Ensayo de regeneración y ablación láser basado en microscopio confocal en células interneuromas de peces cebra

Summary

La ablación láser es una tecnología ampliamente aplicable para el estudio de la regeneración en sistemas biológicos. El protocolo presentado describe el uso de un microscopio confocal de escaneo láser estándar para la ablación láser y la posterior imagen de lapso de tiempo de las células interneuromas regeneradoras en la línea lateral del pez cebra.

Abstract

Las células pilosas son células mecanosensoriales que median el sentido del oído. Estas células no se regeneran después del daño en los seres humanos, pero se reponen naturalmente en vertebrados no mamíferos como el pez cebra. El sistema de línea lateral de pez cebra es un modelo útil para caracterizar la regeneración de células capilares sensoriales. La línea lateral se compone de órganos que contienen células pilosas llamados neuromastas, que están unidos entre sí por una cadena de células interneuromas (INMCs). Los INMC actúan como células progenitoras que dan lugar a nuevos neuromastas durante el desarrollo. Los INMC pueden reparar huecos en el sistema de línea lateral creado por la muerte celular. Un método se describe aquí para la ablación selectiva INMC utilizando un microscopio confocal de escaneo láser convencional y peces transgénicos que expresan proteína fluorescente verde en INMCs. La microscopía de lapso de tiempo se utiliza para monitorear la regeneración de INMC y determinar la tasa de cierre de brechas. Esto representa un protocolo accesible para la ablación celular que no requiere equipo especializado, como un láser ultravioleta pulsado de alta potencia. El protocolo de ablación puede servir a intereses más amplios, ya que podría ser útil para la ablación de tipos de celdas adicionales, empleando un conjunto de herramientas que ya está disponible para muchos usuarios. Esta técnica permitirá además la caracterización de la regeneración del INMC en diferentes condiciones y a partir de diferentes orígenes genéticos, lo que avanzará en la comprensión de la regeneración celular progenitora sensorial.

Introduction

En el núcleo de la mayor pérdida auditiva progresiva se encuentra la destrucción de las células pilosas sensoriales, que transducen estímulos auditivos extrínsecos en impulsos nerviosos detectables por el cerebro. La muerte de las células pilosas cocleares causa pérdida auditiva permanente, ya que los mamíferos adultos carecen de la capacidad de regenerar estas células después del daño. Por el contrario, los vertebrados no mamíferos, como el pez cebra, pueden regenerar células pilosas perdidas por trauma acústico u insultos ototóxicos. La línea lateral mecanosensorial del pez cebra es un sistema de órganos simple y de fácil manipulación que se puede utilizar para estudiar la regeneración de células pilosas^1,2,3.

La línea lateral consiste en pequeños parches sensoriales llamados neuromastas, que están conectados durante el desarrollo por una cadena de células alargadas conocidas como células interneuromas (INMCs). Dada su capacidad proliferativa como células madre aparentes que dan lugar a nuevos órganos que contienen células pilosas, el comportamiento de los INMCs es de gran interés para la comunidad^4,5. Gran parte de la investigación relacionada con los INMC ha caracterizado la supresión de su proliferación por las células cercanas de Schwann que envuelven el nervio de la línea lateral, probablemente a través de un inhibidor de la señalización Wnt/β-catenin. ^6,7,8. Si bien la regulación de la proliferación y diferenciación de INMC en nuevos neuromastas ha sido bien descrita, los mecanismos que rigen el recrecimiento del INMC después de la ablación no han sido aclarados. Este protocolo sirve como un medio para ablar inmCs individuales y analizar su comportamiento regenerativo posterior.

Se han publicado una variedad de métodos para destruir las células pilosas, las células de apoyo y los neuromastas enteros, junto con metodologías para monitorear la recuperación. La ablación química funciona bien para las células pilosas, pero las dosis de sustancias químicas tóxicas como CuSO₄ deben aumentar significativamente para eliminar otros tipos de células de línea lateral⁹. Si bien la electroablación bajo microscopía de fluorescencia es un medio eficaz y simple de destruir a los INMC para estudiar la regeneración, es difícil apuntar de forma estrecha y, por lo tanto, es probable que produzca daños colaterales significativos. Como resultado, esto puede enmascarar aspectos de los comportamientos específicos de INMC^10,11. Se han empleado protocolos de ablación láser, pero requieren el uso de equipos especializados no necesariamente presentes en el laboratorio promedio o en la instalación de imágenes (es decir, láseres UV pulsados de alta potencia^12). El método descrito aquí se puede realizar con cualquier microscopio confocal de escaneo láser equipado con el láser común de 405 nm, generalmente utilizado para la toma de imágenes DAPI y otros fluoróforos azules. Una ventaja de este método es que las imágenes confocales se pueden realizar inmediatamente antes y después del daño celular sin involucrar ningún sistema de control láser adicional o transferirse a otro microscopio equipado con un láser pulsado.

Se ha descrito un método similar para las neuronas ablando en la médula espinal del pez cebra¹³. Sin embargo, el método anterior requiere un módulo FRAP para la ablación de la célula, que no es un requisito para este protocolo. Además, dadas las propiedades distintivas de diferentes tipos de células (es decir, brillo de fluorescencia transgénero, profundidad dentro del cuerpo y forma de celda), es probable que se necesiten modificaciones significativas dependiendo del tipo de celda utilizado. El protocolo detallado aquí es más probable que sea eficaz para las células más superficiales, como apoyado por una demostración de ablación de células del cabello sensorial utilizando el mismo método. También se describe un ensayo de regeneración para evaluar las tasas de recuperación del INMC después de la ablación, que no fue una característica del estudio antes mencionado.

El protocolo de ablación celular basado en láser detallado aquí captura la capacidad regenerativa de los INMC a través de la optimización de las condiciones del láser, las imágenes previas y posteriores a la ablación y la microscopía de lapso de tiempo. Estos elementos se unen para retratar de forma exhaustiva el recrecimiento de INMC y el cierre de brechas en su totalidad. Mientras que este protocolo se utiliza aquí para destruir inmCs, se puede aplicar a otro trabajo que requiere una evaluación confiable y eficaz de la ablación celular. También es una tecnología accesible, ya que se puede llevar a cabo en cualquier microscopio confocal equipado con un láser de 405 nm.

Protocol

Todo el trabajo animal fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Pace bajo el protocolo 2018-1.

1. Preparación de larvas de pez cebra

1. Configurar el apareamiento 3-5 días antes de llevar a cabo el experimento, de tal manera que las larvas serán 2 días después de la fertilización (dpf) a 4 dpf en edad cuando se montan para la ablación láser.
   NOTA: La línea de trampa potenciador Et(krt4:EGFP)sqEt20 (abreviada como ET20), en la que las células interneuromast están claramente etiquetadas con proteína fluorescente verde mejorada (eGFP), permite una identificación celular relativamente fácil y la ablación^11,14. Para la confirmación de la especificidad y flexibilidad de la ablación láser, los peces ET20 se crían con peces Tg(neuroD:tdTomato),en los que el nervio de línea lateral está etiquetado con proteína fluorescente roja o con Tg(myo6b:-actin-GFP) para etiquetar las células del cabello sensorial con GFP^15,16.
2. Después de la recolección de embriones al día siguiente, incubar embriones a 28,5 oC en un medio E3 que contenga 0,0001% de azul de metileno hasta que estén listos para anestesiar y montar.

2. Preparación de soluciones de agarosa y tricaína de baja gelificación

1. A un matraz Erlenmeyer de vidrio de 250 ml, añadir 48 ml de 1x E3 medio, 2 ml de solución de material de tricaina de 15 mM y 0,5 g de agarosa de baja fusión.
2. Microonda la solución en alto durante 30 s y remolino (usando guantes de protección contra el calor) para disolver la agarosa. Repita los ciclos de calentamiento de 30 s hasta que la agarosa se disuelva por completo.
3. Conservar la agarosa en una incubadora calentada a 42oC hasta que esté lista para su uso.

3. Anestesización de larvas de pez cebra

1. A un tubo cónico de 50 ml, añadir 24 ml de 1x E3 medio y 1 ml de solución de material de tricaína (15 mM) a una concentración final de 600 m. Swirl para mezclar.
2. Cargue uno de los seis pocillos de una placa de cultivo celular de fondo plano con 8 ml de E3 que contenga 600 m de tricaína.
3. Utilice una pipeta de transferencia para mover larvas de pez cebra en un inserto de transferencia con fondo de malla de 74 m.
4. Transfiera el inserto con fondo de malla en el pozo de la placa de seis pozos que contiene la solución de tricaína E3 +. Permita que las larvas permanezcan en el pozo durante un mínimo de 3 minutos o hasta que estén completamente anestesiadas. Pruebe la anestesia tocando el inserto. Las larvas no deben sobresolizar y nadar en respuesta al grifo.

4. Examen fluorescente de larvas de peces cebra anestesiadas

1. Pipetear una larva anestesiada por pozo en 12 toboganes bien recubiertos de hidrófobos para su cribado. Asegúrese de que haya una curvatura mínima del menisco formado en cada pozo de la diapositiva para reducir la distorsión óptica al cribado. Esto se puede hacer mediante la eliminación de un pequeño volumen de E3 de cada pozo después de colocar las larvas.
2. Bajo un objetivo 10x en un microscopio vertical (equipado con una lámpara de arco de mercurio, lámpara de halogenuros metálicos, o fuente de luz LED y un cubo de filtro apropiado), pantalla para larvas que expresan eGFP en los neuromastos y las células interneuromas del sistema de línea lateral.
   1. Seleccione larvas con una expresión más fuerte dando como resultado un eGFP más brillante, que presumiblemente son homocigotos para el transgén.
      NOTA: En la línea ET20, eGFP se expresa en un anillo de células del manto que rodea cada neuromast, así como la tira estrecha de células interneuromas que conectan estos órganos. Una expresión eGFP más fuerte (fluorescencia más brillante) contribuye a una ablación más eficaz.
   2. Para examinar la especificidad de la ablación, utilice larvas transgénicas dobles con los transgenes ET20 y Tg(neuroD:tdTomato). Si examina los portadores de Tg(neuroD:tdTomato), utilice el conjunto de cubos de filtro RFP para identificar un parche rojo brillante justo después de la oreja que representa el ganglio posterior de la línea lateral.
   3. Para ablar las células pilosas en los neuromastas de línea lateral, utilice la línea transgénica Tg(myo6b:-actin-GFP) y la pantalla para la localización de la GFP en el centro de cada neuromast.
3. Seleccione larvas con espaciado estereotipado de los neuromastas. Las diferencias en el espaciado entre los neuromastas pueden indicar una deposición neuromast anormal durante el desarrollo, lo que sugiere un comportamiento migratorio defectuoso o proliferación celular en la línea lateral primordium¹⁷. Estos defectos también pueden afectar el comportamiento migratorio o regenerativo de los INMCs después de la ablación.
   NOTA: Los defectos comunes en el espaciado incluyen una distancia inusualmente grande entre el neuromasta anterior más fuerte depositado por el primer primorreso migratorio (prim1L1) y el segundo neuromasta depositado por el mismo primordium (prim1L2), a menudo asociado con el hacinamiento de los neuromastos más posteriores.

5. Montaje de larvas para la ablación láser y la toma de imágenes

1. Pipetear 3 - 4 larvas anestesiadas en una pequeña gota de E3/tricaína solución en el centro de una cubierta de fondo deslizante (plato de 35 mm con un número de 14 mm 1,5 cubreobjencia). Retire el exceso de solución para que las larvas permanezcan en una gota pequeña, lo suficientemente grande como para contenerlas.
2. Transfiera el plato a la etapa de un microscopio estereomático binocular y manipule el zoom y el enfoque para que todas las larvas estén en el campo de visión.
3. Retire el matraz Erlenmeyer que contiene la baja agarosa del punto de fusión de la incubadora calentada. Utilice una pipeta de transferencia para transferir la solución de agarosa a la corredera de la cubierta para producir una capa delgada. Saca el exceso de agarosa hasta que el líquido llene el pozo en la parte inferior del plato, teniendo cuidado de no aspirar ninguna larva.
4. Coloca rápidamente las larvas en la solución de agarosa usando un cuchillo para el cabello o un lazo para el cabello para que estén alineadas entre sí y orientadas con rostral a la izquierda.
5. Presione suavemente las larvas contra el vidrio con el cuchillo de pelo, de manera que se acuestan con los lados derecho hacia abajo. Las larvas de más de 3 dpf tienden a flotar debido a sus vejigas de baño infladas, por lo que es posible que deban ser presionadas repetidamente contra el vidrio hasta que la agarosa comienza a gelear.
6. Después de unos 60 s la agarosa comenzará a solidificarse, y las larvas no podrán ser reorientadas. Deje aproximadamente 5 minutos a temperatura ambiente para que la agarosa en el resbalón de la cubierta se solidifique por completo. Una vez que la agarosa se haya solidificado, utilice una pipeta de transferencia para llenar el plato a mitad de camino con E3 que contiene 1x tricaína.

6. Localización de objetivos prospectivos e imágenes previas a la ablación

1. Encienda la alimentación del sistema de microscopía confocal de escaneo láser e inicialícelo a través del software de imágenes integrado. Seleccione el objetivo de inmersión de aceite Plan-Apochromat 63x (apertura numérica 1.40) o similar. Aplicar aceite de inmersión y asegurar el plato en una etapa circular inserto de tal manera que las larvas se enfrenten con su aspecto rostral a la izquierda.
2. En iluminación de contraste de interferencia diferencial o de campo brillante, seleccione una de las larvas montadas para la toma de imágenes. Ajuste el enfoque con la perilla de enfoque de tal manera que la piel en el lado del pez más cercano al cubreobjetos esté enfocada, reconocible por el patrón similar a la huella digital de las células de periderm.
3. Una vez en foco, cambie a la iluminación epifluorescente en el canal GFP. Localice la línea lateral posterior mediante la expresión GFP a lo largo del mioseptum horizontal. Los anillos de células fluorescentes indican células del manto neuromast, y las hebras alargadas de las células son células interneuromas.
4. Comenzando con el neuromasta primIL1, generalmente ubicado sólo dorsal a la yema, utilice el joystick de control de escenario u otro control de movimiento de la etapa para escanear visualmente caudalmente a lo largo del mioseptum horizontal.
   1. Siga la cadena de células interneuromas hasta llegar a la región entre los neuromastas primIL3 y primIL4 (L3 y L4) (Figura 1A).
      NOTA: Otras regiones también pueden ser objetivo, pero esta sección del tronco y la cola tiende a ser más cercana al vidrio de la cubierta y, por lo tanto, más susceptible a la ablación.
   2. Si toma imágenes de varias larvas, establezca la primera posición de la etapa y, a continuación, desactive la opción de varias posiciones de etapa anulando la selección de la casilla de verificación adecuada.
   3. Repita los pasos 6.4.1–6.4.2. para cada posición de etapa deseada (cada larva).
5. Una vez identificados los cuerpos celulares de la región L3-L4, cambie al modo de adquisición.
   1. Active una pista de imágenes GFP con el láser de 488 nm o 491 nm.
   2. Agregue un canal de luz transmitida (tubo fotomultiplicador de luz transmitida o T-PMT) a la pista láser de 488 nm activada activando la casilla de verificación T-PMT en el menú desplegable"Configuración de imágenes".
   3. Establezca la potencia del láser en 6%, el tamaño del agujero en 1 unidad airy equivalente y la ganancia digital en 750 para la toma de imágenes de larvas ET20. La ganancia exacta y la potencia del láser pueden variar para cualquier larva dada, dependiendo de lo cerca que estén montadas en el resbalón de la cubierta y del brillo de la fluorescencia. Ajuste la ganancia de tal manera que los cuerpos celulares estén saturados para capturar proyecciones tenues y filipodia.
   4. Ajuste los parámetros a un tamaño de fotograma de 1024 píxeles x 1024 píxeles, zoom digital de 0,7 (145,2 m x 145,2 mm de tamaño de imagen). Establezca un promedio de 2 para mejorar la calidad de la imagen.
6. Marque la casilla z-stack para abrir el menú desplegable de la posición z. Mientras exploras rápidamente, concéntrate hasta que las células interneuromas estén desenfocadas. Establezca la primera rebanada y, a continuación, concéntrese en la muestra hasta que las células interneuromas estén desenfocadas una vez más. Establezca el último sector. Asegúrese de que abarca una pila z de aproximadamente 25 m. Establezca el intervalo de imágenes en 1 m.
7. Inicie el experimento para capturar una pila z de preablación (Figura 1B). Si se han añadido posiciones de etapa, desactive la opción de posiciones para que solo se imagine la posición actual. Guarde el archivo una vez capturado.

7. Ablación láser de cuerpos celulares

1. Haga clic en"Mostrar todas las herramientas". Esta opción se encuentra en la parte superior de la interfaz de adquisición.
2. Haga clic en el menú desplegable para "Configuración de imágenes". En "Configuración de imágenes", haga clic en "Añadir una nueva pista" (representado como "+").
3. En "Configuración de imágenes", haga clic en el menú desplegable para "Tinte". Seleccione DAPI como tinte.
4. Haga clic en el menú desplegable de"Canales"y anule la selección de todas las demás pistas haciendo clic en sus respectivas casillas de verificación. Asegúrese de que solo está seleccionada la pista DAPI.
5. En la pista DAPI, haga clic en 405 para el" Configuración láser". Aumente la potencia del láser al 75%. Haga clic en el canal DAPI para apagar el láser mientras busca cuerpos de celda candidatos para la ablación.
6. Con el cuerpo de una celda interneuromast centrada en el campo de visión, haga zoom en el marco de escaneo a 20x–22x. Es posible que sea necesario ajustar la posición del marco para mantener el cuerpo de la celda en el centro a medida que se aplica el zoom. Detenga el escaneo en vivo tan pronto como el cuerpo de la celda llene el campo de visión.
   NOTA: El cuerpo de la celda debe ocupar todo el campo de visión. En este nivel de zoom, el GFP blanqueará rápidamente. Minimice el tiempo de exposición láser trabajando rápidamente. Utilice el zoom en lugar de seleccionar una región de interés para aumentar la distribución de energía láser en un área pequeña.
7. Marque la caja del obturador láser de 405 nm para activar la pista. Ajuste la potencia del láser al 75%. Ajuste un temporizador para 45 s. Active el escaneo continuo e inicie el temporizador. Deje de escanear inmediatamente a 45 s.

8. Imágenes posteriores a la ablación y microscopía de lapso de tiempo para estudiar la regeneración

1. Haga clic en el menú desplegable de "Canales". En los canales, desactive la pista "DAPI" para desactivar el láser de ablación. Haga clic en el menú desplegable para "Modo de adquisición".
2. En el modo de adquisición, haga clic en"Zoom".
3. Disminuya el zoom a 0.7 usando el control deslizante o escribiendo "0.7."
   1. Para garantizar una ablación celular exitosa, aumente la ganancia a 900 y escanee rápidamente el campo de visión.
      NOTA: Ningún GFP debe ser visible dentro de la celda o celdas de destino. Si todavía se observa fluorescencia, vuelva a los pasos 7.1–7.3.
   2. Utilizando la misma o similar configuración que las descritas para la creación de imágenes previas a la ablación, capture y guarde una imagen posterior a la ablación (Figura 1C). Si la imagen revela restos de células fluorescentes o cuerpos celulares adicionales que deben eliminarse, repita los pasos de ablación láser para crear un espacio visible en la cadena de células interneuromas.
   3. Inspeccione la imagen del canal T-PMT para confirmar aún más el daño celular. Las células dañadas tendrán un aspecto granular, y con frecuencia los núcleos se hinchan o se vuelven irregulares en su forma (Figura 2).
4. Después de capturar una imagen de preablación, ablar las celdas según sea necesario y capturar una imagen posterior a la ablación para cada posición de etapa individual, configure la microscopía de lapso de tiempo activando tanto la posición de la etapa como las opciones de tiempo para la captura de imágenes. Establezca los parámetros de tiempo en 24 h u otro punto final deseado y 15 minutos de intervalos. Inicie el experimento para adquirir imágenes y guardar el archivo resultante cuando se complete (al día siguiente).
5. Si las larvas deben estudiarse o elevarse, retírelas cuidadosamente de la agarosa utilizando fórceps finos, luego transfiera al medio E3 sin tricaína para su recuperación. Si no se van a utilizar más, eutanasiar de acuerdo con el protocolo animal aprobado (la inmersión rápida y sostenida en un baño de hielo es un método común) y deshacerse de ellos según lo requiera la institución.

9. Análisis de imagen

1. Abra un archivo z-stack posterior a la ablación en el software de procesamiento de imágenes preferido (Tabla de materiales). Divida los canales de forma que cada canal esté en un panel de visualización independiente.
2. En la ventana del canal GFP, utilice la herramienta de línea para dibujar una línea recta entre las puntas de los INMC restantes. Esto puede ser ayudado por desplazarse hacia arriba y hacia abajo a través de la pila z o realizando una proyección de intensidad máxima antes de dibujar la línea.
3. Utilice la herramienta"Medir"para obtener la distancia entre los extremos de INMC en los planos X e Y.
4. Desplácese por los sectores z de la pila z original para determinar la distancia entre los INMC en el plano z.
5. Calcular la distancia total entre los extremos de INMC utilizando el teorema de Pitágoras (a² + b² á c²). La hipotenusa es la distancia total (o tamaño de separación).
6. Introduzca la medición de distancia resultante en una aplicación de hoja de cálculo para el análisis de datos.
7. Revise los archivos de microscopía de lapso de tiempo recopilados en los pasos 8.2–8.3 utilizando el software de imágenes integrado en el sistema confocal o el software de análisis de imágenes de libre disposición. Identificar el punto de tiempo en el que la brecha entre las células interneuromas se llenó mediante proyecciones celulares. Esto puede ser ayudado por el examen de múltiples rodajas z para confirmar el cierre de la brecha en todas las dimensiones.
8. Para lograr la medición más precisa del tiempo hasta el cierre de huecos, utilice la marca de tiempo de la imagen posterior a la ablación (visible en Finder o Explorador de archivos) como punto de tiempo cero; tiempo de medición desde el comienzo de la pila de imágenes de lapso de tiempo puede resultar en un tiempo de subestimación para el cierre, dependiendo de cuánto tiempo haya transcurrido mientras se ablan posiciones de etapa adicionales, etc.
9. Derive la tasa de cierre simplemente dividiendo el tamaño de la brecha original por las horas o minutos necesarios para el cierre completo de la brecha.

Results

Con el fin de ablar los INMC y registrar la regeneración, las larvas de peces cebras de la línea transgénica ET20 se montaron en 2 o 3 días después de la fertilización para la ablación como se describe en el paso 5.4. Varios peces se pueden montar simultáneamente para que se puedan capturar varios lapsos de tiempo en un solo experimento. Se identificó la región de la línea lateral situada entre los neuronestos primIL3 y primIL4, y las imágenes de preablación se capturaron como se describe en los pasos 6.5–6.7(Figura 1A,B).

Tres cuerpos celulares fueron blanco de ablación láser para crear un hueco en la cadena INMC de aproximadamente 40 m. La exploración posterior a la ablación con alta ganancia y posteriores imágenes confirmó que no quedaban cuerpos celulares en la región ablada, dejando una brecha entre las proyecciones alargadas de los INMC adyacentes (Figura 1C). La muerte celular se demostró aún más examinando el canal T-PMT después de la ablación. Las células dañadas y moribundas estaban marcadas por núcleos hinchados y de forma irregular, así como una apariencia granular(Figura 2, esbozada). En algunos casos, las imágenes de lapso de tiempo también revelaron el reclutamiento de grandes células amoeboides que probablemente eran macrófagos(Figura 2, asterisco). Las áreas oscuras que rodean a los INMCblados indican fotoblandia en las células de periderm que se alvanecen. Estas células no parecían estar dañadas o destruidas por la irradiación láser en estos experimentos; más bien, su fluorescencia se redujo temporalmente. La microscopía de lapso de tiempo revela que estas células normalmente se recuperan después de la ablación y no cambian de forma o de otro modo parecen dañadas (resultados no publicados, Volpe et al.).

Para apoyar la especificidad de la destrucción del INMC, se realizaron ablaciones en larvas ET20 transgénicas dobles y Tg(neuroD:tdTomato) en las que el nervio de línea lateral (que corre sólo micrones por debajo de las células del interneuroma) está etiquetado con proteína fluorescente roja. Las ablaciones de varias células que crearon espacios considerables en la cadena INMC tuvieron poco o ningún efecto en el nervio de línea lateral basado en la fluorescencia roja (Figura 3). La flexibilidad de la técnica para ablar células superficialmente localizadas se demostró mediante la destrucción selectiva de células pilosas sensoriales individuales dentro de los neuromastos de la línea lateral. Utilizando esencialmente el mismo protocolo detallado anteriormente (secciones 7 y 8), las células monoer venosas en larvas transgénicas Tg(myo6b:-actin-GFP) fueron destruidas sin daño aparente a las células adyacentes (Figura 4). Las células del cabello abladadas no recuperaron la fluorescencia después de la microscopía de lapso de tiempo, y sus núcleos eran notablemente granulares y deformados después de la exposición al láser (Figura 4B). Al igual que las ablaciones inMC, los macrófagos aparentes fueron frecuentemente reclutados para el sitio de exposición láser (resultados inéditos, Volpe et al.).

Después de la ablación láser y la captura de imágenes posteriores a la ablación, el tamaño de la brecha se midió utilizando el software de análisis de imágenes disponible libremente. La herramienta de medición demostró tamaños de brecha que van desde unos pocos micras hasta 100 micras, dependiendo de la anchura de los INMC individuales y cuántas células fueron elegidas para la ablación (Figura 5). La microscopía Timelapse se empleó para registrar los comportamientos del INMC durante la regeneración. En 50 ensayos, 15 brechas (30%) se cerraron por regeneración en un período de 24 horas. En la mayoría de los casos, los INMC que pudieron recuperarse lo hicieron dentro de las primeras horas de la toma de imágenes. La recuperación se definió como el punto de tiempo en el que las proyecciones de las células vecinas entraron en contacto, lo que ocurrió 16 h después de la ablación para un intervalo de aproximadamente 40 m(Película 1). Las pilas Z se examinaron cuidadosamente para asegurarse de que el contacto entre células celulares se produjera dentro de un único plano z, evitando posibles artefactos debido a las proyecciones z. El análisis de regresión logística reveló que la probabilidad de cierre de brecha se correlacionó con el tamaño de la brecha (p a 0,0453), con espacios más pequeños que son más propensos a sanar. Una diferencia de 55,5 m dio lugar a una probabilidad de cierre del 50%(Figura 5).

En el 70% de los casos, las INMC no pudieron cerrar por completo la brecha creada por la ablación. Sin embargo, incluso en estos casos pudimos monitorear la formación de proyecciones largas de los INMC vecinos, que se asemejan en algunos aspectos extendiendo los conos de crecimiento neuronal (Película 2). Por lo tanto, estos experimentos también pueden proporcionar información sobre los comportamientos de los INMC después del daño.

Figura 1: Ablación selectiva de células interneuromas por irradiación láser. (A) Se seleccionaron células interneuromas entre los neuromastas primIL3 y primIL4 para la ablación. Estas celdas muestran una forma de husillo característica con proyecciones alargadas superpuestas que se superponen a los sólidos de celda adyacentes. (B) Las imágenes previas a la ablación identificaron los cuerpos celulares que podrían ser ablados para producir una brecha. (C) Las imágenes posteriores a la ablación confirman la ablación exitosa, como se indica en la ausencia de cuerpos celulares en la región de brecha. Barras de escala a 10 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Las imágenes posteriores a la ablación demuestran la muerte celular en respuesta a la exposición con láser en células interneuromas etiquetadas por GFP. Las imágenes fotomultiplicadoras de luz transmitida (T-PMT) indican la presencia de una célula necrótica con una apariencia granular (rodeada), así como el reclutamiento de células de forma irregular que son probables macrófagos (*). La fusión de los canales GFP y T-PMT confirma que la muerte celular y la actividad de los macrófagos ocurrieron en el lugar de la ablación. Barras de escala a 10 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Especificidad de la ablación interneuromast. (A) Células interneuromas etiquetadas por GFP previas a la AMG (verde) y nervio de línea lateral (rojo) con etiqueta tdTomato en un Tg(ET20) doble transgénico; Larva neuroD:tdTomato). Los cuerpos celulares cerca del nervio de la línea lateral fueron atacados para la ablación. (B) Las imágenes posteriores a la ablación demuestran la ablación de cuerpos celulares dirigidos con un nervio de línea lateral intacto. Barras de escala a 10 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Ablación de células pilosas sensoriales mediante microscopía confocal. (A) Las imágenes previas a la ablación identificaron una célula del cabello sensorial etiquetada por la GFP (*) destinada a la ablación en peces cebra Tg(ET20; myo6b:-actin-GFP) con etiqueta GFP. Las imágenes de tubos fotomultiplicadores de luz transmitida (T-PMT) revelan la morfología normal de las células pilosas, con una sección transversal redonda. (B) Las imágenes posteriores a la ablación confirman la ablación exitosa de la célula capilar objetivo. Una imagen T-PMT indica irregularidad en la forma de la célula del cabello y aumento de la granularidad después de la exposición al láser, lo que sugiere la muerte celular en lugar de la fotoblancada. Barras de escala a 10 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: La regresión logística modela la probabilidad de cierre de separación en función del ancho de la brecha (en m). Una puntuación de 0 representa el cierre de brechas completo, mientras que una puntuación de 1 representa el cierre de brecha incompleto. Los resultados indican que el efecto del ancho de la brecha en la capacidad de las células interneuromas para cerrar las brechas respectivas es estadísticamente significativo (p - 0,0453, n a 24 en total; n a 12 huecos cerrados, n a 12 brechas incompletamente cerradas). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Película 1: Microscopía de lapso de tiempo que demuestra el cierre de la brecha (40 m) después de 16 h. Las imágenes se capturaban cada 15 minutos, y se hacía una proyección z de intensidad máxima para todos los puntos de tiempo. Por favor, haga clic aquí para descargar este video.

Película 2: Microscopía de lapso de tiempo de una brecha INMC que no se cerraba. Se muestran las proyecciones alargadas y ramificadas de los INMC restantes. Por favor, haga clic aquí para descargar este video.

Discussion

El protocolo describe un método versátil para la ablación de células láser que se puede realizar en cualquier microscopio confocal equipado con un láser casi ultravioleta (longitud de onda de 405 nm). Este protocolo aborda las limitaciones de los métodos previamente empleados, como la electroablación (que causa daños más generalizados¹¹⁾y la ablación pulsada con láser UV (que requiere equipos especializados adicionales^12). Las imágenes confocales previas y posteriores a la ablación proporcionan una retroalimentación rápida con respecto al éxito del experimento. La posterior microscopía de lapso de tiempo ofrece un ensayo simple para la regeneración en un tipo de célula crítico para el desarrollo del sistema sensorial.

Es de vital importancia para el pez cebra transgénico que expresan fuertemente la GFP en los neuromastos y los INMC. Las larvas con fluorescencia brillante y aproximadamente un espaciado uniforme de los neuromastas derivados de la primI son candidatas ideales para la ablación con láser. Incluso en estos peces, ocasionalmente hay INMCs dimmer que al principio pueden escapar de la detección. Estas células pueden permanecer atrás después de la ablación láser, evitando la formación de una verdadera brecha entre los INMC. La ganancia digital debe ajustarse para revelar estas células dimmer durante la toma de imágenes previas a la ablación de modo que también puedan ser dirigidas con el láser de 405 nm (paso 8.2).

Del mismo modo, la segmentación por láser a veces no destruirá por completo una célula; más bien, blanqueará la fluorescencia, lo que resulta en un fracaso para crear una brecha real. Estas células generalmente aumentarán en fluorescencia durante la microscopía timelapse. El ajuste de la ganancia en el paso de imágenes posteriores a la ablación junto con la imagen T-PMT (Figura 2) ayudan a garantizar que todas las células dirigidas se hayan eliminado eficazmente. Con frecuencia requiere dos o tres ablaciones de celda individuales para producir una brecha en la cadena INMC. La muerte celular se puede detectar por blebbing o una apariencia granular en las células objetivo; aunque, esto puede requerir un breve período de espera después de la focalización láser (y en algunos casos, se observan cifras apoptóticas o necróticas aparentes poco después).

Una limitación de este procedimiento es que puede requerir múltiples ensayos experimentales antes de que se optimicen las condiciones del láser y la regeneración de INMC sea exitosa. La potencia láser y el tiempo total de permanencia del láser pueden requerir un ligero ajuste para diferentes muestras. Se ha encontrado que la aplicación excesiva de láser puede afectar la capacidad de la línea lateral para repararse a sí mismo. Esto incluye tanto 1) sobreexposición de células individuales a irradiación láser, presumiblemente causando daño adicional a los tejidos circundantes, así como 2) la ablación de demasiadas células en la cuerda, lo que conduce a una brecha más grande. Los usuarios deben lograr un equilibrio entre las células suficientemente irradiantes para asegurar su destrucción y no sobreexponer las células, lo que puede ralentizar o prevenir la regeneración. Con los ajustes apropiados, se ha encontrado que los INMC se pueden quitar sin daño visible al nervio de línea lateral posterior, lo que indica que el daño colateral se minimiza con este protocolo a diferencia de la electroablación¹¹. En ningún caso se observaron nuevos neuromastas que se formaron en la brecha, presumiblemente porque el nervio de línea lateral permanece intacto y las células gliales subyacentes permanecen e inhiben la proliferación de INMC^6,7,8,11.

Se ha demostrado que este método de ablación confórica con láser también se puede aplicar a otros tipos de células, particularmente en aquellos que se encuentran superficialmente dentro del animal, incluidas las células pilosas sensoriales (Figura 4). Se puede utilizar un protocolo similar para ablar las células de la piel para examinar la reparación de heridas o las neuronas para estudios de regeneración axonal, como se describió anteriormente¹³. Se prevé que esta técnica se convierta en una adición útil al repertorio experimental de laboratorios que poseen un microscopio confocal pero ningún otro equipo especializado para la ablación láser.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Portaobjetos impresos de PTFE de 12 pocillos	Ciencias de la microscopía electrónica	63425-05
15 mM Solución madre de tricaína	Sigma	E10521	15 mM Tricaína en agua de ósmosis inversa
1X E3 + 600 µ M Tricaína			Diluir 15 mM Stock de tricaína 25X en 1X E3
1X E3			Diluir 60X E3 medios a 1X en agua de ósmosis inversa (16,7 ml/L)
60 X E3 medios	los componentes comprados a Sigma-Aldrich		34,4 g Nacl, 1,52 g Kcl, 5,8 g CaCl2,2H2O, 9,8 g MgSO4.7H20 en agua de ósmosis inversa de 1 litro
Bx60 Microscopio compuesto con fluorescencia de lámpara de arco de mercurio Microscopio	Olympus
LSM 700 equipado con láseres de 405 nm, 488 nm y 555 o 561 nm	Carl Zeiss Microscopy, LLC		Para la ablación se utilizó un láser de 5 mW y 405 nm; Las ablaciones y las imágenes se realizaron a través de un objetivo Plan-Apochromat de 63x con un NA de 1.40
FIJI/ImageJ Software de procesamiento de imágenes	Múltiples colaboradores		Descargable en https://fiji.sc/
Aguja de disección modificada en cuchillo para el cabello	Fisher Scientific	19010	Se pegó una pestaña en el extremo de una aguja de disección con mango de madera
Software Microsoft Excel Microsoft	Corp.		Google Sheets es una alternativa gratuita a Microsoft
Excel Fondo de cristal Platos de 35 mm con cubreobjetos n.º 1,5, ventana de 20 mm	Mattek Corporation	P35G-1.5-20-C Placa de	Petri de 35 mm, ventana de vidrio de 20 mm
Immersol 518F Aceite de inmersión	Fisher Scientific	12-624-66A
Agarosa de baja gelificación Sigma	Life Science	A9414-256
Inserto Corning Netwell con malla de poliéster de 74 mmm, inserto de 24 mm	Millipore Sigma	CLS3479-48EA
Software Rstudio Rstudio	PBC		Descargable en https://rstudio.com/
SMX-168-BL Microscopio estereoscópico	Pipeta de transferencia Motic
	Software Fisher Scientific	13-711-7M
ZEN	Carl Zeiss Microscopy, LLC