Detección en situ del conjunto del complejo de ribonucleoproteína en la línea germinal de C. elegans utilizando el ensayo de ligadura de proximidad

Resumen

Este protocolo demuestra el uso del ensayo de ligadura de proximidad para sondear las interacciones proteína-proteína in situ en la línea germinal de C. elegans.

Resumen

Comprender cuándo y dónde se producen las interacciones proteína-proteína (IPP) es fundamental para comprender la función proteica en la célula y cómo se ven afectados procesos más amplios como el desarrollo. La línea germinal Caenorhabditis elegans es un gran sistema modelo para estudiar los IBP relacionados con la regulación de las células madre, la meiosis y el desarrollo. Existen una variedad de técnicas bien desarrolladas que permiten etiquetar proteínas de interés para su reconocimiento por anticuerpos estándar, lo que hace que este sistema sea ventajoso para las reacciones de ensayo de ligadura de proximidad (PLA). Como resultado, el PLA es capaz de mostrar dónde los IBP se producen de manera espacial y temporal en líneas germinales de manera más eficaz que los enfoques alternativos. Aquí se describe un protocolo para la aplicación y cuantificación de esta tecnología para sondear los IBP en la línea germinal c. elegans.

Introducción

Se estima que más del 80% de las proteínas tienen interacciones con otras moléculas^1,lo que hace hincapié en la importancia de los IBP para la ejecución de funciones biológicas específicas en la célula^2. Algunas proteínas funcionan como centros que facilitan el montaje de complejos más grandes que son necesarios para la supervivencia celular¹. Estos concentradores median múltiples IBP y ayudan a organizar las proteínas en una red que facilita funciones específicas en una celda^3. La formación de complejos proteicos también se ve afectada por el contexto biológico, como la pr....

Protocolo

NOTA: Este protocolo utiliza cepas de C. elegans en las que se etiquetan socios potenciales que interactúan. Se recomienda encarecidamente que se utilice una cepa de control negativo, en la que no se espera que una proteína etiquetada interactúe con otro compañero de interacción candidato etiquetado. Aquí, GFP solo se utilizó como un control negativo para evaluar el fondo, ya que no se espera que EL DLC-1 interactúe con GFP en el gusano. Se utilizó OMA-1 con la etiqueta GFP como cepa experimental, ya que los datos preliminares sugieren una interacción con DLC-1. Las cepas de nematodo que co-expresan el control y las proteínas de prueba con DLC-1 con 3xFLAG et....

Resultados

Co-inmunomanchado de ambos 3xFLAG::DLC-1; GFP y 3xFLAG::DLC-1; OMA-1::GFP germlíneas con anticuerpos FLAG y GFP revelaron sus patrones de expresión en la línea germinal(Figura 3Aii-iii,3Bii-iii). Mientras que la GFP se expresó a lo largo de la línea germinal(Figura 3Aiii), la expresión OMA-1::GFP se limitó al paquiteno tardío y a los ovocitos(Figura 3Biii)

Discusión

Cuando se estudian los IBP en la línea germinal de C. elegans, la mayor resolución ofrecida por el ELA en comparación con la inmunoinserización permite la visualización y cuantificación de lugares donde se producen interacciones en la línea germinal. Anteriormente se informó que el DLC-1 interactúa directamente con OMA-1 utilizando un ensayo desplegable in vitro del GST^26; sin embargo, esta interacción no fue recuperada por un pulldown in vivo. La co-inmunoinseración fluorescente.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Solución de paraformaldehído al 16% Servicios de	microscopía electrónica	15710	utilizado para hacer una solución de trabajo al 4%
1M KH2PO4	Sigma	P0662	Prepare un material de trabajo
1M 1x M9	varios	varios	preparados como 10x stock utilizado en 1x; ver wormbook.org para el protocolo
1x PBS	varios	varios ver	wormbook.org para el protocolo
Aguja de calibre 26.5	Exel International	26402	Agujas utilizadas para la disección
Tubos de centrífuga			50ml Tubo de centrífuga Oak Ridge utilizado para la sincronización
Microscopio confocal	Zeiss	880
Cubreobjetos para congelar muestras	Globe Scientific	1411-10	22x40mm, n.º 1
cubreobjetos para sellar portaobjetos	Globe Scientific	1404-15	22x22mm, n.º 1.5
DAPI Medio de montaje para vector de inmunofluorescencia		H-1200
Ligasa	Sigma-Aldrich	DUO82029	Duolink 1x Ligasa, viene como parte del kit rojo de reactivos de detección in situ Duolink DUO92008
Tampón rojo de amplificación	Sigma-Aldrich DUO82011		Duolink 5x Tampón rojo, viene como parte del kit rojo de reactivos de detección in situ Duolink DUO92008
tampón de ligadura	Sigma-Aldrich	DUO82009	tampón de ligadura Duolink 5x, viene como parte del kit rojo de reactivos de detección in situ Duolink DUO92008
diluyente de anticuerpos	Sigma-Aldrich	DUO82008	Diluyente de anticuerpos Duolink, viene con DUO92004 y DUO92002, Nota: También se puede usar una solución de 1x PBS/1% BSA como sustituto para diluir el anticuerpo.
Solución	de bloqueo Sigma-Aldrich	DUO82007	solución de bloqueo Duolink, viene con DUO92004 y DUO92002
medio de montaje para PLA	Sigma-Aldrich	DUO82040	Duolink Medio de montaje in situ con
sonda	Sigma-Aldrich DUO92004		Sonda in situ Duolink Sonda anti-ratón MINUS
PLUS	Sigma-Aldrich	DUO92002	Sonda in situ Duolink Tampón de lavado Anti-Rabbit PLUS
A	Sigma-Aldrich	DUO82046	Duolink Tampón de lavado in situ A Tampón
lavado B	Sigma-Aldrich	DUO82048	Duolink Tampón de lavado in situ B
Polimerasa	Sigma-Aldrich	DUO82030	Duolink Polimerasa, Viene como parte de los reactivos de detección in situ Duolink Kit rojo DUO92008
Microscopio epifluorescente	Leica		DFC300G cámara, DM5500B microscopio
Cabra anti-ratón Alexa 594	JacksonImmuno	115-585-146	Uso a 1:500
Cabra anti-conejo Alexa 488	JacksonImmuno	111-545-144	Uso a 1:200
Software de procesamiento de imágenes	Adobe		Adobe Photoshop + Illsutrator CS3
Pipeta de vidrio	Corning	7095B-5X
Levamisole	ACROS Orgánicos	187870100	Prepare un material de trabajo de 250 mM
Metanol	Fisher Scientific	A454
Ratón anti-FLAG	Sigma	F1804	Uso a 1:1000 para inmunofluorescencia y PLA, prebloqueo con suero de cabra normal
recomendado Esmalte de uñas	L.A. colores	CNP195
Medio de crecimiento de nematodos (NGM)	varios		Consulte wormbook.org para protocolo
Suero de cabra normal	JacksonImmuno	005-000-121
Polietileno Pasteur Pipeta	Globe Scientific	135030
Poly-L-Lisina	Sigma-Aldrich	P1524	Preparado como solución madre al 0,1% en agua, almacenado a -20 °C y diluido 1:100 en agua para recubrir portaobjetos
Placas de Petri Tritech		PD7060	60 mm de diámetro
Conejo anti-GFP	Thermo Fisher	G10362	Úselo a 1:200 para inmunofluorescencia, 1:4000 para portaobjetos de PLA
	Thermo Fisher	30-2066A-Brown	Los portaobjetos esterilizables en autoclave de tres cuadrados de 14x14 mm con barras se piden a medida a través de Fisher Scientific. Poly-L-Lisina añadida a portaobjetos en el laboratorio
Solución de hipoclorito de sodio	Toallitas	Fisher Scientific SS290-1
	Kimtech	34120	Toallitas de trabajo de 4,4x8,4 pulgadas
Bandejas (242x241x20mm)	Thermo Fisher		240845 Se utiliza para hacer cámara húmeda
Triton X-100	ACROS Organics	327372500
Agua ultrapura	Milli-Q		Agua ultrapura obtenida del sistema integral de purificación de agua Milli-Q
Watchglass	Carolina Biological	742300-20
° C congelador-80
° C congelador
Papel de aluminio
OP50 cepa E. coli
Orbital Shaker
Tape
cepas de nematodos utilizadas en este estudio (ambas disponibles a pedido)
mntSi13[pME4.1] II; unc-119(ed3) III; teIs1 [pRL475]		UMT 376	dlc-1 prom::3xFLAG::d lc-1::d lc-1 3'UTR; oma-1 prom::oma-1::GFP; Referencia 24
mntSi13[pME4.1] II; mntSi21[pXW6.22] unc-119(ed3) III		UMT 422	dlc-1 prom::3xFLAG::d lc-1::d lc-1 3'UTR; gld-1 prom::ceGFP::fbf-1 3'UTR + unc-119(+); Referencia: este estudio