Captura de ADN ambiental (eDNA) de muestras de agua por floculación

Resumen

El ADN ambiental (eDNA) generalmente se captura de muestras de agua mediante precipitación, filtración o floculación de alcohol. Aquí se presenta un protocolo alternativo que utiliza cloruro de lantano para permitir la recolección de ácidos nucleicos disueltos y unidos a partículas de muestras de agua que contienen células eucariotas, células procariotas y virus.

Resumen

El análisis del ADN ambiental (eDNA) se ha convertido en un enfoque ampliamente utilizado para la resolución de problemas en la gestión de especies. El objetivo es la detección de especies crípticas, incluidas las invasoras y/o las especies en riesgo, que normalmente se logran mediante el análisis del agua y los sedimentos para detectar la presencia de firmas características de ADN. Se requieren procedimientos confiables y eficientes para la captura de eDNA, especialmente aquellos que pueden ser realizados fácilmente en el campo por personal con capacitación limitada y científicos ciudadanos. La captura de eDNA mediante filtración por membrana es ampliamente utilizada en la actualidad. Este enfoque tiene problemas inherentes que incluyen la elección del material del filtro y la porosidad, el ensuciamiento del filtro y el tiempo requerido en el sitio para que se realice el proceso. La floculación ofrece una alternativa que puede implementarse y aplicarse fácilmente a los regímenes de muestreo que se esfuerzan por cubrir amplios territorios en un tiempo limitado.

Introducción

Antes de mediados de la década de 2000, el término "ADN ambiental" se utilizaba generalmente para referirse al ADN obtenido de los microbios del agua y del suelo, aunque se había comenzado a utilizar para la detección de ADN humano y animal con fines de rastreo de fuentes fecales o detección de especies no autóctonas ^1,2,3. En la actualidad, el ADN ambiental se utiliza generalmente para describir el ADN de las células desprendidas de organismos eucariotas, y el análisis de este ADN se ha convertido en una herramienta de gestión ampliamente ut....

Protocolo

1. Descontaminación de equipos y preparación de reactivos de floculación

1. Lave a fondo todas las botellas, tubos y otros equipos utilizados anteriormente con detergente para lavar platos y agua caliente.
2. Rocíe todas las botellas, tubos y otros equipos utilizados anteriormente con una solución de ácido cítrico al 6% para eliminar los depósitos minerales, deje reposar 20 minutos y enjuague con agua del grifo.
3. Añadir una solución de lejía doméstica diluida 10 veces (0,5-0,6% de concentración final de hipoclorito de sodio) a todos los biberones (aproximadamente el 10% del volumen del recipiente), agitar, dejar reposar al menos 1 hora, luego ....

Resultados

Se utilizaron ocho muestras de agua de 500 mL (450 mL cada una) tomadas de un acuario que albergaba dos tortugas pintadas orientales (Chrysemys picta picta) para preparar el eDNA utilizando el protocolo descrito. Otras ocho muestras de agua de 500 mL se filtraron sobre filtros de fibra de vidrio de 47 mm de porosidad de 1,5 μm que no contenían aglutinante y se extrajo el eDNA utilizando el mismo método de extracción utilizado para el protocolo de floculación. El ADN preparado con ambos métodos se analizó mediant.......

Discusión

Aunque esta técnica es sencilla, algunos pasos son fundamentales para el éxito. La recolección y transferencia de los flóculos debe hacerse por completo para no perder el ADN. El material residual debe recogerse mediante enjuagues estratégicos. El protocolo descrito utiliza un kit comercial de extracción de ADN para el procesamiento final del material floculado. Otros métodos de extracción pueden tener un rendimiento similar o pueden ser superiores en rendimiento, pero las modificaciones.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
0.5M EDTA, pH 8.0	Disponible de varias fuentes
1 x Tampón TE, pH 8.0	Disponible de varias fuentes
Tubos de centrífuga cónicos de 15 ml	Botellas
16 oz	Reutilizables con limpieza y descontaminación
Tapa de polipropileno 38/400 con sensible a la presión Deje	las tapas sueltas hasta que las use. Tape herméticamente para sellar el revestimiento sensible a la presión.
Tubos de centrífuga cónicos de 50 ml	un solo uso
	Úselo para eliminar los depósitos minerales de los frascos de muestra reutilizables.
Kit de microbios fecales/del suelo	Utilice resina o columna
Cloruro de lantano (III) heptahidratado	100 mM Solución
Bomba peristáltica de CC	Cualquier bomba peristáltica servirá, o se puede utilizar con un sifón
		poliacrílico	10% poliacrilamida
lineal Bicarbonato	de sodio1 M, esterilizado con filtro y almacenado a temperatura

comercialescomerciales cuadradas transparentes de PET de un solo uso de Solución de ácido cítrico al 6% de de eliminación de inhibidores madre Portador de ambiente