Caracterización de estructuras amiloideas en el envejecimiento C. Elegans usando imágenes de por vida de fluorescencia

Summary

La fluorescencia de por vida de los monitores de imágenes, cuantifica y distingue las tendencias de agregación de las proteínas en los modelos de enfermedad de C. elegans, vivos, envejecidos y estresados.

Abstract

Las fibrillas amiloideas están asociadas con una serie de enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Huntington, Parkinson o la enfermedad de Alzheimer. Estas fibrillas amiloideas pueden secuestrar proteínas metasógenas endógenas, así como componentes de la red de proteostasis (PN) y así exacerbar el desdoblamiento de proteínas en la célula. Hay un número limitado de herramientas disponibles para evaluar el proceso de agregación de proteínas amiloideas dentro de un animal. Presentamos un protocolo para la microscopía de por vida fluorescencia (FLIM) que permite la monitorización, así como la cuantificación de la fibrilización amiloide en células específicas, como las neuronas, de manera no invasiva y con la progresión del envejecimiento y la perturbación de el PN. FLIM es independiente de los niveles de expresión del fluoróforo y permite un análisis del proceso de agregación sin más tinción o blanqueo. Los fluoróforos se calman cuando se encuentran cerca de estructuras amiloide, lo que resulta en una disminución de la vida útil de la fluorescencia. El temple se correlaciona directamente con la agregación de la proteína amiloide. FLIM es una técnica versátil que se puede aplicar para comparar el proceso de fibrilización de diferentes proteínas amiloideas, estímulos ambientales o fondos genéticos in vivo de una manera no invasiva.

Introduction

La agregación de proteínas ocurre tanto en el envejecimiento como en la enfermedad. Los caminos que conducen a la formación y deposición de grandes amiloides o inclusiones amorfas son difíciles de seguir y su cinética es igualmente difícil de desentrañar. Las proteínas pueden doblarse en sí debido a mutaciones intrínsecas dentro de sus secuencias de codificación, como en el caso de las enfermedades genéticas. Las proteínas también se multiplican por error porque la red de proteostasis (PN) que las mantiene solubles y correctamente plegadas se deteriora, como sucede durante el envejecimiento. El PN incluye chaperones moleculares y maquinarias de degradación y es respon....

Protocol

1. Sincronización de C. elegans

1. Sincronizar C. elegans ya sea a través de un tratamiento de solución de hipoclorito alcalino o mediante una simple puesta de huevos durante 4 h a 20 oC⁸.
2. Cultivar y mantener nematodos a 20oC en placas de medio de crecimiento de nematodos (NGM) sembradas con OP50 E. coli según los procedimientos estándar⁹. Envejecer los nematodos hasta la etapa o día de desarrollo deseado.
   NOTA: En este protocolo, los adultos jóvenes son imágenes el día 4 y los nematodos viejos se imágen el día 8 de la vida.

2. Derribo mediado....

Results

El protocolo muestra cómo monitorear con precisión la formación de especies agregadas en C. elegans vivos,tanto durante su envejecimiento natural como cuando se somete al estrés. Seleccionamos cuatro cepas diferentes de nematodos transgénicos que expresan proteínas de poliglutamina de repeticiones 40Q, 44Q o 85Q. Estas proteínas se sintetizan en diferentes tejidos y se fusionaron a diferentes fluoróforos. Las cepas de C. elegans expresaron Q40-mRFP en los músculos de la .......

Discussion

El protocolo presentado aquí describe una técnica basada en microscopía para identificar especies agregadas en el sistema modelo C. elegans. FLIM puede caracterizar con precisión la presencia de especies agregadas y solubles fusionadas a un fluoróforo a través de la medición de sus desintegraciones de vida útil de fluorescencia. Cuando una proteína de fusión comienza a agregar su vida útil promedio registrada cambiará de un valor más alto a un valor más bajo¹⁶. La propensión a la agregaci.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar-Agar Kobe I	Carl Roth GmbH + Co. KG	5210.2	NGM
componente Ahringer Library hsp-1 siRNA	Source BioScience UK Limited	F26D10.3
Ampicillin	Carl Roth GmbH + Co. KG	K029.3	Antibiótico
B& H DCS-120 SPC-150	Becker & Hickl GmbH		FLIM Adquisición de software
B& H SPC830-SPC Imagen	Becker & Hickl GmbH		FLIM Adquisición de software
BD Bacto Peptone	BD-Bionsciences	211677	NGM componente
C. elegans iQ44-YFP	CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC)	OG412
C. elegans iQ85-YFP			Amable regalo de Morimoto Lab
C. elegans mQ40-RFP			Amable regalo de Morimoto Lab
C. elegans nQ40-CFP			Amable regalo de Morimoto
Lab Deckglä ser-18x18mm	Carl Roth GmbH + Co. KG	0657.2	Cubreobjetos
Isopropil-β-D-tiogalactopiranosida (IPTG)	Carl Roth GmbH + Co. KG	2316.4
Leica M165 FC	Leica Camera AG		Microscopio estereoscópico
de montaje Leica TCS SP5	Leica Camera AG
Clorhidrato de Levamisol	AppliChem GmbH	A4341	Anestésico
OP50 Escherichia coli	CENTRO DE GENÉTICA DE CAENORHABDITIS (CGC)	Op50
PicoQuant PicoHarp300	PicoQuant GmbH		FLIM Software
de adquisición Azida de sodio	Carl Roth GmbH + Co. KG	K305.1	Anestésico
Cloruro de sodio	Carl Roth GmbH + Co. KG	3957.2	Componente
NGMStandard-Objektträ ger	Carl Roth GmbH + Co. KG	0656.1	Portaobjetos de vidrio
Universal Agarose	Bio & Sell GmbH	BS20.46.500
Zeiss AxioObserver.Z1	Carl Zeiss AG		Microscopio confocal
Zeiss LSM510-Meta NLO	Carl Zeiss AG		Microscopio confocal