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Artículo de método

Eliminación de neuronas serotoninérgicas por inyección estereotáxica de 5,7-dihidroxitriptamina en el núcleo dorsal del rafe de ratones

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DOI:

10.3791/60968

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1 de mayo de 2020

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1Institute for Regenerative Medicine, Shanghai East Hospital, Frontier Science Center for Stem Cell Research, School of Life Sciences and Technology, Tongji University, 2Department of Ophthalmology, Shanghai Tenth People's Hospital Affiliated to Tongji University School of Medicine

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe un modelo de ratón lesionado por el núcleo del rafe dorsal (DRN) (tasa de supervivencia del >90% en ratones experimentales) con pérdida estable de neuronas serotoninérgicas del rafe dorsal mediante la inyección estereotáxica de 5,7-dihidroxitriptamina en el DRN utilizando un enfoque en ángulo para prevenir la lesión del seno sagital superior.

Resumen

La inyección estereotáxica se ha utilizado ampliamente para la administración directa de compuestos o virus a áreas específicas del cerebro en roedores. El ataque directo a las neuronas serotoninérgicas en el núcleo dorsal del rafe (DRN) puede causar sangrado excesivo y la muerte del animal, debido a su ubicación por debajo del seno sagital superior (SSS). Este protocolo describe la generación de un modelo de ratón con lesión neuronal serotoninérgica DRN (>tasa de supervivencia del 90%) con pérdida estable de células 5-HT positivas del >70% en el DRN. La lesión es inducida por la inyección estereotáxica de una neurotoxina serotoninérgica selectiva 5,7-dihidroxitriptamina (5,7-DHT) en el DRN utilizando un abordaje en ángulo (30° en la dirección anterior/posterior) para evitar lesiones en el SSS. Los ratones con lesiones neuronales serotoninérgicas DRN muestran alteraciones del comportamiento asociadas a la ansiedad, lo que ayuda a confirmar el éxito de la cirugía de la lesión DRN. Este método se utiliza aquí para las lesiones de DRN, pero también se puede utilizar para otras inyecciones estereotáxicas que requieren inyecciones angulares para evitar las estructuras de la línea media. Este modelo de ratón con lesión de neurona serotoninérgica DRN proporciona una herramienta valiosa para comprender el papel de las neuronas serotoninérgicas en la patogénesis de los trastornos psiquiátricos, como el trastorno de ansiedad generalizada y el trastorno depresivo mayor.

Introducción

La serotonina, o 5-hidroxitriptamina (5-HT), es un neurotransmisor importante producido principalmente en los intestinos y el cerebro e impacta una variedad de funciones psicológicas. En el sistema nervioso central (SNC), el sistema serotoninérgico desempeña un papel central en la regulación del estado de ánimo y el comportamiento social, el sueño y la vigilia, el apetito, la memoria y el deseo sexual. En el SNC, la serotonina es sintetizada por las neuronas serotoninérgicas, que se pueden separar en los dos grupos siguientes: el grupo rostral, que tiene proyecciones ascendentes que inervan prácticamente todo el cerebro; y el grupo caudal, que se proyecta principalmente a la médula espinal1. El grupo rostral, que contiene aproximadamente el 85% de las neuronas serotoninérgicas en el cerebro, está compuesto por el núcleo lineal caudal, el núcleo medio del rafe y DRN, en el que se encuentra la mayor población de neuronas serotoninérgicas en el cerebro.

En general, se cree que la desregulación del sistema serotoninérgico está relacionada con la patogénesis del trastorno depresivo mayor (TDM) y los trastornos de ansiedad generalizada (TAG)2. Esto se debe a que los inhibidores selectivos de la recaptación de serotonina (ISRS) son un tratamiento farmacológico eficaz para estos trastornos psiquiátricos 3,4. Además, las evidencias acumuladas sugieren que la manía5 y el comportamiento suicida6 pueden estar asociados con niveles más bajos de serotonina en el DRN. También se ha reportado que Pet1-Cre; Los ratonesLmx1b flox/flox y los ratones hTM-DTAiPet1 (modelos genéticos de ratón que carecen de la mayoría de las neuronas serotoninérgicas centrales de la etapa embrionaria tardía7 y la edad adulta8, respectivamente) muestran una memoria contextual de miedo mejorada. Sin embargo, a pesar de la extensa investigación, la participación exacta de las neuronas serotoninérgicas DRN en estos trastornos psiquiátricos aún no se ha dilucidado.

Con el fin de explorar los mecanismos por los cuales las neuronas serotoninérgicas DRN regulan la patogénesis de los trastornos psiquiátricos asociados a la serotonina, se han generado modelos animales. Se han aplicado herramientas optogenéticas para inhibir las neuronas serotoninérgicas en la DRN de ratas, y estos animales muestran unaumento de los comportamientos similares a la ansiedad. Sin embargo, la optogenética tiene limitaciones. Por ejemplo, se debe implantar un dispositivo de administración de luz en la región objetivo profunda del cerebro, y el tejido circundante puede lesionarse durante la cirugía de implantación o por el calor emitido por el dispositivo de luz. Incluso si la alteración de la temperatura puede no causar daño detectable en el tejido cerebral, aún puede inducirefectos fisiológicos y conductuales notables.

La manipulación farmacológica puede ser un enfoque más fácil para crear modelos animales lesionados por neuronas serotoninérgicas DRN. Algunos grupos han generado ratas con lesiones neuronales serotoninérgicas DRN mediante microinyección estereotáxica de neurotoxina serotonina 5,7-DHT en el DRN. Sin embargo, estos modelos de ratas muestran diferentes alteraciones del comportamiento, como el comportamiento ansiolítico11, el aumento del comportamiento similar a la ansiedad12 y el deterioro de la memoria de objetos13. A pesar de muchos estudios en ratas, se han realizado menos estudios sobre las influencias de la 5,7-DHT en ratones. Un grupo reportó una mortalidad excesiva (>50%) y una depleción limitada de serotonina en ratones experimentales que recibieron microinyecciones estereotáxicas de 5,7-DHT en el DRN14. Otro grupo informó que el estrés crónico leve impredecible (UCMS) puede inducir una alteración significativa de la latencia del ataque en ratones lesionados por DRN inducidos por 5,7-DHT. Sin embargo, no se proporcionaron resultados histológicos que confirmaran la pérdida exacta de neuronas serotoninérgicas en el DRN15. La inyección estereotáxica en la DRN mediante procedimientos estándar puede provocar una hemorragia masiva y una alta mortalidad en ratones, dado que la localización anatómica de la DRN está por debajo de la SSS16.

Este protocolo describe el protocolo para generar un modelo de ratón lesionado por neuronas serotoninérgicas DRN (tasa de supervivencia del >90% de los ratones experimentales) con pérdida estable de neuronas serotoninérgicas DRN mediante inyección estereotáxica de 5,7-DHT. La inyección en DRN utiliza un enfoque en ángulo para evitar la lesión del SSS. Esta cirugía provoca una pérdida constante del >70% de la neurona serotoninérgica en el DRN de los ratones, y produce alteraciones del comportamiento asociadas a la ansiedad. El protocolo utilizado aquí es para inducir lesiones de DRN, pero también puede ser útil para los investigadores que desean realizar inyecciones estereotáxicas en otras estructuras de la línea media. Además, este modelo de ratón con lesión de neurona serotoninérgica DRN proporciona una herramienta valiosa para comprender el papel de las neuronas serotoninérgicas en los trastornos psiquiátricos (es decir, TDM y TAG) y evaluar posibles agentes neuroprotectores o estrategias terapéuticas para estas afecciones.

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Protocolo

Todas las intervenciones quirúrgicas y los procedimientos de cuidado animal han sido aprobados por el Comité de Animales de la Escuela de Ciencias de la Vida y Tecnología de la Universidad de Tongji, Shanghai, China.

1. Alojamiento de animales

  1. Mantener ratones machos C57BL/6NCrl (10 semanas de edad, 25 g, n = 21) en condiciones estándar (24 °C de temperatura; 55% de humedad) bajo un ciclo de luz/oscuridad de 12 h/12 h.
  2. Proporcionar comida y agua ad libitum.
    NOTA: Aquí, tres de los ratones se utilizan para confirmar la huella de la aguja.

2. Preparación de reactivos

NOTA: Todos los pasos de preparación del medicamento deben realizarse en una campana de flujo laminar para evitar la contaminación. Todas las soluciones preparadas se almacenan en un congelador de -80 °C. Se recomienda usar una alícuota a la vez, descongelar completamente, mezclar bien antes de usar, desechar las sobras en el tubo y evitar la congelación y descongelación repetidas.

  1. Disuelva 0,25 g de clorhidrato de desipramina en 100 mL de solución salina al 0,9% para producir una solución de 2,5 mg/mL. Esterilice la solución utilizando un filtro de jeringa con membrana PES hidrofílica de 0,22 μm de tamaño de poro. A continuación, alícuota la solución (1,8 mL/tubo) en tubos de microcentrífuga (EP) de 2 mL. Etiquete, feche y almacene en un congelador a -80 °C inmediatamente. La dosis recomendada para uso animal es de 25 mg/kg.
  2. Disuelva 5 mg de 5,7-DHT en 1,67 ml de solución salina al 0,9% que contenga ácido ascórbico al 0,1% para obtener una solución de 3 μg/μL. Mezcle suavemente la solución con un filtro de jeringa (tamaño de poro de 0,22 μm) y alícuota la solución (10 μL/tubo) en tubos EP de 0,5 mL. Etiquete, feche y congele a -80 °C inmediatamente. La dosis recomendada para uso animal es de 2 μL/ratón.
  3. Disolver el ketoprofeno (analgésico) siguiendo el método descrito anteriormente17. Disuelva 250 mg de ketoprofeno en 15 mL de agua y 1 mL de NaOH 1 M, ajuste el pH a 7,3 y componga el volumen final a 125 mL, lo que dará como resultado una concentración final de 2 mg/mL. Esterilizar la solución con un filtro de jeringa de 0,22 μm y alícuota la solución (0,4 mL/tubo) en tubos EP de 1,5 mL. Etiquete, feche y congele a -80 °C hasta su uso. La dosis recomendada para uso animal es de 5 mg/kg.

3. Preparación de instrumentos y ratones

  1. Preparar un paquete quirúrgico (que contenga un bisturí, un par de pinzas de tejido, un par de tijeras, un portaagujas, suturas 3-0, crotales y aplicador de crotales) previamente esterilizado en autoclaves de alta temperatura. Coloque etanol al 75 %, povidona yodada, peróxido de hidrógeno al 3 %, solución vehicular (ácido ascórbico al 0,1 % en solución salina al 0,9 %), un hisopo de algodón, ungüento ofloxacino para los ojos y una jaula de recuperación para ratones encima de una almohadilla térmica, utilizando una jeringa Hamilton con una aguja de 32 G y una jeringa de 1 cc.
  2. h Antes de la inyección de 5,7-DHT, pesar y registrar el peso corporal de los ratones, luego someterlos a inyecciones intraperitoneales (I.P.) de desipramina (2,5 mg/mL, 10 μL/g de peso).
    NOTA: El propósito de la administración de desipramina 1 h antes de la inyección de 5,7-DHT es prevenir la pérdida de células catacolaminérgicas18.
  3. Anestesiar ratones con anestesia inhalatoria de isoflurano (3% durante la inducción, 1,5% durante el mantenimiento, caudal = 2 L/min). Administrar ketoprofeno (2 mg/mL, 2,5 μL/g de peso) mediante inyección subcutánea (s.c.). Confirme la profundidad adecuada de la anestesia por la ausencia de respuesta de pinzamiento de la cola.

4. Inyección estereotáxica

  1. Coloque el ratón anestesiado en la plataforma estereotáxica, luego fije su cabeza con las barras de los oídos y la barra de incisivos del aparato estereotáxico.
  2. Afeita la cabeza del ratón, luego limpia el cuero cabelludo expuesto con un exfoliante de etanol al 75% seguido de un exfoliante de povidona yodada.
  3. Aplique el ungüento de lidocaína en el cuero cabelludo con un hisopo de algodón para proporcionar analgesia local. Aplique el ungüento ofloxacino en los ojos para proteger la córnea.
  4. Hacer una incisión en el cuero cabelludo a lo largo de la línea media con un bisturí desde 1 mm detrás de los ojos hasta la línea interaural.
  5. Use un hisopo empapado en peróxido de hidrógeno al 3% para extraer el periostio, luego seque el cráneo y exponga las suturas craneales. Marque la ubicación del bregma y la lambda.
  6. Ajuste la posición de la cabeza con la barra incisiva hasta que el bregma y la lambda queden en el mismo plano horizontal. Ajuste la punta de la aguja para que toque el bregma o lambda, registre las coordenadas medial/lateral (ML) y dorsal/ventral (DV), y ajuste la barra de incisivos para que las coordenadas DV y ML de bregma y lambda sean iguales, respectivamente.
  7. Desbloquee el botón de posición perpendicular y el tornillo de bloqueo, luego ajuste el brazo del manipulador (eje z) a 30° en la dirección anterior/posterior (AP) como se muestra en la Figura 1A,B. Bloquee el botón.
  8. Fije la jeringa Hamilton llena de 2 μL de 5,7-DHT (3 μg/μL) en el soporte (para el grupo simulado, a los ratones se les inyecta solución salina al 0,9% que contiene ácido ascórbico al 0,1%). Ajuste la punta de la aguja para tocar el punto de referencia bregma, luego ponga a cero los valores ML, AP y DV usando el módulo de pantalla digital.
    NOTA: La solución de 5,7-DHT es un líquido de color marrón, por lo que es fácil determinar si la jeringa Hamilton está correctamente llena. Si no hay acceso a un módulo de visualización digital, registre el número que se muestra en tres ejes cuando la punta de la aguja toca el bregma, y las coordenadas finales representan "el número registrado más la coordenada proporcionada en este protocolo". Por ejemplo, si el número registrado en el brazo manipulador del eje Y (dirección A/P) es "a", entonces la coordenada final en la dirección A/P debe ser "a - 6.27".
  9. Mueva el brazo manipulador para ajustar la punta de la aguja a la posición de inyección (APa = -6,27, ML = 0; la fórmula para calcular las coordenadas finales se muestra en la Figura 1B). Marque la posición del objetivo con un rotulador.
  10. Taladre el orificio de la rebaba con un taladro de alta velocidad con micromotor portátil, luego mueva el brazo del manipulador para bajar la punta de la aguja al objetivo (DVa = -4.04). Inyecte 2 μL de la solución en el cerebro lentamente (0,5 μL/3 min), manteniendo la aguja in situ durante 5 min adicionales para evitar fugas de solución. Retire la aguja suavemente después de la inyección.
  11. Aplique suturas interrumpidas sobre la incisión usando suturas 3-0. Envuelva la incisión suturada con un hisopo de algodón empapado en povidona yodada para evitar infecciones.
  12. Limpie la oreja derecha con un hisopo de algodón de povidona yodada, luego aplique la etiqueta auricular esterilizada en la base de la oreja para su identificación.
  13. Retire los ratones experimentales del aparato estereotáxico y colóquelos en una jaula de recuperación de ratones encima de una almohadilla térmica hasta que se observe la recuperación completa de la anestesia.

5. Cuidados postoperatorios de ratones

  1. Sométase a los ratones a inyecciones s.c. de ketoprofeno 1 vez al día hasta 2 días después de la cirugía.
  2. Inspeccione a los ratones diariamente hasta 7 días después de la cirugía.

6. Prueba de laberinto en T elevado

NOTA: Realice la prueba como se ha descrito anteriormente19,20.

  1. Asegúrese de que la prueba de laberinto en T elevado (ETM) esté compuesta por dos brazos abiertos (30 cm x 5 cm x 0,5 cm) perpendiculares a dos brazos cerrados (30 cm x 5 cm x 16 cm x 0,5 cm) con una plataforma central (5,0 cm x 5,0 cm x 0,5 cm). Uno de los brazos cerrados está bloqueado por una lámina de plástico opaco para formar una forma de T (Figura 2A).
  2. Tres días antes de la prueba ETM, habitúe a los animales manipulándolos diariamente durante 5 min.
  3. El día 30 después de la cirugía, realice la prueba ETM.
  4. El día de la prueba de comportamiento, exponga a los ratones a uno de los brazos abiertos durante 10 minutos.
  5. Para las pruebas de evitación inhibitoria, coloque a cada ratón en el extremo distal del brazo encerrado y registre el tiempo que se tardó en dejar este brazo con cuatro patas en tres ensayos. El primer ensayo es la evitación inicial, el segundo ensayo es la evitación 1 y el tercer ensayo es la evitación 2.
  6. Mantenga a los ratones en sus jaulas durante 30 s entre senderos y establezca un tiempo límite (aquí, se usan 300 s para cada prueba).

7. Perfusión, fijación, tinción inmunohistoquímica y cuantificación

  1. Al final del estudio (35 días después de la cirugía, después de la prueba de comportamiento), realice la perfusión y fijación de todo el cuerpo una vez que el ratón esté bajo anestesia general.
    1. Anestesiar el ratón como se describe en el paso 3.3. Coloque el ratón profundamente anestesiado en decúbito dorsal.
    2. Humedece el pelaje con alcohol al 75% en toda la zona ventral.
    3. Haz un corte debajo del esternón seguido de una incisión en forma de V en la caja torácica. Agarre la caja torácica con la pinza para exponer el corazón.
    4. Inserte la aguja de infusión venosa en el ventrículo izquierdo, luego corte el apéndice auricular inmediatamente con unas tijeras para permitir que la sangre fluya.
    5. Encienda la bomba peristáltica para perfundir solución salina en todo el cuerpo a través del sistema circulatorio. Cambie de solución salina a paraformaldehído (PFA) al 4% cuando el líquido que sale de la aurícula derecha se vuelve transparente y cuando el hígado cambia de rojo a rojo pálido. Perfunde otros 5 mL de PFA al 4% cuando la cola del ratón se mueve y el cuerpo está rígido.
      NOTA: El balanceo de la cola del ratón es el signo de una perfusión adecuada.
  2. Aislamiento del cerebro después de la perfusión intracardíaca con PFA al 4%
    1. Decapita al ratón con unas tijeras grandes, luego corta la piel para exponer el cráneo.
    2. Haz dos cortes en la base del cráneo (conectados al cuello), haz un corte a lo largo de la línea que une los ojos, luego corta el cráneo a lo largo de la sutura sagital. Agarra y pela el cráneo de cada hemisferio hacia afuera para exponer el cerebro con fórceps.
      NOTA: El corte del cráneo a lo largo de la sutura sagital debe realizarse con cuidado, de lo contrario, el cerebro puede dañarse y separarse en partes.
    3. Extraiga el cerebro y colóquelo en PFA al 4% a 4 °C durante la noche para la posterior fijación, luego transfiera el cerebro a sacarosa al 30% hasta que se hunda hasta el fondo.
      NOTA: La deshidratación con sacarosa al 30% no es necesaria si las secciones se cortan con un vibrátomo.
  3. Absorba el exceso de líquido alrededor del pañuelo con una toalla de papel antes de incrustarlo. Incruste el tejido cerebral en OCT con la cara rostral en el mandril.
    NOTA: La orientación de la muestra es importante. La cara rostral del cerebro debe estar unida al mandril para asegurarse de que el filo sea la porción caudal.
  4. Corte una sección coronal del DRN (4,0-4,8 mm posterior del bregma) de 30 μm de espesor (intervalos de cuatro secciones) utilizando un criostato y recoja las secciones en PBS. Almacenar en una solución de criopreservación (SCS) en sección de cerebro a -20 °C.
    NOTA: La identificación del DRN es muy importante. Las estructuras anatómicas consecutivas se muestran en la figura 3A-H. Las estructuras características son las siguientes: receso lateral del cuarto ventrículo (LR4V, línea discontinua roja en la Figura 3A,E), cuarto ventrículo (4V, triángulo discontinuo rojo en la Figura 3B,F), segundo lóbulo cerebeloso (2Cb, estructura en forma de diamante con raya roja en la Figura 3C/G) y acueducto (Aq, orificio rojo en la Figura 3D,H). Comience a recolectar los tejidos cuando se observen las estructuras como se muestra en la Figura 3D, H, luego corte en secciones de 30 μm de espesor (intervalos de cuatro secciones) para producir 24 secciones coronales en total. La tinción de H&E de las secciones se muestra en la (Figura 3E-H). Se seleccionará la cuarta sección de cada una de las cuatro secciones para realizar la tinción inmunofluorescente. Las secciones restantes se almacenan en el SCS. Si es difícil reconocer las estructuras, es útil montar una pieza de las secciones en el portaobjetos.
  5. Realizar el ensayo inmunohistoquímico como se ha descrito anteriormente21,22.
  6. Cuente las células 5-HT positivas en diferentes niveles de sección a lo largo de todo el DRN utilizando ImageJ.

8. Análisis estadístico

  1. Utilice software estadístico para el análisis de datos. Expresar los resultados como medio ± SEM.
  2. Procese los valores para el análisis estadístico mediante ANOVA de dos vías o prueba t no apareada y considere las diferencias significativas a **p < 0.01.

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Resultados

En una sección coronal, la ubicación del DRN está justo debajo del SSS y el acueducto (Figura 1B,C); por lo tanto, dirigirse a la DRN utilizando procedimientos estándar puede conducir a una hemorragia masiva y una alta mortalidad en ratones16. Por lo tanto, las inyecciones estereotáxicas se realizaron aquí utilizando un abordaje en ángulo en lugar del abordaje vertical estándar para evitar daños en el SSS (Figura 1

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Discusión

Este protocolo describe con éxito la producción de un modelo de ratón con lesiones neuronales serotoninérgicas DRN fiable con alta reproducibilidad de la lesión y baja tasa de mortalidad. Apuntar al DRN es una tarea compleja, ya que puede dañar el SSS ubicado justo encima del DRN16 y provocar un sangrado excesivo e incluso la muerte14. Por lo tanto, las inyecciones estereotáxicas se realizaron ajustando el brazo de manipulación a 30° en la ...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por el Programa Nacional de Investigación y Desarrollo Clave de China [Números de subvención 2017YFA0104100]; la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China [subvención números 31771644, 81801331 y 31930068]; y los Fondos de Investigación Fundamental para las Universidades Centrales.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
filtro de jeringa de 0,22 micrasMilliporeSLGPRB
3% peróxido de hidrógenoCaoshanhu Co., Ltd, Jiangxi, China
5,7-dihidroxitriptaminaSigma-AldrichSML20583ug/ul, 2ul
Máquina compacta de anestesia para animales pequeñosRWD Life Science Co., LtdSerie
CriostatoLeica Biosystems, Wetzlar, AlemaniaCM1950
Cy 3 AffiniPure Donkey Anti-Cabra IgG (H + L)Jackson ImmunoResearch705-165-0031:2,000
dapiSigma-AldrichD8417
clorhidrato de desipraminaSigma-AldrichPHR172325 mg / kg
Tubo EppendorfCalidad Scientific Plastics509-GRD-Q
anticuerpo anti-5-HT de cabraAbcamab660471:800
Prisma GraphPadGraphpad Software Inc, CA, EE. UU.
Hamilton Jeringa de microlitroHamilton87943
KetoprofenoSigma-AldrichK1751-1G5 mg / kg
Ácido L-ascórbicoBBI Life SciencesA610021-05000.10%
ungüento de lidocaínaTsinghua Tongfang Pharmaceutical Co. LtdH20063466
ungüento ofloxacino para los ojosShenyang Xingqi Pharmaceutical Co.Ltd, ChinaH10940177
bomba peristálticaHuxi Analytical Instrument Factory Co., Ltd, Shanghai, ChinaHL-1D
RWD Life Science Co., Ltd68018
congelador de temperatura ultrabajaHaierDW-86L388
VórticeKylin-bellVORTEX-5
R500 Aparato estereotético

Referencias

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