Artículo de método

Aislamiento de myofibrils de biopsias de músculo esquelético y determinación de la función contráctil con un transductor de fuerza de resolución Nano-Newton

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DOI:

10.3791/61002

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7 de mayo de 2020

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1Department of Physiology, Amsterdam UMC, 2Department of Kinesiology and Physical Education, Faculty of Education, McGill University, 3IONOptix BV

En este artículo

Resumen

Aquí se presenta un protocolo para evaluar las propiedades contráctiles de los miofibriles musculares estriados con resolución nano-Newton. El protocolo emplea una configuración con una sonda de fuerza óptica basada en interferometría. Esta configuración genera datos con una alta relación señal-ruido y permite la evaluación de la cinética contráctil de myofibrils.

Resumen

Las células musculares estriadas son indispensables para la actividad de los seres humanos y los animales. Las fibras musculares individuales se componen de miofibrils, que consisten en sarcomeres ligados en serie, las unidades contráctiles más pequeñas en el músculo. La disfunción sarcomerica contribuye a la debilidad muscular en pacientes con mutaciones en genes que codifican para proteínas sarcoméricas. El estudio de la mecánica de myofibril permite la evaluación de las interacciones actin-miosina sin posibles efectos confusos de myofibriles dañados, adyacentes al medir la contractilidad de fibras musculares individuales. El daño ultraestructural y la desalineación de los myofibrils podrían contribuir a la contractilidad deteriorada. Si hay daños estructurales en los miofibrils, es probable que se rompan durante el procedimiento de aislamiento o durante el experimento. Además, los estudios en miofibrils proporcionan la evaluación de las interacciones actin-miosina en presencia de las limitaciones geométricas de los sarcomeres. Por ejemplo, las mediciones en miofibrils pueden dilucidar si la disfunción miofibrilar es el efecto principal de una mutación en una proteína sarcomérica. Además, la perfusión con soluciones de calcio o compuestos es casi instantánea debido al pequeño diámetro del myofibril. Esto hace que las miofibriles sean eminentemente adecuadas para medir las tasas de activación y relajación durante la producción de fuerza. El protocolo descrito en este artículo emplea una sonda de fuerza óptica basada en el principio de un interferómetro Fabry-Pérot capaz de medir fuerzas en el rango nano-Newton, acoplado a un motor de longitud piezoeléctrica y un sistema de perfusión de paso rápido. Esta configuración permite el estudio de la mecánica myofibril con mediciones de fuerza de alta resolución.

Introducción

Las células musculares estriadas son indispensables para las actividades de la vida diaria. El movimiento de las extremidades, la función respiratoria y el movimiento de bombeo del corazón dependen de la fuerza generada por las células musculares. El músculo esquelético consiste en fascículos musculares que contienen haces de fibras musculares individuales (Figura 1A). Estas fibras musculares se componen de miofibrils, que están formados por sarcomeres conectados en serie (Figura 1B,D). Los sarcomeres contienen filamentos delgados y gruesos. Estos consisten principalmente en cadenas de moléculas de actina y miosina, respectivamente (Figura 1B). Las interacciones actin-miosina son responsables de la capacidad de generación de fuerza del músculo. Los pacientes con mutaciones en genes que codifican proteínas sarcoméricas, como la neblina, la actina y la troponina T, sufren de debilidad muscular debido a la disfunción contráctil1.

La calidad de la contractilidad muscular se puede estudiar en varios niveles de organización, que van desde músculos enteros in vivo a interacciones actina-miosina en ensayos de motilidad in vitro. Durante las últimas décadas, varios grupos de investigación han desarrollado configuraciones para determinar la contractilidad de las miofibrils individuales2,3,4,5,6,7,8,9,10. Estas configuraciones se basan en la detección de cambios en la desviación láser de un voladizo (es decir, desviación de haz óptico) causada por la contracción del myofibril (para más detalles, véase Labuda et al.11). Aunque la determinación de la función contráctil de myofibrils tiene algunas limitaciones (por ejemplo, la dinámica de los procesos de acoplamiento de excitación-contracción que están aguas arriba de los miofibrils son faltantes), hay múltiples ventajas a este enfoque. Estos incluyen: 1) la capacidad de evaluar las interacciones actin-miosina en presencia de las limitaciones geométricas de los sarcomeres; 2) la capacidad de evaluar las interacciones entre la actina y la miosina sin posibles efectos confusos de los miofibriles adyacentes dañados (al medir la contractilidad de las fibras musculares individuales daño ultraestructural y la desalineación de myofibrils podría contribuir a la contractilidad deteriorada) (Figura 1D); 3) el pequeño diámetro de las miofibriles (1 m, Figura 2A)y la falta de membranas permiten la difusión casi instantánea del calcio en los sarcomeres. Además, si hay daños estructurales en los miofibrils, es probable que se rompan durante su aislamiento o durante el experimento. Por lo tanto, evaluar la contractilidad de myofibril es un método elegante para estudiar los mecanismos básicos de la contracción muscular y para entender si las interacciones alteradas actina-miosina son la causa principal de la enfermedad muscular causada por mutaciones en proteínas sarcoméricas.

Este protocolo presenta una nueva configuración para determinar la contractilidad de los myofibrils que incorporan una sonda de fuerza en voladizo con resolución nano-Newton (es decir, Optiforce). Esta sonda de fuerza se basa en el principio de interferometría. La interferometría permite el uso de voladizos relativamente rígidos. Esto hace posible medir la fuerza con poca desviación del voladizo, acercándose a las contracciones isométricas del miofibril. La sonda permite la evaluación de fuerzas pasivas y activas bajas producidas por un solo miofibril aislado de diferentes biopsias musculares, incluidas las de sujetos humanos, con una alta relación señal-ruido. La sonda de fuerza en voladizo óptico incorporada en esta configuración se basa en un interferómetro Fabry-Pérot12. El interferómetro detecta pequeños desplazamientos entre una fibra óptica y un voladizo recubierto de oro montado en una férula (Figura 3). La brecha entre la fibra óptica y el voladizo se llama la cavidad Fabry-Pérot. Las miofibrils se montan entre la sonda y el motor piezoeléctrico utilizando dos fibras de montaje de vidrio recubiertas de pegamento. La fuerza producida por el myofibril puede derivarse matemáticamente de los datos del interferómetro. La interferometría se basa en la superposición o interferencia de dos o más ondas (en esta configuración tres ondas de luz). La luz láser con una longitud de onda entre 1.528.77–1.563.85 nm se emite desde el interferómetro y se envía a través de la fibra óptica. En la sonda, la luz se refleja 1) en la interfaz entre la fibra óptica y el medio (Figura 3A); 2) en la interfaz del medio y el voladizo (Figura 3B); y 3) en la interfaz entre el revestimiento metálico y dorado del voladizo(Figura 3C). La reflexión en la interfaz A y B depende del índice de refracción (n) del medio en el que se sumerge la sonda. La luz, que consta de los tres reflejos superpuestos, vuelve a un fotodiodo en el interferómetro. El fotodiodo mide la intensidad de la luz, que es el resultado del patrón de interferencia de los tres reflejos superpuestos. Cuando la fuerza contráctil se genera activando o estirando un miofibril, el miofibril tira del voladizo. Este movimiento cambia el tamaño de la cavidad (d) y, en consecuencia, el número de longitudes de onda que caben en la cavidad. La luz reflejada en el voladizo tendrá una fase diferente, lo que resulta en un patrón de interferencia diferente. El fotodiodo registra este cambio de la intensidad del patrón de interferencia como un cambio en Voltios. Posteriormente, la generación de la fuerza miofibril se calcula a partir de este cambio, teniendo en cuenta la rigidez en voladizo. La sonda de fuerza es calibrada por el fabricante empujando la punta de la aguja de montaje, unida al extremo de entrega libre del voladizo, contra una báscula de pesaje manteniendo la flexión del voladizo igual a un múltiplo de la longitud de onda del láser de lectura13. Por lo tanto, la interferometría es un método altamente sensible para detectar pequeños cambios en la distancia, lo que permite medir las fuerzas con resolución nano-Newton. Esta resolución permite evaluar la producción de fuerza miofibrilar con una alta relación señal-ruido. Mientras que la interferometría tradicional limita el rango de mediciones a la parte lineal de la curva de interferencia, el uso de un amplificador de bloqueo y la modulación de la longitud de onda láser supera esta limitación14. Esto se explica con más detalle en la sección de discusión.

Para medir la tensión activa de myofibril, se incorporó un sistema de perfusión de paso rápido para exponer el myofibril a soluciones de calcio (Figura 4A). El sistema de perfusión de paso rápido permite que se produzcan cambios en la solución en un plazo de 10 ms. Debido a su pequeño diámetro, la difusión de calcio en los miofibrils es casi instantánea. Por lo tanto, este sistema es particularmente adecuado para medir las tasas de unión actin-miosina durante la activación y liberación durante la relajación. La velocidad de activación (kACT) y la relajación (kREL) se pueden determinar a partir de las curvas de activación-relajación. Además, al exponer los miofibrils a soluciones de calcio de concentración creciente, se puede determinar la relación fuerza-calcio y la sensibilidad al calcio.

Además, un motor de longitud piezoeléctrica permite un rápido estiramiento y acortamiento del myofibril. Esto ofrece la posibilidad de estudiar las propiedades viscoelásticas (es decir, la tensión pasiva) del myofibril, así como realizar un rápido acortamiento y desarme de la miofibril para determinar la tasa de reurbanización de tensión (kTR). Los parámetros recuperados de experimentos de tensión activa y pasiva pueden ser alterados por mutaciones genéticas en una proteína sarcomerica.

Esta configuración personalizada se utilizó para medir las características contráctiles activas y pasivas de los myofibrils aislados del músculo esquelético humano, paciente y ratón sano.

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Protocolo

El protocolo para la obtención de biopsias humanas fue aprobado por la junta de revisión institucional del Centro Médico de la Universidad VU (#2014/396) y se obtuvo el consentimiento informado por escrito de los sujetos. El protocolo para la obtención de biopsias musculares animales fue aprobado por el comité local de ética animal de la Universidad VU (AVD114002016501)

1. Preparación y aislamiento miofibril

NOTA: Utilice métodos previamente descritos para glicerinas, preparar las diferentes soluciones de concentración de calcio (pCa)7,16,17, y aislar myofibrils2,18.

  1. Descongelar las soluciones relajantes (pCa 9.0, Rx) y activación (pCa 4.5, Act), así como los inhibidores (1 M E64, 1 M TDT, 1 M leupeptina, 1 M PMSF), que se almacenan a -80 oC.
  2. Tome una pieza glicerinada de biopsia muscular estriada de aproximadamente 1 mm3 y colóquela en una pequeña placa Petri con 1:1 solución Rx/glicerol (v/v) y coloque el plato Petri en una placa fría a 4 oC.
  3. Disecciona la pieza del músculo usando microscopio de disección y fórceps, separando fibras musculares individuales sin aislarlas de la pieza de músculo.
    NOTA: Retire tanto tejido graso y conectivo como sea posible para evitar la contaminación de la suspensión de myofibril.
  4. Transfiera la pieza de tejido diseccionado a un tubo de 5 ml con 1,5 ml de solución relajante con inhibidores (1 l/ml de E-64, leupeptina de 1 l/ml, TDT de 1 l/ml y PMSF de 125 l/ml). Deje que el tejido se atempere aproximadamente a 4 oC durante 1 h.
  5. Durante la incubación, arranque ambos PC, encienda los dispositivos y abra el software asociado (consulte Tabla de materiales).
  6. Sumerja la sonda de fuerza en agua ultrapura en un plato Petri y calibrar la sonda.
    1. Pulse el 'Asistente de inicio' en el interferómetro y siga las instrucciones en pantalla. Después de pulsar Calibrar, toque en la etapa del microscopio.
      NOTA: Al tocar en la etapa del microscopio, el voladizo se desviará y pasará a través de los flecos. Esto permite la calibración de la sonda.
    2. Deje la sonda sumergida en el agua ultrapura en el plato Petri después de la calibración.
  7. Inicializar la posición del motor piezoeléctrico. Para ello, siga uno de los pasos que se detallan a continuación.
    1. Cuando el motor piezoeléctrico se utilice para la tensión kTR, ajuste la longitud a 0 m.
      La configuración del generador de señales se puede encontrar en la Tabla 1, Figura 5A.
    2. Cuando el motor piezoeléctrico se utilice para la tensión pasiva, ajuste la longitud a 50 m.
      La configuración del generador de señales se puede encontrar en la Tabla 1.
      NOTA: La diferencia entre los pasos es la posición inicial del motor de longitud piezoeléctrica. Para estirar el miofibril, el motor piezoeléctrico necesita tirar para aumentar la distancia entre ambas agujas de montaje y alargar el myofibril. Para aflojar el myofibril, el motor piezoeléctrico necesita empujar para disminuir la distancia entre ambas agujas de montaje y acortar el myofibril.
  8. Prepare una diapositiva del microscopio. Pipetear 150 l de solución de polihidroxietitilmetacrilato (poli-HEMA) (5% poli-HEMA en 95% etanol, p/v) en un portaobjetos y extenderlo a través de la diapositiva para que esté todo cubierto.
    NOTA: Si una suspensión myofibril se canaliza en un portaobjetos de microscopio sin recubrimiento, las myofibrils que se hunden en la parte inferior se pegarán a la diapositiva del microscopio y no será posible pegarlos.
  9. Llene las jeringas con soluciones pCa (ver Figura 4A)y retire el sistema de perfusión.
    NOTA: En estos pasos, todos los tubos se rellenan previamente con la solución adecuada para asegurarse de que todas las burbujas de aire se eliminan de la tubería.
    1. Llene el tubo de entrada del flujo de fondo de la cámara de flujo (Figura 3, 4A) con Rx.
    2. Cuando se utilice, enjuague el colector con agua ultrapura para eliminar el aire. Para ello, conecte la jeringa con agua ultrapura a la salida y enjuague en ella en la dirección inversa. Bloquee los puertos no utilizados del colector.
    3. Permita que cada jeringa pCa llene sus respectivos tubos con solución pCa. A continuación, conéctelos al colector y al Ɵ cristal.
    4. Abra las válvulas 1 y 6 con el software del panel de adquisición de datos (consulte Tabla de materiales) marcando el botón '1+6' (Figura 6A) para llenar el Ɵ-vidrio con las soluciones relajantes (pCa 9.0) y activación (4.5) y cierre las válvulas cuando se llena el Ɵ vidrio (Figura 6B).

2. Montaje de un myofibril

  1. Recubrir un portaobjetos con poli-HEMA para evitar que los myofibrils se peguen al vidrio.
  2. Preparar el homogeneizador (ver Tabla de Materiales) para la homogeneización del tejido. Limpie la varilla interna del rotor con papel tisú limpio, ensamble el homogeneizador y gire 1x durante 15 s en alcohol y tres veces durante 15 s cada uno en agua ultrapura. Enjuague el homogeneizador en solución relajante 1 x para 15 s sobre hielo.
  3. Coloque la varilla homogeneizadora en el tubo que contiene el tejido muscular como se describe en el paso 1.4 y, mientras mantiene el tubo sobre hielo, gire el rotor durante 15 s a la velocidad 5 para desgarrar el tejido muscular y obtener una suspensión myofibril.
  4. Pipetear 50 l de la suspensión de myofibril y 250 ml de la solución relajante en el portaobjetos del microscopio recubierto con poli-HEMA en el baño de tejido. Esto formará una gota líquida. Cubra el baño con una tapa para protegerse del polvo y espere de 5 a 10 minutos para permitir que las miofiblas se hundan hasta el fondo.
    NOTA: La relación entre la suspensión y la solución relajante depende de la calidad del aislamiento, por lo tanto, ajustar en consecuencia. Por ejemplo, si el rendimiento de myofibril es bajo y hay pocos miofibriles adecuados en la suspensión, agregue más suspensión de myofibril y diluya con una solución menos relajante (p. ej., 75 l de suspensión de myofibril y 225 l de solución relajante). El tejido muscular esquelético y del corazón es fácil de reconocer debido a su patrón de estriación. Usando un objetivo de 10x o 40x, este patrón también es visible en un solo myofibril. En caso de que haya otro tejido en la suspensión, los myofibrils se pueden seleccionar visualmente. Uno puede saltarse la espera de 5-10 minutos. Sin embargo, Esto aumenta la dificultad de pegar un myofibril.
  5. Agujas de montaje de abrigo con pegamento (shellac + etanol; 120 mg de shellac en 2 ml de 70% de etanol). Para ello, calienta el pegamento a 65oC durante 30–60 s y pipetea a 6 l en un nuevo portaobjetos de vidrio sin recubrimiento. Sumerja la punta de cada aguja de montaje en el pegamento y repita hasta que una capa de pegamento sea visible. Mueva la sonda y el piezo hacia arriba verticalmente con los micromanipuladores para hacer espacio para colocar el baño de tejido en la etapa del microscopio. Retire la corredera de vidrio que contiene el pegamento.
  6. Montaje de las miofibrils
    1. Coloque el baño de tejido con el portaobjetos del microscopio recubierto con poli-HEMA que contiene la suspensión miofibril en la etapa del microscopio. Utilice el escenario para encontrar un myofibril adecuado con el objetivo 40x. Si es necesario, mueva y gire el baño de tejido para mover el myofibril a una posición montable.
      NOTA: Busque myofibrils con un patrón de estriación visible de aproximadamente 30 m de largo. Como se describe en detalle en los pasos 3.1 y 3.2.1 es posible comprobar la longitud y la longitud de los sarcomos antes de pegar el myofibril. No pegue los miofibriles rotos, porque es probable que se rompan durante la contracción.
    2. Deslice la cámara de flujo en su lugar directamente por encima de la gota de líquido que contiene las miofibrinas en el baño de tejido (entubado en el portaobjetos en el paso 2.4) y tíquela. Deténgase antes de que golpee la gota líquida.
    3. Baje la aguja de montaje piezoeléctrica y presiónelo en la punta inferior del myofibril. Levante ligeramente para comprobar si el myofibril está unido a la aguja.
    4. Baje la cámara de flujo lo suficientemente lejos como para que la aguja de montaje de la sonda llegue a la parte inferior sin que la sonda toque la cámara de flujo.
    5. Presione la aguja de montaje de la sonda en la punta superior del myofibril. Levante ligeramente para comprobar si el myofibril está unido a la aguja.
    6. Levante el myofibril desde la parte inferior del baño en la medida de lo posible sin perder la capacidad de enfocar sin que el objetivo toque la parte inferior del vidrio.

3. Inicialización del experimento

  1. Utilice los micromanipuladores, la cámara y el software del controlador del sistema (Figura 7A, consulte Tabla de materiales) para medir la longitud de los sarcomeres. Mueva el piezo y/o la sonda de fuerza para ajustar la longitud inicial de la sarcomere del myofibril a 2,5 m.
    NOTA: Una longitud de sarcomere de 2,5 m garantiza una superposición óptima entre los cabezales de miosina y la actina.
  2. Utilizando la función de recipiente del software del controlador del sistema, mida la longitud y la anchura del myofibril(Figura 7B,C).
    NOTA: Al girar la cámara, puede inclinarse horizontal y/o verticalmente. Para comprobar la alineación de la cámara, se puede utilizar un nivel de espíritu para verificar que la cámara está girada y no inclinada.
    1. Coloque el myofibril en el centro de la imagen de vídeo utilizando la etapa del microscopio.
    2. Dibuja un cuadrado de un lado del miofibril al otro. Para la longitud, asegúrese de incluir el borde oscuro de las gotas de pegamento (Figura 2A) en el cuadrado porque el procesamiento de la imagen se basa en el contraste.
    3. Comience a grabar los datos en el software del controlador del sistema (consulte Tabla de materiales) pulsando 'Inicio' y después de 5 s pausar la grabación de datos del software del controlador del sistema pulsando el botón 'Pausa'. La longitud ahora se registra en los datos.
    4. Para la anchura, gire primero la cámara 90o (consulte Tabla de materiales)y, a continuación, utilice el contraste del borde del propio myofibril.
    5. Comience a grabar los datos en el software del controlador del sistema (consulte Tabla de materiales) pulsando'Iniciar'y después de 5 s pausar la grabación de datos del software del controlador del sistema pulsando el botón'Pausa'. El ancho ahora se registra en los datos.
  3. Si es necesario determinar la tensión activa del miofibril, es necesario utilizar la configuración de perfusión. Si es así, continúe con el paso 3.4. Si solo se determina la tensión pasiva, omita los pasos 3.4–4.1.3.7 y continúe en el paso 4.2.
  4. Coloque e inicialice la configuración de perfusión.
    NOTA: Esto sólo es necesario para la generación de fuerza activa. Continúe con el paso 4.2 al realizar experimentos de tensión pasiva.
    1. Ajuste la posición del motor de paso rápido a 4 V(Figura 5B).
    2. Deslice el soporte de perfusión sobre la mesa para alinear la esquina inferior izquierda del soporte con la cinta en la mesa.
      NOTA: Tenga cuidado de no golpear la sonda de fuerza o el motor piezoeléctrico.
    3. Utilice el manipulador para colocar aproximadamente el Ɵ vidrio por ojo.
    4. Mira a través del ocular y mueve cuidadosamente el vidrio de Ɵ hacia el myofibril usando el manipulador.
    5. Alinee el canal superior del Ɵ vidrio con el myofibril utilizando el manipulador y compruebe la posición realizando un paso rápido (la configuración del generador de señales se puede encontrar en la Tabla 1) con el software del controlador del sistema (Figura 2B–C, ver Tabla de materiales).
      NOTA: Asegúrese de que el canal inferior se alineará con el myofibril durante la fase de activación del paso rápido (Figura 2B–C).
  5. Active el flujo de fondo de Rx (Figura 4A) para crear un flujo de fondo laminar en la cámara de flujo.
    NOTA: El flujo de fondo es necesario para evitar el flujo turbulento como resultado del flujo de solución pCa desde el vidrio Ɵ.
    1. Encienda la cámara de flujo con una palanca de válvula Luer.
      1. Envíe los siguientes parámetros a la bomba de salida para empezar a drenar la cámara de flujo y evitar el desbordamiento de la cámara de flujo (Figura 9): Válvula de baño (2); Modo de micropaso - Micro; Objetivo de émbolo: 48.000; Velocidad del émbolo 38–40 (arbitrario).
        NOTA: Asegúrese de que el nivel de fluido es estable en todo momento. El myofibril no debe secarse y tampoco debe el voladizo. Es mejor tener un poco de desbordamiento que un flujo demasiado pequeño.
  6. Para ajustar la temperatura a un valor deseado con el controlador de temperatura termoeléctrico (Figura 8, ver Tabla de materiales), introduzca la temperatura deseada y pulse 'Iniciar'. Espere hasta que se alcance la temperatura deseada comprobando el gráfico en el software del controlador de temperatura termoeléctrico y continúe.
    NOTA: Al realizar experimentos a temperatura ambiente, no es necesario utilizar el controlador de temperatura termoeléctrico.

4. Protocolo(s) experimental(es)

  1. Decida qué protocolos de fuerza activa deben realizarse.
    NOTA: Dependiendo de los datos necesarios para el estudio, se pueden realizar varios tipos de experimentos de fuerza activa: paso 4.1.1, medición de la fuerza máxima en saturación [Ca2+]; paso 4.1.2, obteniendo una curva Force-pCa para determinar la sensibilidad al calcio además del paso 4.1.1; paso 4.1.3, determinar la tasa de reurbanización de tensión mediante un protocolo de acortamiento-restretch además de los pasos 4.1.1 o 4.1.2.
    1. Mida la fuerza activa máxima.
      1. Comience a registrar los datos en el software del controlador del sistema (consulte Tabla de materiales) pulsando 'Iniciar'.
      2. Abra las válvulas 1 y 6 con el software del panel de adquisición de datos (ver Tabla de materiales) marcando el botón '1+6' para iniciar el flujo de vidrio Ɵ de la solución relajante y activando la solución a través del Ɵ-vidrio (Figura 6A).
      3. Restablezca el rango del interferómetro de modo que la fuerza de línea base sea 0 V seleccionando y presionando 'Reset Range' en el interferómetro (consulte Tabla de materiales).
      4. Cuando la traza de fuerza es estable, realice el paso rápido de Ɵ vidrio (tamaño de paso de 100 m).
        La configuración del generador de señales se puede encontrar en la Tabla 1 (Figura 5C). Se registrará un seguimiento de activación-relajación similar a la Figura 4D y será visible en el software del controlador del sistema.
      5. Detenga la grabación de datos del software del controlador del sistema pulsando el botón 'Pausa'.
      6. Si no se van a realizar más activaciones, cierre las válvulas 1 y 6 para detener el flujo de vidrio Ɵ desmarcando el botón '1+6' (Figura 6B), detenga la bomba de la jeringa (Figura 9, consulte Tabla de materiales) pulsando 'Terminar', y detenga el flujo de fondo cerrando la válvula Luer.
    2. Curva Force-pCa
      NOTA: Esto es similar al paso 4.1.1 para obtener la fuerza activa máxima, pero con múltiples activaciones utilizando diferentes soluciones pCa.
      1. Inicie la grabación de los datos en el software del controlador del sistema pulsando'Iniciar'.
      2. Abra las válvulas 1 y 2 con el software del panel de adquisición de datos para iniciar el flujo de solución relajante y pCa 6.2 a través del vidrio Ɵ.
      3. Restablecer el rango del interferómetro de modo que la fuerza de línea base sea 0 V seleccionando y presionando 'Reset Range' en el interferómetro.
      4. Cuando la traza de fuerza es estable, realice el paso rápido de Ɵ vidrio (tamaño de paso de 100 m).
        La configuración del generador de señales se puede encontrar en la Tabla 1.
      5. Detenga el software del controlador del sistema pulsando el botón'Pausa'.
      6. Repita los pasos 4.1.2.1–4.1.2.4 para las válvulas 1 y 3 (pCa 5.8), las válvulas 1 y 4 (pCa 5.6), las válvulas 1 y 5 (pCa 5.4) y las válvulas 1 y 6 (pCa 4.5).
      7. Si no se van a realizar más activaciones, cierre las válvulas 1 y 6 para detener Ɵ flujo de vidrio desmarcando el botón '1+6' (Figura 6A), detenga la bomba de la jeringa (Figura 9) pulsando 'Terminar', y detenga el flujo de fondo cerrando la válvula Luer.
    3. Medir la tasa de reurbanización de tensión (kTR).
      NOTA: Esto es similar al paso 4.1.1 para la fuerza activa máxima, pero con algunos cambios y pasos añadidos.
      1. Calcular el movimiento piezoeléctrico necesario para aflojar el miofibril 15% e introducir este valor en el generador de señal (Figura 5D, Tabla 1).
      2. Comience a grabar los datos en el software del controlador del sistema pulsando 'Iniciar'.
      3. Abra las válvulas 1 y 6 con el software del panel de adquisición de datos (Figura 6A) para iniciar el flujo de la solución relajante y pCa 4.5 a través del vidrio Ɵ.
      4. Restablecer el rango del interferómetro de modo que la fuerza de línea base sea 0 V seleccionando y presionando 'Reset Range' en el interferómetro.
      5. Cuando la traza de fuerza es estable, realice el paso rápido de Ɵ vidrio (tamaño de paso de 100 m).
        La configuración del generador de señales se puede encontrar en la Tabla 1.
      6. Cuando se alcance la meseta de fuerza, realice el acortamiento-restretch con el piezo.
        La configuración del generador de señales se puede encontrar en (Figura 5D, Tabla 1). Se registrará un seguimiento de activación-relajación similar a la Figura 4E y será visible en el software del controlador del sistema.
        NOTA: Se puede hacer un protocolo personalizado para automatizar los pasos anteriores.
      7. Detenga el software del controlador del sistema pulsando el botón'Pausa'.
      8. Si no se van a realizar más activaciones, cierre las válvulas 1 y 6 para detener Ɵ flujo de vidrio desmarcando el botón '1+6' (Figura 6B), detenga la bomba de la jeringa (Figura 9) pulsando 'Terminar', y detenga el flujo de fondo cerrando la válvula Luer.
  2. Realice mediciones de fuerza pasivas.
    1. Realice un estiramiento continuo.
      1. Calcular el movimiento piezoeléctrico necesario para estirar el myofibril e introducir este valor en el generador de señal (Tabla 1).
        NOTA: Estos son ajustes de ejemplo. Calcular la cantidad de estiramiento y el tiempo de estiramiento en relación con la longitud de la sarcomere. Estos ajustes son necesarios para garantizar que la velocidad de estiramiento por sarcomere sigue siendo igual a través de myofibrils.
      2. Comience a grabar los datos en el software del controlador del sistema pulsando 'Iniciar'.
      3. Restablecer el rango del interferómetro de modo que la fuerza de línea base sea 0 V seleccionando y presionando 'Reset Range' en el interferómetro.
      4. Realice un estiramiento continuo con el generador de señal en el software del controlador del sistema para operar el piezo. Ejemplo de configuración del generador de señal se puede encontrar en la Tabla 1.
      5. Acortar el myofibril a la longitud holgada con el piezo después de que el estiramiento haya terminado (Tabla 1).
    2. Realice un estiramiento escalonado.
      1. Comience a grabar los datos en el software del controlador del sistema pulsando 'Iniciar'.
      2. Restablecer el rango del interferómetro de modo que la fuerza de línea base sea 0 V seleccionando y presionando 'Reset Range' en el interferómetro.
      3. Realice un estiramiento escalonado con el generador de señal en el software del controlador del sistema para operar el piezo. Ejemplo de configuración del generador de señal se puede encontrar en la Tabla 1 (Figura 5E).
    3. Acortar el myofibril a la longitud holgada con el piezo después de que el estiramiento está terminado. Ejemplo de configuración del generador de señal se puede encontrar en la Tabla 1.
  3. Detenga el software del controlador del sistema pulsando el botón'Pausa'.
  4. Detenga la grabación de datos pulsando el botón 'Stop'en el software del controlador del sistema.
  5. Guarde los datos pulsando 'Archivo' y 'Guardar datos' en el software del controlador del sistema.

5. Limpieza

  1. Retire el miofibril medido y prepárese para el próximo miofibril.
    1. Para ello, desgarre cuidadosamente el myofibril mientras mira a través del ocular con el objetivo 40x.
    2. Sube la sonda de fuerza y el piezo. Sube el cristal Ɵ hasta arriba, a la derecha y a la parte posterior. A continuación, muévase hacia arriba y deslice la cámara de flujo. Retire el baño de tejido.
    3. Para limpiar la aguja de montaje, enfójela con el 10x y el ocular. Sumerja el cepillo en etanol y cepille cuidadosamente y retire el pegamento de la aguja.
      NOTA: Tenga en cuenta que puede tomar algún tiempo antes de que el pegamento se despete.
    4. Enjuague la cámara de flujo y el baño de tejido con agua ultrapura.
    5. Coloque la sonda en un plato pequeño de Petri lleno de agua ultrapura. Asegúrese de que la sonda esté completamente sumergida.
  2. Cuando finalicen los experimentos, limpie la configuración como se indica anteriormente y realice los siguientes pasos adicionales.
    1. Vacíe el tubo del baño de flujo. Envíe los parámetros a la bomba de la jeringa de salida (ver Tabla de materiales, Figura 9). Válvula - Válvula de baño (2); Modo de micropaso: Normal; Objetivo del émbolo: 0; Velocidad del émbolo 30.
      NOTA: Termine el comando cuando el tubo esté vacío.
    2. Inicializar la bomba varias veces(Figura 9B).
    3. Escurra las jeringas. Para ello, cierre todas las válvulas Luer, abra todas las válvulas, retire el tubo de la aguja de la jeringa, sostenga el tubo de pCa específico debajo de la aguja y abra la válvula Luer. Utilice los tapones de presión para acelerar el proceso.
    4. Vuelva a colocar el tubo en la aguja de la jeringa. Llene las jeringas con 5 ml de agua ultrapura. Coloque una taza debajo del Ɵ de cristal. Abra todas las válvulas y abra la válvula de presión para vaciar el sistema.
    5. Apague el sistema. Apague el PC, el interferómetro y el bloque de alimentación del controlador piezoeléctrico.

6. Análisis de datos

  1. Exporte trazas de datos desde el software del controlador del sistema (consulte Tabla de materiales) a un programa de software de hoja de cálculo o portapapeles abriendo el archivo de datos y seleccionando el segmento deseado. Los rastros mostrados se exportarán (por ejemplo, fuerza bruta, longitud de sarcomere y posición piezoeléctrica).
  2. Realice análisis con el software de su elección (por ejemplo, MATLAB).

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Resultados

Los seguimientos de datos se registraron y se abrieron con el software del controlador del sistema (consulte Tabla de materiales). Las trazas completas o los segmentos seleccionados se exportaron al portapapeles o al archivo de texto para su posterior análisis con el software deseado. Las válvulas para controlar el flujo de las diferentes soluciones se cambiaron con software personalizado o manualmente. Se utilizó un script MATLAB personalizado para analizar las tasas de activación, reurbanización de ten...

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Discusión

Descrito es un protocolo para evaluar la función contráctil de los miofibrils aislados de los tejidos musculares esqueléticos humanos o animales. La resolución de fuerza de esta configuración ha sido descrita anteriormente por Chavan et al.12. En resumen, está determinada por las fluctuaciones aleatorias de la longitud de la cavidad Fabry-Pérot formada entre la fibra de detección y el voladizo, que producen la parte dominante del ruido a la salida de la lectura (expresada en V) que, multiplicada p...

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Divulgaciones

Michiel Helmes es accionista y copropietario de IONOptix Inc.

Agradecimientos

Este proyecto fue financiado por AFM-Telethon y A Foundation Building Strength for Nemaline Myopathies. Los autores desean reconocer al creador de los productos mencionados en este artículo, IONOptix Inc.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Bio Spec Products, Inc.985370-XLPara aislar miofibrillas
CodificaciónMatlab
FabricaciónIncluye el programa Labview para controlar la conexión en serie; Para controlar las válvulas
Fabricadoa medida Para enfriar el módulo
Fabricado
medida FabricadoCámara de tejido
Fabricadoa medida Para controlar las válvulas; Incluye software para PC para controlar a través de USB
IonOptixSoftware del controlador del sistema: software de registro de datos con generador de señal avanzado para piezoeléctrico y de paso
IonOptixMCS100Para registrar la longitud
IonOptixIncluye: Optiforce (interferómetro), micromanipuladores, interfaz de señal, motor piezoeléctrico y controlador. Basado en el MyoStretcher
IonOptixSonda
de fuerza KoolanceADT-EX004S
KoolanceEX2-755Para enfriar el módulo
datosde Microsoft
OlympusIX71
OlympusTH4-200
Sigma-Aldrich529265poli(2-hidroxietil metacrilato); Recubrimiento para portaobjetos de microscopio para evitar que el tejido
Sigma-Aldrich78471Cristales para disolver en etanol dando como resultado pegamento
TE Technology, Inc.TE-63-1.0-1.3Para enfriar la cámara
TE Technology, Inc.TC-720Incluye software para PC para controlar la bomba de jeringa USB
Tecan Trading AG20736652
Tecan Trading AG20739263para inducir el flujo de fondo junto con el sistema de perfusión de paso rápido; Salida de la cámara
Thermo scientific2441081
Warner Instruments (Harvard Bioscience, Inc.)descontinuada: SF-77CST/VCS-77CSP
Warner Instruments (Harvard Bioscience, Inc.)TG150-4Para perfundir el tejido
1 PC para IonWizard y 1 PC para otro software
personalizada personalizada Peltier a a medida de aluminiorápidodel sarcómero,Peltier Registro dese peguede flujo de tejidode flujo de tejidoAlternativa ,

Referencias

  1. Winter, J. M., Ottenheijm, C. A. C. Sarcomere Dysfunction in Nemaline Myopathy. J. Neuromuscular. Disease. 4, 99-113 (2017).
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