía, (2) el gran tamaño de los espermatocitos los hace muy adecuados para imágenes de alta resolución, y (3) potentes herramientas genéticas de Drosophila se pueden integrar con el análisis in vivo. Aquí, presentamos un protocolo de fácil acceso para la preparación de testículos enteros de larvas drosophila tercera instar y pupupas tempranas. Describimos cómo identificar esperamorcitos meióticos en testículos enteros preparados y cómo imaginarlos vivir por microscopía de lapso de tiempo. También se proporcionan protocolos para la fijación e inmunostainización de testículos enteros. El uso de testículos larvales tiene varias ventajas sobre los protocolos disponibles que utilizan testículos adultos para el análisis de espermatocitos. Lo más importante es que los testículos larvales son más pequeños y menos llenos de células que los testículos adultos, y esto facilita en gran medida la toma de imágenes de alta resolución de los espermatocitos. Para demostrar estas ventajas y las aplicaciones de los protocolos, presentamos resultados que muestran la redistribución del retículo endoplasmático con respecto a los microtúbulos del husillo durante la división celular en un solo espertacito que se muestra mediante microscopía confocal de lapso de tiempo. Los protocolos se pueden combinar con la expresión de cualquier número de proteínas etiquetadas fluorescentes u marcadores de orgánulos, así como mutaciones genéticas y otras herramientas genéticas, haciendo que este enfoque sea especialmente potente para el análisis de los mecanismos de división celular en el contexto fisiológico de tejidos y órganos enteros.
Introducción
La división celular se estudia a menudo utilizando líneas celulares cultivadas en el cultivo1. Si bien hemos obtenido una gran cantidad de información y comprensión inestimables de los mecanismos fundamentales de estos estudios2, las células cultivadas en el cultivo no pueden recapitular completamente la fisiología de la división celular como ocurre en el tejido vivo intacto. Por ejemplo, en los tejidos y órganos intactos, las células deben dividirse en el lugar correcto y en el momento adecuado para que las células de la progenie estén adecuadamente situadas dentro del tejido, de modo que puedan someterse a una adecuada....
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Protocolo
1. Preparar animales, herramientas y medios para la disección
- Cruz a las moscas macho y hembra para obtener progenie del genotipo deseado. Los marcadores transgénicos útiles para la identificación y puesta en escena de los espermatocitos meióticos incluyen GFP-tubulina para etiquetar el husillo meiotico y RFP-histone 2A para etiquetar los cromomasomas8. Utilice de cinco a diez hembras por cruz y mantenga cruces en alimentos de mosca estándar en viales en una incubadora de 25 oC hasta que las larvas de la tercera estrella comiencen a gatear por los lados del vial (4-5 días). Las primeras puas blancas comenzarán a formarse un día despué....
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Resultados
Cuando este protocolo se ejecuta con éxito, los testículos permanecerán completamente intactos para la toma de imágenes mediante microscopía confocal u otros métodos de microscopía de fluorescencia. Como se ve en la Figura 3A,se preserva la organización celular de los testículos, y la progresión de la diferenciación celular de un extremo del testículo al otro incluyendo espermatogonia, espermatocitos, y espermicidas haploides es visible. La GFP-tubulina es un marcador útil para identificar l.......
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Discusión
Hemos descrito un protocolo para la preparación de testículos de Drosophila pupálida larvales o tempranas, optimizado para imágenes en vivo a largo plazo de la división celular de los espermatozoides. Este es un método poderoso para el análisis de la división celular en el contexto fisiológico del tejido intacto. El poder de este método se expande aún más cuando se combina con herramientas genéticas drosofílicas, como mutaciones genéticas específicas, supresión mediada por ARN específica del tejido y ma.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por fondos iniciales del Departamento de Defensa para J.T.S.
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Materiales
Drosophila
Albúmina sérica bovina medio de
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Sonda de disección de 5" | Fisher | 08-965-A | |
| 5.75" Vidrio Pasteur Pipeta | Fisher | 13-678-20A | |
| (BSA) | Fisher | BP9703-100 | |
| Dumont #5 Pinzas | Fine Science Tools | 11252-20 | Forceptes rectos con puntas finas |
| Portaobjetos de microscopio esmerilados | Fisher | 12-544-2 | Portaobjetos para el montaje de tejido fijo, con superficie de escritura esmerilada |
| Aceite Halocarbon 700 | Sigma | H8898-100 mL | |
| Lumox Dish 50 | Sarstedt | SAR946077410 | Placa de cultivo de tejidos permeable al gas |
| Cubierta de vidrio para microscopio | Fisher | 12-541-B | 22 mm x 22 mm, cubreobjetos de vidrio #1.5 |
| Pines de Minutas | Fine Science Tools | 26002-15 | Alfileres de insectos utilizados para hacer herramienta de bisturí |
| Soporte de alfiler niquelado | Fine Science Tools | 26018-17 | |
| Solución de paraformaldehído al 32%, grado EM | Microscopía electrónica Sciences | 15714 | |
| plano Portaobjetos de microscopio de borde biselado | Fisher | 12-549-5 | Portaobjetos utilizados para disecciones |
| Placas puntuales PYREX | Plato | ||
| de disección de vidrio de 9 pocillosFiltro de jeringa Fisher | 21720-024 | ||
| Schneider, 0.22 y micro; m | EMD Millipore | SLGS033SB | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-500 | |
| Vectashield | Vector Labs | H-1000 Medio de montaje de | microscopía |
Referencias
- Khodjakov, A., Rieder, C. L. Imaging the division process in living tissue culture cells. Methods. 38 (1), San Diego, Calif. 2-16 (2006).
- Ong, J. Y., Torres, J. Z. Dissecting the mechanisms of cell division. The Journal of Biological Chemistry. 294 (30), 11382-11390 (....
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Reimpresiones y permisos
