Artículo de método

Detección en situ del conjunto del complejo de ribonucleoproteína en la línea germinal de C. elegans utilizando el ensayo de ligadura de proximidad

DOI:

10.3791/60982

⸱

5 de mayo de 2020

 ,  , 
1Division of Biological Sciences, University of Montana

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo demuestra el uso del ensayo de ligadura de proximidad para sondear las interacciones proteína-proteína in situ en la línea germinal de C. elegans.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Comprender cuándo y dónde se producen las interacciones proteína-proteína (IPP) es fundamental para comprender la función proteica en la célula y cómo se ven afectados procesos más amplios como el desarrollo. La línea germinal Caenorhabditis elegans es un gran sistema modelo para estudiar los IBP relacionados con la regulación de las células madre, la meiosis y el desarrollo. Existen una variedad de técnicas bien desarrolladas que permiten etiquetar proteínas de interés para su reconocimiento por anticuerpos estándar, lo que hace que este sistema sea ventajoso para las reacciones de ensayo de ligadura de proximidad (PLA). Como resultado, el PLA es capaz de mostrar dónde los IBP se producen de manera espacial y temporal en líneas germinales de manera más eficaz que los enfoques alternativos. Aquí se describe un protocolo para la aplicación y cuantificación de esta tecnología para sondear los IBP en la línea germinal c. elegans.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Se estima que más del 80% de las proteínas tienen interacciones con otras moléculas1,lo que hace hincapié en la importancia de los IBP para la ejecución de funciones biológicas específicas en la célula2. Algunas proteínas funcionan como centros que facilitan el montaje de complejos más grandes que son necesarios para la supervivencia celular1. Estos concentradores median múltiples IBP y ayudan a organizar las proteínas en una red que facilita funciones específicas en una celda3. La formación de complejos proteicos también se ve afectada por el contexto biológico, como la presencia o ausencia de socios interactuadores específicos4,eventos de señalización celular y la etapa de desarrollo de una célula.

C. elegans se utiliza comúnmente como un organismo modelo para una variedad de estudios, incluyendo el desarrollo. La simple anatomía de este animal se compone de varios órganos, incluyendo la gónada, el intestino y la cutícula transparente, que facilita el análisis del desarrollo del gusano. La germlina que reside en la gónada es una gran herramienta para estudiar cómo las células madre germinales maduran en gametos5 que se convierten en embriones y, finalmente, en la próxima generación de progenie. La región de la punta distal de la línea germinal contiene un grupo de células madre autonuevas(Figura 1). A medida que las células madre salen del nicho, progresan hacia el paquiteno meiótico y finalmente se convierten en ovocitos en la etapa adulta joven(Figura 1). Este programa de desarrollo en la línea germinal está estrechamente regulado a través de diferentes mecanismos, incluyendo una red reguladora post-transcripción facilitada por proteínas de unión al ARN (RBP)6. Los IBP son importantes para esta actividad regulatoria, ya que los PBP se asocian con otros cofactores para ejercer sus funciones.

Hay varios enfoques que se pueden utilizar para sondear los IBP en el gusano, pero cada uno tiene limitaciones únicas. La inmunoprecipitación in vivo (IP) se puede utilizar para aislar complejos de proteínas y proteínas de extractos de gusanos enteros; sin embargo, este enfoque no indica dónde se produce el IBP en el gusano. Además, los complejos proteicos que son transitorios y sólo se forman durante una etapa específica de desarrollo o en un número limitado de células pueden ser difíciles de recuperar por co-inmunoprecipitación. Por último, los experimentos de IP deben abordar las preocupaciones del reordenamiento complejo de proteínas después de la lisis y la retención no específica de proteínas en la matriz de afinidad.

Los enfoques alternativos para la detección in situ de IBP son la co-inmunoingestión, la transferencia de energía por resonancia de Farster (FRET) y la complementación de fluorescencia bimolecular (BiFC). La inmunoinserción se basa en la detección simultánea de dos proteínas de interés en el tejido de gusano fijo y la medición del alcance de la colocalización de la señal. El uso de la microscopía de superresolución, que ofrece un mayor detalle que la microscopía estándar7,ayuda a probar más rigurosamente la colocalización de proteínas más allá de la barrera limitada por difracción de 200-300 nm8. Sin embargo, la co-inmunomancha utilizando micromicroscopía convencional y de superresolución funciona mejor para proteínas con patrones de localización bien definidos. Por el contrario, se vuelve mucho menos informativo para los socios que interactúan distribuidas difusamente. La medición para la colocalización de señales basadas en la superposición no proporciona información precisa sobre si las proteínas están en complejo entre sí9,10.

Además, la co-inmunoprecipitación y la co-inmuno-inmunoinactividad de los complejos proteína-proteína no son cuantitativas, por lo que es difícil determinar si tales interacciones son significativas. FRET y BiFC son técnicas fluorescentes. FRET se basa en el etiquetado de proteínas de interés con proteínas fluorescentes (FP) que tienen superposición espectral en la que la energía de un FP (donante) se transfiere a otro FP (aceptador)11. Esta transferencia no radiativa de energía da lugar a la fluorescencia del FP aceptador que se puede detectar en su respectiva longitud de onda de emisión. BiFC se basa en la reconstitución de una proteína fluorescente in vivo. Implica dividir GFP en dos fragmentos complementarios, como hélices 1-10 y hélice 1112,que luego se fusionan en dos proteínas de interés. Si estas dos proteínas interactúan, los fragmentos complementarios de GFP se vuelven lo suficientemente cercanos como para plegarse y ensamblarse, reconstituyendo el fluoróforo de GFP. La GFP reconstituida se observa directamente como fluorescencia e indica dónde se ha producido un IBP.

Como tal, tanto FRET como BiFC dependen de grandes etiquetas fluorescentes que pueden alterar la función de la proteína etiquetada. Además, FRET y BiFC requieren una expresión abundante y comparable de las proteínas etiquetadas para obtener datos precisos. FRET puede no ser adecuado para experimentos en los que un socio es superior al otro, lo que puede conducir a un fondo alto13. También se debe evitar la sobreexpresión en experimentos DeFC, ya que esto puede inducir un ensamblado no específico14 que da lugar a un mayor fondo. Ambas técnicas requieren la optimización de las condiciones de expresión e imagen de las proteínas etiquetadas, lo que puede prolongar el tiempo necesario para completar los experimentos.

El ensayo de ligadura de proximidad (PLA) es un enfoque alternativo que puede abordar las limitaciones de las técnicas mencionadas anteriormente. PLA aprovecha los anticuerpos primarios que reconocen las proteínas de interés (o sus etiquetas). Estos anticuerpos primarios están enlazados por anticuerpos secundarios que contienen sondas de oligonucleótidos que pueden hibridarentrelazados entre sí cuando están dentro de una distancia de 40 nm (o más corta)15. El ADN hibridado resultante se amplifica a través de una reacción PCR, que es detectada por sondas que complementan el ADN. Esto da como resultado focos que son visualizados por un microscopio. Esta tecnología puede detectar IBP in situ en tejidos complejos (es decir, la gónada de gusano), que se organiza como una línea de ensamblaje que contiene células en varias etapas de desarrollo y diferenciación. Con PLA, los IBP se pueden visualizar directamente en una gónada de gusano fija, lo que es ventajoso para investigar si los IBP se producen durante una etapa específica de desarrollo. PLA ofrece una mayor resolución de los IBP en comparación con los ensayos basados en la colocalización, que es ideal para realizar mediciones precisas. Si se utiliza, la microscopía de superresolución tiene el potencial de proporcionar detalles más finos sobre la ubicación de los focos de PLA dentro de una célula. Otra ventaja es que los focos resultantes de las reacciones PLA pueden ser contados por un flujo de trabajo de análisis basado en ImageJ, haciendo que esta técnica sea cuantitativa.

La familia LC8 de cadenas ligeras de dynein fue descrita por primera vez como una subunidad del complejo de motores de dinin16 e hipotetizado para servir como adaptador de carga. Desde su descubrimiento inicial, LC8 se ha encontrado en múltiples complejos proteicos además del complejo motor de dinina17,,18,,19,,20. El escaneo de secuencias de proteínas que contienen el motivo de interacción LC819 sugiere que LC8 puede tener muchas interacciones con una amplia gama de diferentes proteínas17,,18,19,20,21,22. Como resultado, las proteínas de la familia LC8 ahora se consideran centros que ayudan a promover el ensamblaje de complejos proteicos más grandes19,,22, como ensamblajes de proteínas intrínsecamente desordenadas21.

Una proteína de la familia C. elegans LC8, cadena de luz de dinneina-1 (DLC-1), se expresa ampliamente en muchos tejidos y no se enriquece en estructuras subcelulares específicas23,24. En consecuencia, la identificación de socios in vivo biológicamente relevantes de DLC-1 en C. elegans es difícil por varias razones: 1) la coinmunoprecipitación no indica la fuente de tejido donde se produce la interacción; 2) la expresión limitada de socios particulares o las interacciones transitorias pueden obstaculizar la capacidad de detectar una interacción por coinmunoprecipitación; y 3) la distribución difusa de DLC-1 conduce a una superposición no específica con las proteínas potenciales asociadas mediante la inmunoingestión. Basado en estos desafíos, PLA es un enfoque ideal para probar interacciones in vivo con DLC-1.

Se ha informado previamente que DLC-1 interactúa directamente con y sirve como cofactor para las proteínas de unión al ARN (RBP) FBF-223 y GLD-125. Nuestro trabajo apoya el modelo de DLC-1 sirviendo como proteína de cubo y sugiere que DLC-1 facilita una red de interacción que abarca más allá de la dinin19,,22. Usando un ensayo desplegable GST, se ha identificado un nuevo RBP de interacción con DLC-1 denominado OMA-126. OMA-1 es importante para el crecimiento de ovocitos y la maduración meiótica27 y funciona en conjunto con una serie de represores y activadores traslacionales28. Mientras que FBF-2 y GLD-1 se expresan en las células madre y las regiones meioticas de paquiteno, respectivamente, OMA-1 se expresa difusamente en la línea germinal del paquiteno meiotico a través de los ovocitos27 (Figura 1). Esto sugiere que el DLC-1 forma los complejos con los RBP en las diversas regiones de la gónada. También se ha encontrado que la interacción directa entre DLC-1 y OMA-1 observada in vitro no se recupera mediante una IP in vivo. El PLA se ha utilizado con éxito como un enfoque alternativo para estudiar más a fondo esta interacción en la línea germinal de C. elegans, y los resultados sugieren que el PLA se puede utilizar para sondear muchos otros IBP en el gusano.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOTA: Este protocolo utiliza cepas de C. elegans en las que se etiquetan socios potenciales que interactúan. Se recomienda encarecidamente que se utilice una cepa de control negativo, en la que no se espera que una proteína etiquetada interactúe con otro compañero de interacción candidato etiquetado. Aquí, GFP solo se utilizó como un control negativo para evaluar el fondo, ya que no se espera que EL DLC-1 interactúe con GFP en el gusano. Se utilizó OMA-1 con la etiqueta GFP como cepa experimental, ya que los datos preliminares sugieren una interacción con DLC-1. Las cepas de nematodo que co-expresan el control y las proteínas de prueba con DLC-1 con 3xFLAG etiquetado se conocen en este texto como 3xFLAG::DLC-1; GFP y 3xFLAG::DLC-1; OMA-1::GFP (strains disponibles bajo petición; más información en Tabla de Materiales), respectivamente. Aquí, se utilizan las etiquetas 3xFLAG y GFP; sin embargo, otras etiquetas pueden ser sustituidas siempre y cuando sus anticuerpos sean compatibles con los reactivos del kit PLA.

1. Cuidado de animales

  1. Mantener los gusanos en las placas de medio de crecimiento de nematodos (NGM) que se sembran con la cepa OP50 de E. coli y mantener a 24 oC para una expresión óptima de GFP.
  2. Pasa gusanos adultos cada 2-3 días para propagar gusanos y mantenerlos bien alimentados.

2. Preparación de la cultura síncrona

  1. Sincronice los gusanos blanqueando un plato de hermafroditas gravitas bien alimentadas y gravídicas. Un protocolo de blanqueo se describe en Porta-de-la-Riva et al.29. Deje que los embriones eclosionen durante la noche en un tubo centrífugo a 24 oC mientras giran extremo sobre extremo en 10 ml de tampón de medios mínimos M9 (M9). Esto producirá un cultivo de larvas L1 arrestadas.
  2. Incubar el tubo de las larvas de etapa L1 arrestadas en hielo durante 10 minutos, luego rematar el tubo con hielo frío 1x M9.
  3. Utilice una centrífuga para peletizar las larvas a 600 x g durante 5 min a 4 oC. Aspirar cuidadosamente el sobrenadante de modo que sólo queda 1-2 mL de sobrenadante.
  4. Vuelva a suspender el pellet de larvas y utilice un micropipeta para transferir 2 ml de cultivo de larvas suspendidas a un tobogán de vidrio. Cuente cuántas larvas están presentes para determinar la densidad del cultivo de larvas, lo que ayudará a guiar la sembración de los gusanos en el paso 2.5.
    NOTA: Una densidad de 10-15 larvas de L1/1 L funciona bien para la sembración.
  5. Utilice una micropipeta para transferir el volumen de cultivo de larvas necesario para sembrar aproximadamente 100-120 larvas de etapa L1 en una placa OP50 de 60 mm. Por ejemplo, semillas de 10 l de un cultivo de larvas que tiene una densidad de 10 larvas de L1/1 l de cultivo.
    NOTA: No exceda un volumen de 40 l para sembrar las larvas, o el exceso de líquido interrumpirá el césped OP50. Si el volumen de cultivo supera los 40 l, repita los pasos 2.3-2.4 para reducir aún más el volumen y aumentar la densidad del cultivo de larvas.
  6. Cultivar gusanos a 24 oC. Registre el tiempo en que los L1 se sembran en la placa y compruebe periódicamente la etapa de desarrollo para identificar el momento ideal para la disección.
    NOTA: A las 52 h después de la sembración de L1s, los gusanos cultivados a 24oC se encuentran típicamente en la etapa de adulto joven, que es la etapa ideal para la disección de PLA dirigido a gónadas. Sin embargo, el tiempo real en el que los gusanos sincronizados llegan a la etapa adulta joven puede variar entre las cepas y la temperatura de incubación.

3. Extrusión de disección/gónada

NOTA: La disección para extruir la gónada es necesaria para que el PLA dirigido a las gónadas funcione correctamente. Este enfoque también puede liberar embriones, que también funcionan utilizando este protocolo para PLA (consulte Discusión para obtener más información). Después de la disección, tanto el control negativo como las muestras experimentales se fijan y tratan para PLA juntos en paralelo. También se sugiere que se prepare un conjunto adicional de muestras con el fin de la co-inmunomanchación fluorescente23 para demostrar los patrones de expresión de los socios proteicos de interés.

  1. Escoge 30-40 gusanos adultos jóvenes en un plato de vidrio de reloj que contenga 500 ml de 1x M9 + levamisol (concentración final de 2,5 mM). Después de recoger los gusanos, retire y deseche cuidadosamente la mayoría de los medios para eliminar las bacterias que se transfieren junto con los gusanos.
  2. Agregue los 500 l frescos de 1x M9 + levamisol y utilice la pipeta para elaborar y dispensar suavemente los medios para enjuagar los gusanos. Retire y deseche cuidadosamente la mayoría de los medios para eliminar las bacterias que se transfieren junto con los gusanos.
    1. Repita este paso 2x-3x hasta que se eliminen todas las bacterias. Una vez completados los lavados, deje los gusanos en unos 100 ml de medios para mantenerse hidratados.
      NOTA: No deje que los gusanos se sentén en medios durante más de 7 minutos, ya que esto perjudicará la extrusión de las gónadas durante la disección. Realizar lavados bajo la ayuda del microscopio de disección para monitorear la eliminación de medios de modo que los gusanos no se pierdan.
  3. Usando una pipeta de vidrio o polietileno, transfiera los gusanos a un portaobjetos de microscopio de 25 mm x 75 mm recubierto con 0,001% de poli-L-lisina (las diapositivas utilizadas en este procedimiento tienen un perímetro recubierto de epoxi, dejando tres espacios de trabajo, 14 mm x 14 mm cada uno). Retire el exceso de medios de modo que queden aproximadamente 10-15 l de medios.
  4. Bajo la ayuda de un microscopio de disección y utilizando dos agujas de calibre 261/2, coloque una aguja sobre la otra para que los extremos formen un par de tijeras. Usando agujas orientadas de esta manera, corta gusanos detrás de la faringe para liberar las líneas germinales. Diseccionar todos los gusanos en 5 minutos.
    NOTA: En una publicación anterior de Gervaise y Arur30se pueden encontrar más detalles sobre cómo realizar disecciones.
  5. Después de diseccionar todos los gusanos, coloque suavemente un cubreobjetos de 22 mm x 40 mm sobre la diapositiva para que sea perpendicular a la diapositiva. Los extremos de la cubierta deben colgar se de la corredera.
  6. Congele los portaobjetos en un bloque de aluminio pre-enfriado mantenido sobre hielo seco durante al menos 20 minutos. Coloque suavemente un lápiz frío encima de la cubierta para evitar que el cubreobjetos se afloje debido a la expansión del hielo.

4. Fijación/bloqueo

  1. Cuando esté listo para la fijación, deslice los labios de las cubiertas con un lápiz u otra herramienta de bordes romosos y sumerja inmediatamente el portaobjetos en un frasco que contenga metanol fresco y helado (refrigerado a -20 oC) durante 1 min.
  2. Limpie suavemente los bordes de la diapositiva que rodean la muestra para que el siguiente reactivo se mantenga por la tensión superficial alrededor de la muestra. Aplicar 150 l de fijativo (2% formaldehído en 100 mM KH2PO4, pH a 7,2) durante 5 min en RT.
    NOTA: También hemos probado un procedimiento de fijación de metanol/acetona31,32 y encontramos que es compatible con la reacción PLA.
  3. Toque la diapositiva hasta una toalla de papel en un ángulo perpendicular de 90o para dejar que el fijador se salga de la diapositiva y se absorba en la toalla de papel. Bloquee los portaobjetos 2x durante 15 minutos a RT en un tarro de Coplin con 50 ml de 1x PBS/1% Triton X-100/1% albúmina sérica bovina (PBT/BSA).
    NOTA: Se recomiendan frascos de coplina u otros tipos de frascos de tinción para este paso de bloqueo y los pasos de lavado que se indican a continuación en las secciones 6-9. Estos proporcionan volúmenes suficientes para el intercambio eficiente de bloqueo o tampón de lavado con la muestra.
  4. Bloquee los portaobjetos con una solución PBT/BSA que contenga un 10% de suero normal para cabras. Limpie suavemente los bordes que rodean la diapositiva y aplique 100 sl de la solución a la diapositiva. Incubar durante 1 h a RT en una cámara húmeda.
    NOTA: Este paso es muy recomendable para la tinción con el anticuerpo primario de la marca. La cámara húmeda se construye asegurando pipetas de vidrio con cinta adhesiva en la bandeja para que los portaobjetos se aunan mientras se incuban. Las toallitas de tarea amortiguadas(Tabla de materiales)se colocan en la bandeja para elevar la humedad interna de la bandeja para evitar la evaporación. La tapa y la bandeja están cubiertas de papel de aluminio para proteger las muestras de la luz durante los pasos sensibles a la luz.
  5. Coloque la diapositiva sobre una toalla de papel para dejar que la solución PBT/BSA/10%NGS se salga de la diapositiva y limpie suavemente los bordes de la diapositiva. Utilice el reactivo de bloqueo(Tabla de materiales) para bloquear diapositivas. Aplique una gota al espacio de 14 mm x 14 mm. Incubar toboganes durante 1 h a 37oC en una cámara húmeda.

5. Incubación de anticuerpos primarios

NOTA: Para obtener los mejores resultados de PLA y un fondo mínimo, el factor de dilución de los anticuerpos primarios puede requerir optimización (consulte Discusión para obtener más detalles). Además, los anticuerpos primarios deben elevarse en diferentes hosts que coincidan con la especificidad de los anticuerpos secundarios utilizados para el ELA.

  1. Coloque la diapositiva sobre una toalla de papel para dejar que el reactivo de bloqueo se salga de la diapositiva y limpie suavemente los bordes. Utilice el diluyente de anticuerpos(Tabla de materiales)para diluir los anticuerpos primarios. Aplicar 40 ml de solución de anticuerpos primarios por espacio de 14 mm x 14 mm.
  2. Incubar los toboganes en una cámara húmeda durante la noche a 4oC.

6. Sonda PLA (anticuerpo secundario) incubación

NOTA: Para los pasos 6-9, utilice los búferes de lavado A y B en RT. Si los buffers se almacenan a 4 oC, déjelos calentar a RT antes de usarlos.

  1. Lave los portaobjetos 2x durante 5 min con 50 mL de 1x tampón de lavado A(Tabla de Materiales)en RT en un tarro de Coplin. Ajuste el frasco de Coplin en un agitador orbital de 60 rpm.
  2. Coloque la diapositiva sobre una toalla de papel para dejar que el tampón de lavado se salga de la diapositiva y limpie suavemente los bordes. Preparar una solución de 40 l que contenga sondas PLUS y MINUS (diluida sin salida 1:5 con diluyente de anticuerpos). Aplique la solución a cada espacio de 14 mm x 14 mm.
  3. Incubar toboganes en una cámara húmeda durante 1 h a 37oC.

7. Ligadura

  1. Lave los portaobjetos 2x durante 5 min con 50 ml de tampón de lavado 1x A en RT en un frasco de Coplin. Ajuste el frasco de Coplin en un agitador orbital de 60 rpm.
  2. Diluir el tampón de ligación(Tabla de materiales)1:5 con agua ultrapura. Utilice este tampón para diluir la ligada(Tabla de materiales)1:40 para preparar un stock de trabajo de solución de ligadura.
    1. Coloque la diapositiva sobre una toalla de papel para dejar que el tampón de lavado se salga de la diapositiva y limpie suavemente los bordes. Aplicar 40 sl de la solución de ligadura a cada espacio de 14 mm x 14 mm.
  3. Incubar toboganes en una cámara húmeda durante 30 min a 37oC.

8. Amplificación

NOTA: El uso de reactivos de detección con fluoróforos rojos(Tabla de materiales)da como resultado la menor cantidad de fondo en el tejido C. elegans.

  1. Lave los portaobjetos 2x durante 5 min con 50 ml de tampón de lavado 1x A en RT en un frasco de Coplin. Ajuste el frasco de Coplin en un agitador orbital de 60 rpm.
  2. Diluir el tampón rojo de amplificación(Tabla de materiales)1:5 con agua ultrapura. Utilice este tampón para diluir la polimerasa(Tabla de materiales)1:80 para preparar un stock de trabajo de solución de amplificación y proteger de la luz.
    1. Coloque la diapositiva sobre una toalla de papel para dejar que el tampón de lavado se salga de la diapositiva y limpie suavemente los bordes. Aplicar 40 sde la solución de amplificación a cada espacio de 14 mm x 14 mm.
  3. Incubar toboganes en una cámara húmeda durante 1 h y 40 min a 37oC. Asegúrese de que la cámara húmeda esté cubierta con papel de aluminio para proteger las muestras de la luz.

9. Lavados finales

  1. Lave los portaobjetos 2x durante 10 min con 50 ml de 1ta de lavado B(Tabla de materiales)en RT en un frasco de Coplin. Ajuste el frasco de Coplin en un agitador orbital de 60 rpm.
  2. Lave los portaobjetos 1x durante 1 min con 50 ml de tampón de lavado B de 0.01x en RT en un frasco de Coplin. Ajuste el frasco de Coplin en un agitador orbital de 60 rpm. Este tampón se prepara diluyendo el tampón de lavado B con agua ultrapura.

10. Montaje en tapa

  1. Deje que el exceso de tampón de lavado se deslice fuera de la diapositiva sobre una toalla de papel y limpie cualquier tampón residual que quede en el perímetro recubierto de epoxi del tobogán.
  2. Añadir 10 l de medio de montaje(Tabla de materiales)para muestrear y poner suavemente un cubreobjetos en la parte superior, lo que permite que el medio de montaje se extienda.
  3. Pintar alrededor del borde de la cubierta con esmalte de uñas para sellar la cubierta y deslizar. Sea suave con la aplicación de esmalte de uñas para evitar mover el cubreobjetos, lo que dañará las líneas germinales. Deje que el esmalte de uñas se endurezque durante al menos 20 minutos en RT, mientras que las diapositivas están protegidas de la luz, antes de verlo bajo un microscopio.
  4. Almacene las diapositivas en un recipiente oscuro o portaobjetos, ya que las muestras etiquetadas con PLA son sensibles a la luz. El fabricante sugiere que las diapositivas se pueden almacenar a -20 oC para el almacenamiento a largo plazo o a 4 oC para el almacenamiento a corto plazo. Las diapositivas preparadas con este protocolo durarán al menos 2 meses cuando se almacenen a 20 oC.

11. Adquisición de imágenes

  1. Con el fin de cuantificar, utilice un microscopio confocal para capturar imágenes de líneas germinales extruidas que estén a la vista clara, sin daños y sin obstrucciones. Capture una pila z de la línea germinal que abarque toda la línea germinal en el plano z y genere una imagen de proyección máxima que se utilizará para la cuantificación.
    NOTA: La microscopía confocal es ideal para obtener y cuantificar imágenes PLA con menos fondo en comparación con las obtenidas mediante un microscopio epifluorescente.
    1. Si la línea germinal no cabe en un campo de visión, capture los campos de visión superpuestos según sea necesario para crear una imagen de toda la línea germinal. Las proyecciones máximas de estas imágenes se pueden unir en FIJI.
  2. Asegúrese de mantener las condiciones de imagen iguales entre muestras de control y experimentales para establecer un umbral justo y adecuado para la identificación de focos durante el análisis de imágenes.
    NOTA: Registre al menos 8-10 líneas germinales de cada muestra por réplica para facilitar el análisis estadístico de la cuantificación de PLA. Se recomiendan al menos tres réplicas biológicas para que el PLA obtenga resultados cuantitativos fiables y consistentes.

12. Análisis de imágenes y cuantificación utilizando FIJI/ImageJ

NOTA: El siguiente flujo de trabajo se basa en imágenes adquiridas con el objetivo 40x en un microscopio confocal, en el que las imágenes se guardan en el formato .czi. Estas imágenes .czi y sus metadatos adjuntos, incluidas las dimensiones, se pueden acceder y abrir en FIJI/ImageJ para su posterior análisis. Debe comprobarse si FIJI acepta el formato de los archivos confocales del confocal disponible para el usuario específico. Si no es así, las imágenes en el formato .tiff se pueden utilizar alternativamente para el análisis, pero el usuario tendrá que establecer la escala de la imagen manualmente en FIJI/ImageJ (Analizar Establecer escala). Se recomienda que todas las imágenes de control negativo se analicen juntas primero para establecer el nivel de fondo.

  1. Inicie el flujo de trabajo de análisis analizando primero todas las imágenes de control negativas y, a continuación, pase a las muestras experimentales. Abra una imagen de proyección máxima en FIJI/ImageJ para analizar(Figura 2A). Si utiliza un archivo .czi, se le pedirá un cuadro Opciones de importación de formatos biológicos.
    1. Incluya las siguientes opciones para abrir la imagen: pila de vistas con El Navegador de datos; modo de color : Coloreado. Ahora se debe abrir una ventana con la imagen con una barra deslizante para alternar entre los diferentes canales capturados por confocal (por ejemplo, DAPI o PLA).
    2. Si es necesario coser imágenes, cree duplicados de cada canal de cada imagen seleccionando a la derecha la imagen con el ratón y seleccionando Duplicar para abrir la ventana Duplicar. Especifique solo el número de canal (c) que corresponde al canal PLA o DAPI (por ejemplo, 2) y desmarque la casilla Duplicar hyperstack.
    3. Con ambas imágenes que se van a coser, seleccione Plugins ( Plugins) Cosidos ( Stitching) En desuso ? Costura 2D. Se abrirá la ventana Coser imágenes 2D. Seleccione qué imágenes se utilizarán para la costura y utilice los parámetros predeterminados que están predefinidos en la ventana y, a continuación, seleccione Aceptar. La imagen resultante será una imagen en escala de grises ensamblada.
      NOTA: Si las subimágenes no se alinean perfectamente, ajustando los parámetros (es decir, aumentando el número de picos que se comprobarán de 5 a 500 o cambiando el método de fusión de Fusión Lineal a Máx. Intensidad) puede ayudar a obtener la imagen deseada. Mientras que otras herramientas de costura están disponibles, este enfoque conserva la dimensionalidad de la imagen, que es importante para la cuantificación.
  2. Abra el administrador de ROI (Región de interés) pulsando T en el teclado. Se abrirá una nueva ventana denominada ROI Manager.
  3. Seleccione la herramienta poligonal en el cuadro Conjunto de herramientas FIJI. Puntos de caída alrededor de la línea germinal para delinearla y generar un ROI(Figura 2B). Conecte el último punto al primero para generar un ROI completo.
    NOTA: Para imágenes más oscuras, es útil ajustar el contraste para mejorar la visibilidad de la línea germinal (que es reversible) para que se pueda esbozar con mayor precisión.
    1. Inmediatamente después de completar el ROI, vaya al administrador de ROI y seleccione Agregar [t] para almacenar el ROI. Es imperativo que cualquier cambio en el ROI, incluida la adición/eliminación de puntos o el movimiento del ROI y los puntos, se actualice (seleccione Actualizar desde el administrador de ROI) antes de continuar con el siguiente paso, o se perderán. Puede encontrar más detalles sobre la manipulación de los ROI y sus puntos en la Guía del usuario de FIJI/ImageJ.
  4. Una vez establecida la orientación del ROI, se puede guardar para referencia posterior seleccionando el nombre del ROI en el gestor de ROI seguido de Más Guardar ? (archivo de nombre y especifique el destino para el lugar de guardado). Los ROI guardados se pueden abrir en el gestor de ROI seleccionando Más Abiertos ? (seleccione el archivo).
  5. Mida el área dentro del ROI seleccionando el nombre del ROI en el administrador de ROI y, a continuación, seleccionando el botón Medir en el gestor de ROI. Se abrirá una ventana Resultados con información sobre el ROI, incluido el área que cubre en la imagen (M2) (inset de la Figura 2B). Registre esta información en una hoja de cálculo para cálculos posteriores.
    NOTA: Asegúrese de que la escala de la imagen se ha ajustado correctamente para que se recopilen las dimensiones correctas del ROI. Los tipos de medidas que se han reportado en el cuadro Resultados se pueden modificar yendo a Analizar . Establecer medidas....
  6. Abra una imagen duplicada de sólo el canal PLA seleccionando a la derecha la imagen PLA y seleccionando Duplicar (Figura 2C). Se abrirá una ventana Duplicar. Especifique solo el número de canal (c) que corresponde al canal PLA (por ejemplo, 2) y desmarque la casilla Duplicar Hyperstack. Se recomienda la duplicación de esta imagen para que la imagen original no se modifique.
    NOTA: Estas opciones solo se mostrarán al ver las imágenes que contienen varios canales en FIJI/ImageJ. Un enfoque alternativo consiste en dividir los canales Imagen Color ( Color ) Dividir canales, pero esto modificará el archivo de imagen original.
  7. Con sólo la imagen del canal PLA seleccionada, vaya a Imagen . Ajustar ? Umbral. Se abrirá una ventana Umbral para la imagen. Seleccione Predeterminado como método de umbral, Rojo como color y active la casilla Fondo oscuro. Usando la pista superior en la ventana, deslice la barra hacia la derecha hasta que todos los focos PLA se resalten claramente en la imagen.
    1. Registre el valor en el cuadro a la derecha de la pista superior y tome nota de qué valor se utilizó para establecer el umbral. Seleccione Aplicar en la ventana Umbral para finalizar el umbral y la imagen se convertirá en un fondo blanco con solo los focos de umbral visibles como puntos negros(Figura 2D). Pruebe el umbral en varias imágenes de control negativo para asegurarse de que es adecuado para capturar todos los focos de PLA de imagen a imagen antes de la cuantificación.
      NOTA: Para ver los focos de umbral como puntos negros sobre fondo blanco, vaya a Proceso . Binario ? Opciones... y desmarque la casilla Fondo negro. Un valor umbral entre 30-40 es un buen punto de partida para identificar el PLA en la línea germinal; sin embargo, el valor ideal puede variar dependiendo del fondo.
  8. Para cuantificar los focos de PLA, aplique el ROI generado a partir de los pasos 12.3-12.3.1 a la imagen de umbral seleccionando el nombre del ROI en la ventana del gestor de ROI. El contorno del ROI debe aparecer en la imagen en la misma ubicación que era de la imagen de origen(Figura 2E).
    1. Ir a Analizar ?? Analizar partículas. Se abrirá la ventana Analizar partículas y seleccionará los siguientes parámetros: tamaño (micron.2) a 0-Infinity, circularidad: 0,00-1,00, mostrar á Nada. Marque la casilla Resumir.
    2. Seleccione Aceptary aparecerá una tabla Resumen con información sobre el ROI (es decir, el recuento total de focos de PLA, el área total ocupada por los focos de PLA dentro del ROI, el tamaño medio de los focos de PLA y el porcentaje de área ocupada por los focos de PLA en relación con el tamaño del ROI) (inicio de la Figura 2E). Registre estas mediciones en una hoja de cálculo.
  9. Repita los pasos 12.1-12.8 para varias imágenes de control negativo sin el mismo umbral.
    1. Una vez analizadas todas las imágenes de control negativo, repita los pasos 12.1-12.8 para todas las muestras experimentales utilizando el mismo umbral que fue determinado por el control negativo para identificar y cuantificar los focos de PLA.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Co-inmunomanchado de ambos 3xFLAG::DLC-1; GFP y 3xFLAG::DLC-1; OMA-1::GFP germlíneas con anticuerpos FLAG y GFP revelaron sus patrones de expresión en la línea germinal(Figura 3Aii-iii,3Bii-iii). Mientras que la GFP se expresó a lo largo de la línea germinal(Figura 3Aiii), la expresión OMA-1::GFP se limitó al paquiteno tardío y a los ovocitos(Figura 3Biii)

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cuando se estudian los IBP en la línea germinal de C. elegans, la mayor resolución ofrecida por el ELA en comparación con la inmunoinserización permite la visualización y cuantificación de lugares donde se producen interacciones en la línea germinal. Anteriormente se informó que el DLC-1 interactúa directamente con OMA-1 utilizando un ensayo desplegable in vitro del GST26; sin embargo, esta interacción no fue recuperada por un pulldown in vivo. La co-inmunoinseración fluorescente...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen conflictos de intereses.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Algunas cepas de nematodos utilizadas en este estudio fueron proporcionadas por el Centro de Genética Caenorhabditis financiado por el NIH (P40OD010440). La microscopía confocal se realizó en el Laboratorio de Investigación Core de la Universidad de Montana BioSpectroscopy operado con el apoyo de los NIH Awards P20GM103546 y S10OD021806. Este trabajo fue apoyado en parte por la concesión de NIH GM109053 a E.V., American Heart Association Fellowship 18PRE34070028 a X.W., y montana Academy of Sciences award a X.W. Los funders no participaron en el diseño del estudio ni en la redacción del informe. Agradecemos a M. Ellenbecker por su discusión.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Solución de paraformaldehído al 16% Servicios demicroscopía electrónica15710utilizado para hacer una solución de trabajo al 4%
1M KH2PO4SigmaP0662Prepare un material de trabajo
1M 1x M9variosvariospreparados como 10x stock utilizado en 1x; ver wormbook.org para el protocolo
1x PBSvariosvarios ver wormbook.org para el protocolo
Aguja de calibre 26.5Exel International26402Agujas utilizadas para la disección
Tubos de centrífuga50ml Tubo de centrífuga Oak Ridge utilizado para la sincronización
Microscopio confocalZeiss880
Cubreobjetos para congelar muestrasGlobe Scientific1411-1022x40mm, n.º 1
cubreobjetos para sellar portaobjetosGlobe Scientific1404-1522x22mm, n.º 1.5
DAPI Medio de montaje para vector de inmunofluorescenciaH-1200
LigasaSigma-AldrichDUO82029Duolink 1x Ligasa, viene como parte del kit rojo de reactivos de detección in situ Duolink DUO92008
Tampón rojo de amplificaciónSigma-Aldrich DUO82011Duolink 5x Tampón rojo, viene como parte del kit rojo de reactivos de detección in situ Duolink DUO92008
tampón de ligaduraSigma-AldrichDUO82009tampón de ligadura Duolink 5x, viene como parte del kit rojo de reactivos de detección in situ Duolink DUO92008
diluyente de anticuerposSigma-AldrichDUO82008Diluyente de anticuerpos Duolink, viene con DUO92004 y DUO92002, Nota: También se puede usar una solución de 1x PBS/1% BSA como sustituto para diluir el anticuerpo.
Soluciónde bloqueo Sigma-AldrichDUO82007solución de bloqueo Duolink, viene con DUO92004 y DUO92002
medio de montaje para PLASigma-AldrichDUO82040Duolink Medio de montaje in situ con
sondaSigma-Aldrich DUO92004Sonda in situ Duolink Sonda anti-ratón MINUS
PLUSSigma-AldrichDUO92002Sonda in situ Duolink Tampón de lavado Anti-Rabbit PLUS
ASigma-AldrichDUO82046Duolink Tampón de lavado in situ A Tampón
lavado BSigma-AldrichDUO82048Duolink Tampón de lavado in situ B
PolimerasaSigma-AldrichDUO82030Duolink Polimerasa, Viene como parte de los reactivos de detección in situ Duolink Kit rojo DUO92008
Microscopio epifluorescenteLeicaDFC300G cámara, DM5500B microscopio
Cabra anti-ratón Alexa 594JacksonImmuno115-585-146Uso a 1:500
Cabra anti-conejo Alexa 488JacksonImmuno111-545-144Uso a 1:200
Software de procesamiento de imágenesAdobeAdobe Photoshop + Illsutrator CS3
Pipeta de vidrioCorning7095B-5X
LevamisoleACROS Orgánicos187870100Prepare un material de trabajo de 250 mM
MetanolFisher ScientificA454
Ratón anti-FLAGSigmaF1804Uso a 1:1000 para inmunofluorescencia y PLA, prebloqueo con suero de cabra normal
recomendado Esmalte de uñasL.A. coloresCNP195
Medio de crecimiento de nematodos (NGM)variosConsulte wormbook.org para protocolo
Suero de cabra normalJacksonImmuno005-000-121
Polietileno Pasteur PipetaGlobe Scientific135030
Poly-L-LisinaSigma-AldrichP1524Preparado como solución madre al 0,1% en agua, almacenado a -20 °C y diluido 1:100 en agua para recubrir portaobjetos
Placas de Petri TritechPD706060 mm de diámetro
Conejo anti-GFPThermo FisherG10362Úselo a 1:200 para inmunofluorescencia, 1:4000 para portaobjetos de PLA
Thermo Fisher30-2066A-BrownLos portaobjetos esterilizables en autoclave de tres cuadrados de 14x14 mm con barras se piden a medida a través de Fisher Scientific. Poly-L-Lisina añadida a portaobjetos en el laboratorio
Solución de hipoclorito de sodioToallitasFisher Scientific SS290-1
Kimtech34120Toallitas de trabajo de 4,4x8,4 pulgadas
Bandejas (242x241x20mm)Thermo Fisher240845 Se utiliza para hacer cámara húmeda
Triton X-100ACROS Organics327372500
Agua ultrapuraMilli-QAgua ultrapura obtenida del sistema integral de purificación de agua Milli-Q
WatchglassCarolina Biological742300-20
° C congelador-80
° C congelador
Papel de aluminio
OP50 cepa E. coli
Orbital Shaker
Tape
cepas de nematodos utilizadas en este estudio (ambas disponibles a pedido)
mntSi13[pME4.1] II; unc-119(ed3) III; teIs1 [pRL475]UMT 376dlc-1 prom::3xFLAG::d lc-1::d lc-1 3'UTR; oma-1 prom::oma-1::GFP; Referencia 24
mntSi13[pME4.1] II; mntSi21[pXW6.22] unc-119(ed3) IIIUMT 422dlc-1 prom::3xFLAG::d lc-1::d lc-1 3'UTR; gld-1 prom::ceGFP::fbf-1 3'UTR + unc-119(+); Referencia: este estudio
de BSA Lampire 7500802 Thermo Scientific 05-529C Tarro Coplin PolyLab 62101 DAPI MINUS de de trabajo

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Berggård, T., Linse, S., James, P. Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions. Proteomics. 7 (16), 2833-2842 (2007).
  2. Nooren, I. M., Thornton, J. M. Diversity of protein-protein interactions. EMBO Journal. 22 (14), 3486-3492 (2003).
  3. Patil, A., Kinosselecta, K., Nakamura, H. Hub promiscuity in protein-protein interaction networks. International Journal of Molecular Science. 11 (4), 1930-1943 (2010).
  4. De Las Rivas, J., Fontanillo, C. Protein-protein interactions essentials: key concepts to building and analyzing interactome networks. PLoS Computational Biology. 6 (6), e1000807(2010).
  5. Pazdernik, N., Schedl, T. Introduction to germ cell development in Caenorhabditis elegans. Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 1-16 (2013).
  6. Nousch, M., Eckmann, C. R. Translational control in the Caenorhabditis elegans germ line. Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 205-247 (2013).
  7. Vangindertael, J., et al. An introduction to optical super-resolution microscopy for the adventurous biologist. Methods and Applications in Fluorescence. 6 (2), 022003(2018).
  8. Veeraraghavan, R., Gourdie, R. G. Stochastic optical reconstruction microscopy-based relative localization analysis (STORM-RLA) for quantitative nanoscale assessment of spatial protein organization. Molecular Biology of the Cell. 27 (22), 3583-3590 (2016).
  9. Thymiakou, E., Episkopou, V. Detection of signaling effector-complexes downstream of bmp4 using PLA, a proximity ligation assay. Journal of Visualized Experiments. (49), (2011).
  10. Wang, S., et al. Detection of in situ protein-protein complexes at the Drosophila larval neuromuscular junction using proximity ligation assay. Journal of Visualized Experiments. (95), 52139(2015).
  11. Algar, W. R., Hildebrandt, N., Vogel, S. S., Medintz, I. L. FRET as a biomolecular research tool - understanding its potential while avoiding pitfalls. Nature Methods. 16 (9), 815-829 (2019).
  12. Kodama, Y., Hu, C. D. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC): a 5-year update and future perspectives. Biotechniques. 53 (5), 285-298 (2012).
  13. Piston, D. W., Kremers, G. J. Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly. Trends in Biochemical Science. 32 (9), 407-414 (2007).
  14. Hiatt, S. M., Shyu, Y. J., Duren, H. M., Hu, C. D. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis of protein interactions in Caenorhabditis elegans. Methods. 45 (3), 185-191 (2008).
  15. Söderberg, O., et al. Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay. Methods. 45 (3), 227-232 (2008).
  16. Wilson, M. J., Salata, M. W., Susalka, S. J., Pfister, K. K. Light chains of mammalian cytoplasmic dynein: identification and characterization of a family of LC8 light chains. Cell Motility and Cytoskeleton. 49 (4), 229-240 (2001).
  17. Erdős, G., et al. Novel linear motif filtering protocol reveals the role of the LC8 dynein light chain in the Hippo pathway. PLoS Computational Biology. 13 (12), e1005885(2017).
  18. Navarro-Lérida, I., et al. Proteomic identification of brain proteins that interact with dynein light chain LC8. Proteomics. 4 (2), 339-346 (2004).
  19. Rapali, P., et al. DYNLL/LC8: a light chain subunit of the dynein motor complex and beyond. FEBS Journal. 278 (17), 2980-2996 (2011).
  20. Rapali, P., et al. Directed evolution reveals the binding motif preference of the LC8/DYNLL hub protein and predicts large numbers of novel binders in the human proteome. PLoS One. 6 (4), e18818(2011).
  21. Clark, S. A., Jespersen, N., Woodward, C., Barbar, E. Multivalent IDP assemblies: Unique properties of LC8-associated, IDP duplex scaffolds. FEBS Letters. 589 (19 Pt A), 2543-2551 (2015).
  22. Jespersen, N., et al. Systematic identification of recognition motifs for the hub protein LC8. Life Science Alliance. 2 (4), (2019).
  23. Wang, X., et al. Dynein light chain DLC-1 promotes localization and function of the PUF protein FBF-2 in germline progenitor cells. Development. 143 (24), 4643-4653 (2016).
  24. Dorsett, M., Schedl, T. A role for dynein in the inhibition of germ cell proliferative fate. Molecular Biology of the Cell. 29 (22), 6128-6139 (2009).
  25. Ellenbecker, M., et al. Dynein Light Chain DLC-1 Facilitates the Function of the Germline Cell Fate Regulator GLD-1 in Caenorhabditis elegans. Genetics. 211 (2), 665-681 (2019).
  26. Day, N. J., Ellenbecker, M., Voronina, E. Caenorhabditis elegans DLC-1 associates with ribonucleoprotein complexes to promote mRNA regulation. FEBS Letters. 592 (22), 3683-3695 (2018).
  27. Detwiler, M. R., Reuben, M., Li, X., Rogers, E., Lin, R. Two zinc finger proteins, OMA-1 and OMA-2, are redundantly required for oocyte maturation in C. elegans. Developmental Cell. 1 (2), 187-199 (2001).
  28. Spike, C. A., et al. Translational control of the oogenic program by components of OMA ribonucleoprotein particles in Caenorhabditis elegans. Genetics. 198 (4), 1513-1533 (2014).
  29. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), (2012).
  30. Gervaise, A. L., Arur, S. Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline. Journal of Visualized Experiments. (117), (2016).
  31. Duerr, J. S. Antibody staining in C. elegans using "freeze-cracking". Journal of Visualized Experiments. (80), (2013).
  32. Crittenden, S., Kimble, J. Preparation and immunolabeling of Caenorhabditis elegans. Cold Spring Harbor Protocols. (5), (2009).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este artículo de JoVE

Solicitar permiso

Etiquetas

Protein Protein InteractionsWorm DissectionConfocal MicroscopyImageJ QuantificationAntibody IncubationFluorescent LabelingGermline DevelopmentSpatial Temporal Analysis

Artículos relacionados