El transporte axonal es un mecanismo crucial para la salud de las neuronas motoras. En este protocolo proporcionamos un método detallado para el seguimiento del transporte axonal de compartimentos ácidos y mitocondrias en axons de neuronas motoras utilizando cámaras microfluídicas.
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Artículo de método
Transporte axónico de organelos en cultivos de neuronas motoras utilizando el sistema de cámaras microfluídicas
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
Las neuronas motoras (MN) son células altamente polarizadas con axones muy largos. El transporte axonal es un mecanismo crucial para la salud de la MN, contribuyendo al crecimiento neuronal, desarrollo, y la supervivencia. Describimos un método detallado para el uso de cámaras microfluídicas (MFC) para el seguimiento del transporte axonal de orgánulos etiquetados fluorescentemente en axones MN. Este método es rápido, relativamente barato, y permite el monitoreo de señales intracelulares en el espacio y el tiempo. Describimos un protocolo paso a paso para: 1) Fabricación de MFC de polidimetilsiloxano (PDMS); 2) Revestimiento de explantes de la médula espinal ventral y cultivo disociado MN en MFC; 3) Etiquetado de mitocondrias y compartimentos ácidos seguidode de imaginación confocal viva; 4) Análisis manual y semiautomatizado del transporte axonal. Por último, demostramos una diferencia en el transporte de mitocondrias y compartimentos ácidos de HB9::GFP de la médula espinal ventral explantó axons como prueba de la validez del sistema. En conjunto, este protocolo proporciona una herramienta eficaz para estudiar el transporte axonal de varios componentes axonales, así como un manual simplificado para el uso de MFC para ayudar a descubrir posibilidades experimentales espaciales.
Introducción
Las MN son células altamente polarizadas con axones largos, alcanzando hasta un metro de largo en humanos adultos. Este fenómeno crea un desafío crítico para el mantenimiento de la conectividad y la función MN. En consecuencia, los MN dependen del transporte adecuado de información, orgánulos y materiales a lo largo de los axones desde su cuerpo celular hasta la sinapsis y la espalda. Varios componentes celulares, como proteínas, ARN y orgánulos, se transportan regularmente a través de los axones. Las mitocondrias son orgánulos importantes que se transportan rutinariamente en MNs. Mitocondrias son esenciales para la actividad adecuada y el funcionamiento de los MN, re....
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Protocolo
El cuidado y tratamiento de los animales en este protocolo se llevó a cabo bajo la supervisión y aprobación del Comité Universitario de Ética Animal de Tel Aviv.
1. Preparación MFC
- Fundición PDMS en moldes primarios (Figura 1)
- Comprar o crear moldes primarios (wafers) siguiendo un protocolo detallado9.
- Utilice aire presurizado para eliminar cualquier tipo de suciedad de la plataforma de obleas antes de proceder al paso de recubrimiento. La superficie de las obleas debe verse lisa y clara.
- Llene un recipiente con 50 ml de nitrógeno líquido. Prepare ....
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Resultados
Siguiendo el protocolo descrito, los explantes de la médula espinal embrionario de ratón HB9::GFP se cultivaron en MFC(Figura 4A). Los explantas se cultivaron durante 7 días, cuando los axons se cruzaron completamente en el compartimiento distal. Se añadieron colores rojos Mitotracker Deep Red y Lysotracker a los compartimentos distales y proximales para etiquetar las mitocondrias y los compartimentos ácidos(Figura 4
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Discusión
En este protocolo, describimos un sistema para rastrear el transporte axonal de mitocondrias y compartimentos ácidos en las neuronas motoras. Esta plataforma in vitro simplificada permite un control, monitoreo y manipulación precisos de los compartimentos neuronales subcelulares, lo que permite el análisis experimental de las funciones locales de las neuronas motoras. Este protocolo puede ser útil para el estudio de enfermedades MN como la ELA, para centrarse en la comprensión del mecanismo subyacente de la disfunción de.......
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Divulgaciones
Los autores no declaran conflicto de intereses.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación Israel Science (ISF, 561/11) y del Consejo Europeo de Investigación (ERC, 309377).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Plato fluorescente de 35 mm y plato con fondo de vidrio | World Precision Instruments WPI | FD35-100 | |
| Plato fluorescente de 50 mm y plato con fondo de vidrio | World Precision Instruments WPI | FD5040-100 | |
| Andor iXon DU-897 Cámara EMCCD | Andor | ||
| ARA-C (Citosina β-D-arabinofuranósido) | Sigma-Aldrich | C1768 | stock de 2mM en filtrado DDW |
| B-27 Suplemento (50X) | Thermo Fisher | 17504044 | |
| BDNF | Alomone Labs | B-250 | Diluido a 10 µ g/mL en ddw filtrado con 0.01% BSA) |
| Punzón de biopsia de 1.25 mm | World Precision Instruments WPI | 504530 | Para la preparación de grandes MFC |
| Punzón de biopsia de 6 mm | World Precision Instruments WPI | 504533 | Para la preparación de pequeños |
| MFC Punzón de biopsia de 7 mm | World Precision Instruments WPI | 504534 | Para la preparación de MFC de gran |
| tamaño Bitplane Imaris software - versión 8.4.1 | Albúmina sérica bovina Imaris | ||
| (BSA) | Sigma-Aldrich | #A3311-100G | 5% p/v en ddw |
| Clorotrimetilsilano | Sigma-Aldrich | #386529-100ML | |
| CNTF | Alomone Labs | C-240 | Diluido a 10 y micro; g/mL en DDW filtrado con 0.01% BSA) |
| Medio de gradiente de densidad - Optiprep | Sigma-Aldrich | D1556 | |
| Desoxirribonucleasa I (ADNasa) de páncreas bovino | Sigma-Aldrich | DN-25 | stock 10mg/mL en neurobasal |
| Dow Corning Grasa de silicona de alto vacío | Sigma-Aldrich | Z273554-1EA | Para la preparación de moldes epoxi |
| DPBS 10X | Thermo Fisher | #14200-067 | Diluir 1:10 en DDW |
| Pinza fina Dumont #55 0.05 × 0.02 mm | F.S.T | ||
| Endurecedor epoxi | Trias Chem S.R.L | IPE 743 | Para la preparación de moldes epoxi |
| Resina epoxi | Trias Chem S.R.L | RP 026UV | Para la preparación de moldes epoxi |
| FIJI software ImageJ | |||
| GDNF | Alomone Labs | G-240 | Diluido a 10 µ g/mL en DDW filtrado con 0.01% BSA) |
| Glutamax 100X | Thermo Fisher | #35050-038 | |
| HB9:GFP cepa de ratones Jackson | Laboratories | 005029 | |
| HBSS 10X | Thermo Fisher | #14185-045 | Diluir 1:10 en ddw con adición de 1% P/S y filtro |
| iQ software | Tijeras Andor | ||
| Iris, curvadas, 10 cm | AS Medizintechnik | 11-441-10 | |
| Tijeras de iris, rectas, 9 cm | AS Medizintechnik | 11-440-09 | |
| Laminina | Sigma-Aldrich | #L-2020 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Thermo Fisher | 11415064 | |
| LysoTracker Red | Thermo Fisher | L7528 | |
| Mitotracker Deep-Red FM | Thermo Fisher | M22426 | |
| Medio neurobasal | Thermo Fisher | 21103049 | |
| Nikon Eclipse Ti micorscope Nikon | |||
| Solución de penicilina-estreptomicina (P/S) | Biological Industries | 03-031-1 | |
| Poly-L-Ornithin (PLO) | Sigma-Aldrich | #P8638 | Diluido 1:1000 en flitered 1X PBS |
| Sylgard 184 kit de elastómero de silicona | DOW Corning Corporation | #3097358-1004 | |
| Tripsina de páncreas bovino | Sigma-Aldrich | T1426 | stock 25 mg/mL en |
| tijeras de microdisección de resorte Vannas 1XPBS, hoja de 3 mm | F.S.T | 15000-00 | |
| Yokogawa CSU X-1 | Yokogawa |
Referencias
- Misgeld, T., Schwarz, T. L. Mitostasis in Neurons: Maintaining Mitochondria in an Extended Cellular Architecture. Neuron. 96, 651-666 (2017).
- Devine, M. J., Kittler, J. T. Mitochondria at the neuronal presynapse in health and disease. Nature Reviews Neu....
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Reimpresiones y permisos
