Detección de proteína S-Acylation utilizando la captura asistida de acilo-resina

La acilación S es una modificación post-traduccional reversible que implica la adición de una cadena de acilo graso a un residuo interno de cisteína en una proteína diana a través de una unión labile tioester¹. Primero se informó como una modificación de proteínas con palmitato, un ácido graso saturado de 16 carbonos^2,y por lo tanto esta modificación se conoce a menudo como S-palmitoylation. Además del palmitato, las proteínas pueden ser modificadas reversiblemente por una variedad de ácidos grasos saturados más largos y más cortos (miristate y estearato), monoinsaturados (oleato) y poliinsaturados (araquidonato y eicosapentanoato)^3,4,5,6,7. En las células eucariotas, la acilación S es catalizada por una familia de enzimas conocidas como aciltransferasas de proteína DHHC y la reacción inversa de la deccilación de cisteína es catalizada por tilanarias de proteína, la mayoría de las cuales siguen siendo enigmáticas^8.

La labilidad del enlace tioester hace que esta modificación lipídica sea reversible, lo que le permite regular dinámicamente el clustering de proteínas, la localización de membranas plasmáticas, el tráfico intracelular, las interacciones proteína-proteína y la estabilidad de proteínas^9,,10. En consecuencia, la acilación S se ha relacionado con varios trastornos, incluyendo la enfermedad de Huntington, la enfermedad de Alzheimer y varios tipos de cáncer (próstata, gástrico, vejiga, pulmón, colorrectal), que requiere el desarrollo de métodos confiables para detectar esta modificación de proteína post-traduccional¹¹.

El etiquetado metabólico con palmitato radiactivo ([³H], [¹⁴C] o [¹²⁵I]) fue uno de los primeros enfoques desarrollados para analizar la proteína S-acylation^12,13,14. Sin embargo, los métodos basados en radioetiquetado presentan problemas de salud, no son muy sensibles, consumen mucho tiempo y sólo detectan la lipidedeción de proteínas altamente abundantes¹⁵. Una alternativa más rápida y no radioactiva al radioetiquetado es el etiquetado metabólico con sondas de ácidos grasos bioortogonales, que se utiliza rutinariamente para analizar la dinámica de la proteína S-acylation¹⁶. En este método, un ácido graso con un reportero químico (grupo de alquino o azida) se incorpora a la proteína S-acilado por una proteína acitransferasa. Azide-alkyne Huisgen cycloaddition reaction (clic chemistry) se puede utilizar para unir un grupo funcionalizado, como un fluoróforo o biotina, al ácido graso integrado que permite la detección de la proteína S-acylated^17,18,19.

El intercambio de acilina-acilo (ABE) es uno de los métodos bioquímicos ampliamente utilizados para la captura e identificación de proteínas s aciladas que evita algunas de las deficiencias del etiquetado metabólico, como la inadecuación para las muestras de tejido¹⁵. Este método se puede aplicar para el análisis de S-acylation en una amplia gama de muestras biológicas, incluyendo tejidos y muestras de células congeladas^20,,21. Este método se basa en el escote selectivo del enlace tioéster entre el grupo de acilo y el residuo de cisteína por hidroxilamina neutra. Los grupos tiol liberados son capturados con un derivado de la biotina tiol-reactivo. Las proteínas biotiniladas generadas se purifican con afinidad mediante agarosa de estreptavidina y se analizan mediante inmunoblotting.

Más tarde se introdujo un enfoque alternativo llamado captura asistida de acilo-resina (Acyl-RAC) para reemplazar el paso de biotinylación por la conjugación directa de cisteínas libres por una resina tio-reactiva^22,23. Este método tiene menos pasos en comparación con ABE y de forma similar se puede utilizar para detectar la proteína S-acylation en una amplia gama de muestras¹.

Acyl-RAC consta de 4 pasos principales(Figura 1),
1. Bloqueo de grupos de tiol libres;
2. Escisión selectiva de la unión tioester de cisteína-acyl con hidroxilamina neutra (HAM) para exponer los grupos de tiol de cisteína;
3. Captura de las cisteínas lipicadas con una resina tiol-reactiva;
4. Enriquecimiento selectivo de las proteínas S-acylated después de la elución con tampón reductor.

Las proteínas capturadas pueden ser analizadas mediante inmunoblotting o sometidas a espectrometría de masas (MS) proteómica para evaluar el proteoma S-acilado en una variada gama de especies y tejidos^22,,24,,25. Los sitios individuales de S-acylation también pueden ser identificados por la digestión de la trippsina de las proteínas capturadas y el análisis de los péptidos resultantes por LC-MS/MS²². Aquí, demostramos cómo acile-RAC se puede utilizar para la detección simultánea de S-acylation de múltiples proteínas tanto en una línea celular como en una muestra de tejido.

Los ratones utilizados en este protocolo fueron eutanasiados de acuerdo con las directrices de NIH. El Comité de Bienestar Animal del Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad de Texas en Houston aprobó todo el trabajo animal.

1. Preparación de los lysaatos celulares

1. Prepare el búfer de lisis como se describe en la Tabla 1. A 10 ml de PBS, añadir 0,1 g de detergente n-dodecílo-D-maltoside (DDM) y rotar para disolver. Añadir 100 l de cóctel inhibidor de fosfatasa 2, ML211 (10 m), PMSF (10 mM) y cóctel inhibidor de proteasa (1x) y enfriar el tampón en hielo antes de usarlo.
2. Transfiera los medios necesarios que contengan células de la incubadora en tubos cónicos de 15 ml o 50 ml y espíre células a 350 x g durante 5 min y aspire para deshacerse de los restos celulares.
   NOTA: Utilizamos 1 x 10⁷ celdas para cada reacción acyl-RAC a realizar.
3. Lavar el pellet resubyándolo en 5 ml de PBS y girando a 350 x g durante 5 min.
   NOTA: Realice el paso 1.3 rápidamente para evitar la lisis celular debido a la incubación prolongada en PBS.
4. Añadir 600 l de tampón de lisis preparado en el paso 1.1 al pellet y lijarlo agitando a 1500 rpm en una coctelera térmica durante 30 minutos a 4 oC.
5. Lisiado transparente por centrifugación a 20.000 x g a 4 oC durante 30 minutos a materiales insolubles en detergente de pellets. Recoger el lisado despejado en tubos de microfúgey de 1,5 ml preenfriados y mantenerlos en hielo.
6. Realice un ensayo Bradford/BCA para estimar la concentración de proteínas. Es fundamental asegurar la misma cantidad de proteína en diferentes muestras antes de realizar el experimento. Recomendamos el uso de al menos 500 g de proteína por reacción.
   NOTA: En los experimentos descritos, utilizamos células cultivadas (Jurkat) y astillocitos primarios del tejido de ratones. El método de lisis descrito anteriormente también se puede adoptar a otros tipos de células. La concentración media de proteínas obtenida para los tipos de células antes mencionados es de aproximadamente 500 g por 1 x 10⁷ células. Las células Jurkat se mantuvieron en un medio RPMI-1640 modificado para contener 2 mM de L-glutamina, 10 mM de HEPES, 1 mM de piruvato sódico, 4.500 mg/L de glucosa y 1.500 mg/L de bicarbonato sódico complementado con 10% de FBS a 37oC con_5%CO2. Usamos 1 x 10⁷ células Jurkat por reacción. Los esplenocitos primarios se aislaron del tejido del bazo del ratón como se describe²⁶. Brevemente, el tejido del bazo fue macerado sobre hielo, seguido de la lisis de los eritrocitos en solución hipotónica y la separación de los linfocitos por centrifugación. Usamos 1 x 10⁷ células primarias por reacción.

2. Acyl-RAC: Bloqueo de grupos de tiol libres

NOTA: Todos los pasos subsiguientes se pueden realizar a temperatura ambiente (RT).

1. Transfiera el lisado a un tubo de microfófugo fresco de 1,5 ml y realice precipitaciones cloroformo-metanol (CM) como se describe a continuación.
   1. Añadir metanol (MeOH) y cloroformo (CHCl₃) al lisado a una proporción final de lisato: MeOH: CHCl₃ de 2:2:1 y agitar vigorosamente para crear una suspensión homogénea.
   2. Gire a 10.000 x g durante 5 min para formar un pellet ("panqueque") en la interfase entre fases acuosas y orgánicas.
   3. Incline el tubo y aspire tanto disolvente como sea posible utilizando una aguja o una punta de carga de gel.
   4. Seque al aire el pellet proteico durante unos minutos y lávelo suavemente añadiendo 600 ml de MeOH y mezclando suavemente para evitar romper el pellet
   5. Retire cuidadosamente el MeOH restante y seque el pellet proteico en una mesa durante aproximadamente 5 minutos.
   6. (Opcional) Realice un paso de centrifugación adicional para espinar cualquier pellet roto después del lavado MeOH para evitar la pérdida de la muestra.
      NOTA: El experimento se puede detener después del paso de precipitación CM. Una vez obtenido el pellet, se puede almacenar en 500 oL de MeOH en -20 oC hasta una semana.
      1. Disolver el pellet proteico en 200 ml de tampón de 2SHB vortexing a 42 oC/1500 rpm en una coctelera térmica hasta que el pellet se disuelva.
   7. (Opcional) Incubar durante 5-10 minutos adicionales en un baño de agua sonicante para disolver el pellet.
      NOTA: La duración de la sonicación varía dependiendo de la solubilidad del material. Sin embargo, la sonicación prolongada puede causar degradación de las proteínas.
2. Preparar un 0,2% de metandoiosulfonato de metilo (MMTS) (v/v) en 2SHB añadiendo 2 ml de MMTS a 998 l de tampón de 2SHB.
   NOTA: Utilice MMTS del 0,2% recién preparado para cada experimento.
3. Añadir 200 ml de MMTS al 0,2% en 2SHB a cada tubo a una concentración final de 0,1% MMTS. Incubar durante 15 min a 42oC con agitación a 1500 rpm en una coctelera térmica.

3. Acyl-RAC: Escote de hidroxilamina (HAM) y captura de proteínas S-aciladas

1. Repita las precipitaciones de 3-4x CM como se describió anteriormente para eliminar MMTS. La eliminación de MMTS se puede estimar por la falta de olor distinto de MMTS. Después de cada precipitación, disolver el pellet en 100 l de tampón de 2SHB por vórtice a 42 oC/1500 rpm en una coctelera térmica hasta que el pellet se disuelva, y luego diluir con 300 s de Tampón A.
2. Después de la precipitación final, disolver las muestras en 200 l de tampón de 2SHB como se describió anteriormente y diluir con 240 s de tampón A.
3. En caso de comparar los cambios en la acilación S en respuesta a varias condiciones de tratamiento, mida de nuevo la concentración de proteínas y proceda con la misma cantidad de proteína para cada condición.
4. Conservar 40 l de cada muestra como un control de entrada.
5. Divida las muestras en dos partes iguales de 200 l y marque los tubos como "+ HAM" y "- HAM". Añadir 50 ml de HAM neutro de 2 M recién preparado (pH 7.0-7.5) a una concentración final de 400 mM a uno de los tubos (+ HAM) y 50 ml de naCl neutro de 2 M al segundo tubo (- HAM), que se utilizará como control negativo. Proceder a la adición de cuentas de tiopropilo-sepharose (TS).
   NOTA: El experimento se puede detener después de cualquiera de los pasos de precipitación CM. Una vez obtenido el pellet, se puede almacenar en 500 oL de MeOH en -20 oC hasta una semana. El pH neutro de 2 M HAM asegura su selectividad para la unión de tioester de acile-cisteína y debe ajustarse cuidadosamente. Se debe tener cuidado al manipular muestras en el tampón 2SHB para evitar la pérdida de la muestra debido a la formación excesiva de espuma. Todos los pasos siguientes son idénticos para las muestras HAM y + HAM.
6. Añadir 30 sl de perla-slurry TS a cada tubo y girar los tubos durante 1-2 h en RT.
7. Lave las perlas TS 4x con 1% de SDS en el tampón A para eliminar el HAM residual.
   1. Gire suavemente hacia abajo todas las muestras de cuentas usando un microfudurante durante 1 min y aspirar cuidadosamente el sobrenadante.
   2. Resuspenda las perlas en 500 s l de 1% de SDS en el búfer A.
   3. Repita el paso 3.7.1–3.7.2 tres veces.
      NOTA: La tiopropilo-sefestina (TS) activada se suministra liofilizada en presencia de aditivos que deben lavarse a pH neutro antes del acoplamiento. Se recomienda el uso de agua destilada para la hinchazón y el lavado. Pesar 0,1 g de perlas y resuspender en 1 ml de agua destilada y permitir que se hinche mientras se gira durante 30 min-1 h en RT. Lavar las perlas 1x con tampón A y preparar una suspensión con tampón A, en una proporción de 50% de tampón medio a 50%. La TS inflamada puede almacenarse a pH neutro en presencia de 20% de etanol a 4 oC hasta una semana. No utilice azida sódica como agente bacteriostático, ya que los iones de azida reaccionan con los grupos de disulfuro de 2 piridilo. Para una mayor eficiencia, prepare perlas frescas. Durante el manejo de las perlas, la punta de una punta de pipeta P200 se puede cortar ligeramente para evitar cualquier daño.
      NOTA: El experimento se puede detener en cualquier etapa después de la precipitación CM. El pellet se puede almacenar en 500 ml de MeOH en -20 oC hasta una semana.

4. Elución y detección de proteínas S-aquiladas

1. Después del último lavado, gire suavemente hacia abajo las cuentas como se describió anteriormente y aspirar tanto sobrenadante como sea posible sin perturbar las cuentas.
2. Recupere las proteínas de las perlas con un búfer de muestra de 4 x SDS con TDT.
   1. Añadir 50 l de tampón de muestra de SDS 4x a las perlas e incubar a 80 oC, 1500 rpm durante 15 minutos en una coctelera térmica. Deja que los tubos se enfríen.
   2. Centrifugar las perlas a 5.000 x g durante 3 min para peletizar completamente las perlas y transferir las proteínas eluted a un tubo fresco de 1,5 ml utilizando una punta de carga de gel.
3. Ejecute SDS-PAGE y analice la Acilación S de las proteínas de interés por hincha occidental.

Siguiendo el protocolo descrito anteriormente, primero usamos acyl-RAC para detectar simultáneamente S-acylation de varias proteínas en las células de Jurkat, una línea de células T inmortalizada originalmente derivada de la sangre periférica de un paciente de leucemia de células T27. Las proteínas de células T reguladoras previamente identificadas como S-acylated9,28,29 fueron elegidas para demostrar la utilidad de este método. Como se muestra en la Figura 2A,la tirosina quinasa Lck se puede detectar en lisatos tratados con hidroxilamina neutra de 2 M para cortar el enlace del tioester entre los residuos de cisteína y una mitad de ácidos grasos (+ carril HAM). La muestra tratada con 2 M NaCl (- carril HAM) representa un importante control negativo, que indica la selectividad del ensayo para la detección de los enlaces tioester. El carril de entrada confirma aún más la especificidad de la señal y puede servir como un control positivo si la proteína de interés no está acilada en S. La membrana fue posteriormente despojada y reprobida con anticuerpos contra las proteínas Fyn y LAT para demostrar que el ensayo acilo-RAC se puede utilizar para analizar la acilación S de múltiples proteínas al mismo tiempo(Figura 2A).

Para demostrar la utilidad de este método para detectar la proteína S-acylation en muestras de tejido, aplicamos el protocolo acyl-RAC al bazo del ratón. Como se muestra en la Figura 2B,La acilación S de Lck, Fyn y LAT se puede detectar fácilmente en los esplenocitos primarios del ratón que indican que esta modificación se conserva entre dos especies.

Figura 1. Representación esquemática de acyl-RAC. El método consta de 4 pasos principales: (1) bloquear los grupos libres de tiol con metil methanethiosulfonato (MMTS), (2) escisión selectiva del enlace tioester de cisteína-acyl con hidroxilamina neutra (HAM) para exponer los grupos tiol de cisteína, (3) captura de proteínas con tiol de cisteína recién expuesto por conjugación directa con una resina tiol-reactiva y (4) recuperación de proteínas capturadas utilizando un tampón de elución reductor, seguido de inmunoblotting o análisis de MS. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2. Detección de proteínas S-aciladas. Se utilizó un ensayo acyl-RAC para detectar la acilación S de las proteínas de señalización de células T en las células De Jurkat T(A)y el tejido del bazo murino (B). La inmunoblotting con anticuerpos específicos de Lck, Fyn y LAT muestra la acilación S de estas proteínas en la muestra tratada con hidroxilamina (+ carril HAM). Una muestra tratada con cloruro de sodio (- carril HAM) sirve como control negativo. Las lisades no tratadas se muestran en el carril de entrada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Composición de búfer de los búferes de uso común necesarios en el protocolo. El búfer 2SHB y el búfer A se pueden preparar con antelación, pero su pH debe revisarse regularmente. El tampón de lisis y el HAM deben prepararse el día del experimento.

No se declaran conflictos de intereses.