Mediciones de las respuestas fisiológicas de estrés en C. Elegans

Resumen

Aquí, caracterizamos las respuestas de estrés proteotóxico celular en el nematodo C. elegans midiendo la activación de los reporteros transcripcionales fluorescentes y diciendo sensibilidad al estrés fisiológico.

Resumen

Los organismos a menudo están expuestos a ambientes fluctuantes y cambios en la homeostasis intracelular, que pueden tener efectos perjudiciales en su proteome y fisiología. Por lo tanto, los organismos han evolucionado respuestas de estrés específicas y específicas dedicadas a reparar el daño y mantener la homeostasis. Estos mecanismos incluyen la respuesta proteica desplegada del retículo endoplasmático (UPR^ER),la respuesta proteica desplegada de las mitocondrias (UPR^MT),la respuesta de choque térmico (HSR) y la respuesta de estrés oxidativo (OxSR). Los protocolos aquí presentados describen métodos para detectar y caracterizar la activación de estas vías y sus consecuencias fisiológicas en el nematodo, C. elegans. En primer lugar, se describe el uso de reporteros transcripcionales fluorescentes específicos de la vía para la caracterización celular rápida, la detección de drogas o la detección genética a gran escala (por ejemplo, RNAi o bibliotecas mutantes). Además, se describen ensayos fisiológicos complementarios y robustos, que pueden utilizarse para evaluar directamente la sensibilidad de los animales a factores de estrés específicos, sirviendo como validación funcional de los reporteros transcripcionales. Juntos, estos métodos permiten una rápida caracterización de los efectos celulares y fisiológicos de las perturbaciones proteotóxicas internas y externas.

Introducción

La capacidad de un organismo para responder a los cambios en el entorno intra y extracelular es crucial para su supervivencia y adaptación. Esto se logra a nivel celular a través de numerosas vías protectoras que aseguran la integridad de la célula. Mientras que numerosos componentes celulares están sujetos a daño asociado al estrés, una participación importante de las respuestas de estrés celular es reparar y proteger la homeostasis del proteome celular. Sin embargo, la compartimentación de proteínas en estructuras especiales, llamadas orgánulos, plantea un desafío para la célula, ya que no puede confiar en una forma centralizada de control de calidad de proteínas pa....

Protocolo

1. Condiciones de crecimiento estándar de las temperaturas y OP50 vs HT115

1. Crecimiento y expansión estándar
   1. Cultivar un cultivo de OP50 en LB (Tabla 1) o medios equivalentes de elección para 24-48 h a temperatura ambiente (22-25 oC). Crecer bacterias a temperatura ambiente ya que OP50 es un auxotrofi de uracilo y hay una mayor incidencia de revertientes (por ejemplo, mutantes supresores) cuando se cultiva a 37 oC. No se recomienda el almacenamiento a largo plazo de cultivos OP50 (máximo 1 semana a 4 oC).
   2. Semilla de un volumen de 100-200 ml de cultivo OP50 saturado en una placa NGM de 60 mm (Tabla 1) para e....

Resultados

Uso de reporteros transcripcionales para medir la activación de las respuestas de estrés
Aquí, se utilizan reporteros transcripcionales fluorescentes, que sirven como herramientas robustas para medir la activación de la mayoría de las respuestas de estrés en C. elegans. La expresión gFP se impulsa bajo el promotor de objetivos canónicos de los reguladores transcripcionales maestros involucrados en la respuesta a las tensiones específicas del compartimiento. Un.......

Discusión

Aquí, se describen métodos para interrogar las respuestas de estrés celular en C. elegans,utilizando reporteros transcripcionales fluorescentes y ensayos fisiológicos de supervivencia por estrés. Todos los reporteros utilizan la expresión GFP impulsada bajo el promotor de un objetivo transcripcional descendente de los factores de transcripción involucrados en el montaje de las respuestas de estrés celular. El uso de hsp-4p::GFP modulado por XBP-1s-mediada UPR^ER, hsp-6p::GFP controlad.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Antimicina A	Sigma-Aldrich	A8674	para el estrés mitocondrial
Bacto Peptona	Fisher Scientific	DF0118072	para placas NGM
BD Difco agar granulado	VWR	90000-782	para placas NGM
Cloruro de calcio dihidratado	VWR	97061-904	para placas NGM
Carbenicillin	BioPioneer	C0051-25	para ARNi
Colesterol	Sigma-Aldrich	57-88-5	para placas NGM
COPAS	Biosorter Union Biometrica	350-5000-000	equipado con una fuente de luz de 488 nm.
COPAS Solución de limpieza	Union Biometrica	300-5072-000	para usar con COPAS
COPAS Solución de vaina	Union Biometrica	300-5070-100	para usar con COPAS
DMSO	Sigma-Aldrich	472301	disolvente para medicamentos
IPTG sin dioxano	Denville Scientific	CI8280-4	para ARNi
Caldo LB Miller	Fisher Scientific	BP1426500	para el
estereoscopio LB M205FA	Leica	10450040	equipado con una cámara CCD monocromática Leica DFC3000G, filtro Leica GFP estándar (ex 395-455, EM 480 LP) y software LAS X
Sulfato de magnesio heptahidratado	VWR	EM-MX0070-3	para placas NGM, M9
Paraquat	Sigma-Aldrich	36541	para estrés oxidativo/mitocondrial
Cloruro de potasio	Fisher	P217-500	para solución de lejía
Fosfato de potasio dibásico	VWR	EM-PX1570-2	para placas NGM
Fosfato de potasio monobásico	VWR	EM-PX1565-5	para M9
Revolve	ECHO	75990-514	equipado con una lente de objetivo Olympus 4x Plan Fluorite NA 0.13, filtro Olympus FITC estándar (ex 470/40; em 525/50; DM 560), y un iPad Pro para la cámara y para el controlador Software ECHO
Azida de sodio	Sigma-Aldrich	71289-50G	para la imagen
Cloruro de sodio	EMD Millipore	SX0420-5	para placas NGM, M9
Fosfato de sodio dibásico	VWR	71003-472	para M9
Hidroperóxido de terc-butilo	Sigma-Aldrich	458139	para el estrés
oxidativoClorhidrato de tetraciclina	Sigma-Aldrich	T7660-5G	para ARNi
Tunicamicina	Sigma-Aldrich	T7765-50MG	para el estrés del RE