Aquí se presenta un protocolo para evaluar las propiedades contráctiles de los miofibriles musculares estriados con resolución nano-Newton. El protocolo emplea una configuración con una sonda de fuerza óptica basada en interferometría. Esta configuración genera datos con una alta relación señal-ruido y permite la evaluación de la cinética contráctil de myofibrils.
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Artículo de método
Aislamiento de myofibrils de biopsias de músculo esquelético y determinación de la función contráctil con un transductor de fuerza de resolución Nano-Newton
En este artículo
Resumen
Resumen
Las células musculares estriadas son indispensables para la actividad de los seres humanos y los animales. Las fibras musculares individuales se componen de miofibrils, que consisten en sarcomeres ligados en serie, las unidades contráctiles más pequeñas en el músculo. La disfunción sarcomerica contribuye a la debilidad muscular en pacientes con mutaciones en genes que codifican para proteínas sarcoméricas. El estudio de la mecánica de myofibril permite la evaluación de las interacciones actin-miosina sin posibles efectos confusos de myofibriles dañados, adyacentes al medir la contractilidad de fibras musculares individuales. El daño ultraestructural y la desalineación de los myofibrils podrían contribuir a la contractilidad deteriorada. Si hay daños estructurales en los miofibrils, es probable que se rompan durante el procedimiento de aislamiento o durante el experimento. Además, los estudios en miofibrils proporcionan la evaluación de las interacciones actin-miosina en presencia de las limitaciones geométricas de los sarcomeres. Por ejemplo, las mediciones en miofibrils pueden dilucidar si la disfunción miofibrilar es el efecto principal de una mutación en una proteína sarcomérica. Además, la perfusión con soluciones de calcio o compuestos es casi instantánea debido al pequeño diámetro del myofibril. Esto hace que las miofibriles sean eminentemente adecuadas para medir las tasas de activación y relajación durante la producción de fuerza. El protocolo descrito en este artículo emplea una sonda de fuerza óptica basada en el principio de un interferómetro Fabry-Pérot capaz de medir fuerzas en el rango nano-Newton, acoplado a un motor de longitud piezoeléctrica y un sistema de perfusión de paso rápido. Esta configuración permite el estudio de la mecánica myofibril con mediciones de fuerza de alta resolución.
Introducción
Las células musculares estriadas son indispensables para las actividades de la vida diaria. El movimiento de las extremidades, la función respiratoria y el movimiento de bombeo del corazón dependen de la fuerza generada por las células musculares. El músculo esquelético consiste en fascículos musculares que contienen haces de fibras musculares individuales (Figura 1A). Estas fibras musculares se componen de miofibrils, que están formados por sarcomeres conectados en serie (Figura 1B,D). Los sarcomeres contienen filamentos delgados y gruesos. Estos consisten principalmente en cadenas de molécu....
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Protocolo
El protocolo para la obtención de biopsias humanas fue aprobado por la junta de revisión institucional del Centro Médico de la Universidad VU (#2014/396) y se obtuvo el consentimiento informado por escrito de los sujetos. El protocolo para la obtención de biopsias musculares animales fue aprobado por el comité local de ética animal de la Universidad VU (AVD114002016501)
1. Preparación y aislamiento miofibril
NOTA: Utilice métodos previamente descritos para glicerinas, preparar las diferentes soluciones de concentración de calcio (pCa)7,16,
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Resultados
Los seguimientos de datos se registraron y se abrieron con el software del controlador del sistema (consulte Tabla de materiales). Las trazas completas o los segmentos seleccionados se exportaron al portapapeles o al archivo de texto para su posterior análisis con el software deseado. Las válvulas para controlar el flujo de las diferentes soluciones se cambiaron con software personalizado o manualmente. Se utilizó un script MATLAB personalizado para analizar las tasas de activación, reurbanización de ten.......
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Discusión
Descrito es un protocolo para evaluar la función contráctil de los miofibrils aislados de los tejidos musculares esqueléticos humanos o animales. La resolución de fuerza de esta configuración ha sido descrita anteriormente por Chavan et al.12. En resumen, está determinada por las fluctuaciones aleatorias de la longitud de la cavidad Fabry-Pérot formada entre la fibra de detección y el voladizo, que producen la parte dominante del ruido a la salida de la lectura (expresada en V) que, multiplicada p.......
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Divulgaciones
Michiel Helmes es accionista y copropietario de IONOptix Inc.
Agradecimientos
Este proyecto fue financiado por AFM-Telethon y A Foundation Building Strength for Nemaline Myopathies. Los autores desean reconocer al creador de los productos mencionados en este artículo, IONOptix Inc.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Bio Spec Products, Inc. | 985370-XL | Para aislar miofibrillas | |
| Codificación | Matlab | ||
| Fabricación | Incluye el programa Labview para controlar la conexión en serie; Para controlar las válvulas | ||
| Fabricado | a medida Para enfriar el módulo | ||
| Fabricado | |||
| medida Fabricado | Cámara de tejido | ||
| Fabricado | a medida Para controlar las válvulas; Incluye software para PC para controlar a través de USB | ||
| IonOptix | Software del controlador del sistema: software de registro de datos con generador de señal avanzado para piezoeléctrico y de paso | ||
| IonOptix | MCS100 | Para registrar la longitud | |
| IonOptix | Incluye: Optiforce (interferómetro), micromanipuladores, interfaz de señal, motor piezoeléctrico y controlador. Basado en el MyoStretcher | ||
| IonOptix | Sonda | ||
| de fuerza Koolance | ADT-EX004S | ||
| Koolance | EX2-755 | Para enfriar el módulo | |
| datos | de Microsoft | ||
| Olympus | IX71 | ||
| Olympus | TH4-200 | ||
| Sigma-Aldrich | 529265 | poli(2-hidroxietil metacrilato); Recubrimiento para portaobjetos de microscopio para evitar que el tejido | |
| Sigma-Aldrich | 78471 | Cristales para disolver en etanol dando como resultado pegamento | |
| TE Technology, Inc. | TE-63-1.0-1.3 | Para enfriar la cámara | |
| TE Technology, Inc. | TC-720 | Incluye software para PC para controlar la bomba de jeringa USB | |
| Tecan Trading AG | 20736652 | ||
| Tecan Trading AG | 20739263 | para inducir el flujo de fondo junto con el sistema de perfusión de paso rápido; Salida de la cámara | |
| Thermo scientific | 2441081 | ||
| Warner Instruments (Harvard Bioscience, Inc.) | descontinuada | : SF-77CST/VCS-77CSP | |
| Warner Instruments (Harvard Bioscience, Inc.) | TG150-4 | Para perfundir el tejido | |
| 1 PC para IonWizard y 1 PC para otro software |
Referencias
- Winter, J. M., Ottenheijm, C. A. C. Sarcomere Dysfunction in Nemaline Myopathy. J. Neuromuscular. Disease. 4, 99-113 (2017).
- Colomo, F., Piroddi, N., Poggesi, C., te Kronnie, G., Tesi, C. Active and passive forces of isolated myofibrils from cardiac and f....
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Reimpresiones y permisos
