Uso del generador de aerosol capilar en la producción continua de aerosol controlado para estudios no clínicos

Summary

El protocolo describe la configuración y el uso de un generador de aerosol capilar para la producción continua de aerosol controlado a partir de una solución líquida multiespecie, adecuado para la administración constante de aerosoles de gran volumen (por ejemplo, estudios de inhalación in vivo ).

Abstract

El generador de aerosol capilar (CAG) funciona con el principio de evaporación térmica del líquido a través del calentamiento del e-líquido en la fase inicial, seguido de nucleación y condensación regulada a través de una mezcla de flujo de aire para generar aerosoles, como en un cigarrillo electrónico (CE). El CAG es particularmente útil para generar aerosoles de grandes volúmenes de manera continua, por ejemplo, como los estudios toxicológicos por inhalación in vivo , donde el uso de CE no es factible. Los efectos térmicos de la generación de aerosol a partir del CAG son similares en términos de temperatura aplicada en una CE, lo que permite a los investigadores evaluar los vapores de los e-líquidos a escala y reproducibilidad. Como el funcionamiento del CAG permite a los usuarios controlar parámetros críticos como el caudal de e-líquido, las temperaturas de calentamiento y los flujos de aire de dilución, permite a los investigadores probar varias formulaciones de e-líquidos en un dispositivo bien controlado. Se ha demostrado que las propiedades, como el tamaño de partícula del aerosol, se regulan con el caudal de aire con respecto al flujo de e-líquido y la composición de e-líquido. Sin embargo, el CAG es limitado a la hora de evaluar cuestiones comunes relacionadas con las CE, como el sobrecalentamiento de sus elementos. Buscamos demostrar que el CAG puede generar aerosol que sea reproducible y continuo, mediante la evaluación de las características químicas y físicas del aerosol con una formulación e-líquida elegida. El protocolo describe los parámetros de funcionamiento del caudal de líquido, los caudales de aire de dilución y los procedimientos operativos que necesitan optimizar la concentración de aerosol y el tamaño de partícula requerido para un estudio toxicológico in vivo . Al presentar los resultados representativos del protocolo y discutir los desafíos y aplicaciones de trabajar con un CAG, demostramos que CAG se puede usar de manera reproducible. La tecnología y el protocolo, que se han desarrollado a partir de trabajos anteriores, sirven como base para futuras innovaciones para investigaciones de generación de aerosoles controladas en laboratorio.

Introduction

Los e-líquidos comunes contienen una mezcla de propilenglicol, glicerol, agua, nicotina y sabores seleccionados. La composición de un aerosol generado a partir de un dispositivo EC depende no solo de la formulación líquida, sino también del material, el diseño y las características del dispositivo. En consecuencia, muchos dispositivos EC pueden introducir una gran variabilidad en la salida de^{aerosoles 1}, incluida la producción específica del dispositivo de niveles elevados de componentes no deseados, la variación del volumen de soplado, el cambio en el flujo de aire debido a orificios de ventilación bloqueados y el "soplado seco" (cuando el recipiente líquido está casi vacío, causando un sobrecalentamiento del dispositivo porque parte de la energía suministrada no se utiliza para la evaporación líquida)² . Además, la carga, recarga y limpieza de dispositivos EC durante los estudios de inhalación a largo plazo se convertiría en una gran restricción adicional en términos de logística³. Por estas razones, se deben considerar otros generadores de aerosoles para la producción a gran escala de aerosoles y la evaluación adecuada de formulaciones líquidas, evitando al mismo tiempo las variaciones relacionadas con el dispositivo en la composición de aerosoles y disminuyendo la carga de trabajo ^4,5. No obstante, los aerosoles generados por los productos deben seguir formando parte de las estrategias de evaluación del riesgo, ya que los niveles de determinados componentes en los productos de las CE podrían ser más elevados que los de los generadores de aerosoles normalizados controlados en laboratorio debido a las especificidades de calentamiento/refrigeración de los productos ^6,7,8.

Debido a la limitada información sobre los requisitos reglamentarios actualmente disponibles, los métodos de evaluación de la toxicidad potencial de los aerosoles generados por los cigarrillos electrónicos (CE) siguen evolucionando ^9,10,11. Sin embargo, la evaluación precisa in vitro e in vivo requiere la generación de volúmenes de aerosol bien caracterizados y reproducibles a lo largo del tiempo. La producción de aerosol a partir de un dispositivo de la CE con un régimen de inhalación controlada sería sin duda el proceso más representativo desde la perspectiva del consumo del usuario. Para los estudios de toxicidad reglamentaria, teniendo en cuenta una variedad de posibles formulaciones líquidas que los usuarios a menudo pueden preparar por sí mismos y, al mismo tiempo, modificando algunas características del dispositivo (por ejemplo, la energía suministrada), el uso de dispositivos CE para realizar estudios toxicológicos de exposición repetida a largo plazo no solo es desafiante sino también potencialmente inadecuado.

El generador de aerosol capilar (CAG), desarrollado por Philip Morris^12,13 y refinado por Virginia Commonwealth University¹⁴, funciona según el principio de crear un chorro de flujo de vapor caliente a partir de un capilar calentado eléctricamente, que posteriormente se enfría con aire ambiente, causando la formación de núcleos de partículas y la posterior condensación, lo que lleva a la formación de aerosoles. Debido a que los mismos procesos físicos conducen a la formación de aerosoles en las CE (aparte de la entrega del líquido al capilar por una bomba en el CAG, que, en una CE, generalmente es reemplazada por fuerzas capilares que actúan sobre el material absorbente que extrae el líquido del depósito en la CE), las características de los aerosoles generados por CAG son muy similares a las de los aerosoles EC¹⁴ (Figura 1 ). El CAG permite la producción de grandes volúmenes de aerosol, con pocos requisitos de manipulación; por lo tanto, es particularmente adecuado para estudios de inhalación in vivo.

El CAG es un dispositivo de laboratorio que consiste en un tubo capilar calentado simplemente conectado a un controlador de temperatura y a un depósito de líquido a través de una bomba peristáltica (Figura 2A). El capilar (160 mm, 21 G, acero inoxidable) se calienta mediante cuatro elementos calefactores, todos incrustados en un bloque de aluminio (Figura 2B). La temperatura se establece típicamente en 250-275 ° C para imitar las condiciones de calentamiento de la bobina de un dispositivo EC¹⁵. El líquido bombeado a través del capilar se calienta y se convierte en vapor caliente que sale de la punta del capilar. El conjunto CAG (Figura 2C) requiere elementos adicionales para mezclar el vapor generado con aire frío y formar un aerosol. La mezcla abrupta del vapor sobresaturado caliente con una corriente de aire frío da como resultado la nucleación y la condensación posterior, lo que lleva a la formación de aerosoles (Figura 2C). En nuestro diseño CAG (Figura 3), un flujo de aire calentado adicional primero enfría el cuerpo externo y luego circula a lo largo de los bloques de calentamiento para calentar el flujo de aire, evitando, al mismo tiempo, la condensación del reflujo de líquido en la punta del capilar y estabilizando la explosión del chorro de vapor. Además, crea un blindaje no deseado de los vapores calientes, lo que afecta el proceso de nucleación. Por esta razón, el caudal aplicado para este flujo de aire debe ser mínimo y ajustarse al propósito de la aplicación. Este flujo de aire se denominará "flujo de aire calentado" a lo largo de este manuscrito, aunque debe entenderse que esta corriente se calienta pasivamente por los bloques de calefacción y no a propósito por el usuario.

La tasa de flujo de aire de enfriamiento tiene una fuerte influencia en el tamaño de las partículas de aerosol generadas. En la producción de aerosoles para estudios de inhalación in vivo , el flujo de aire de dilución determinará la dosis de exposición y podría tener que diluirse aún más antes de llegar a la cámara de exposición. Además de la composición química de los aerosoles, es esencial caracterizar la distribución del tamaño de las partículas de aerosoles (DSP) para garantizar que el aerosol generado sea similar al generado por las CE y dentro del rango de tamaño de partículas de inhalación recomendado por las directrices de la OCDE (a menudo parametrizado por la suposición de la normalidad logarítmica de la DSP con diámetro aerodinámico medio en masa [MMAD] y desviación estándar geométrica [GSD]).

El MMAD de los aerosoles generados puede variar ampliamente dependiendo del diseño del dispositivo, las propiedades fisicoquímicas líquidas de la formulación (por ejemplo, densidad, viscosidad y tensión superficial), la tasa de flujo de aire y la temperatura que dicta las condiciones termodinámicas 14,16,17. Para los experimentos de exposición in vivo, el flujo de aire generalmente consiste en aire acondicionado y filtrado a 22 ± 2 ° C y 60% ± 5% de humedad relativa. El aerosol generado se puede diluir aún más dependiendo de los requisitos del estudio, para lograr las concentraciones objetivo en la atmósfera de prueba. Luego se entrega a través de tuberías de vidrio a la cámara de exposición para disminuir la pérdida de filtración. En los resultados presentados aquí, se establecen los ajustes de temperatura y flujo de aire para demostrar que el CAG se puede utilizar para la producción continua de un aerosol controlado con PSD consistente e inhalable y concentraciones definidas para estudios de inhalación in vivo.

En el protocolo, describiremos cómo: 1) ensamblar el CAG, 2) determinar los parámetros necesarios para generar aerosol a partir del CAG, 3) realizar la generación de aerosoles y 4) analizar los componentes físicos y químicos de interés en el aerosol. Para estas tiradas preliminares, consideramos una solución líquida basada en una mezcla de componentes formadores de aerosoles: propilenglicol (PG), glicerol (VG), agua y nicotina a fracciones de masa prescritas. Finalmente, compartiremos datos de ejemplo para la evaluación de una mezcla compleja de múltiples especies generada en nuestros experimentos (que involucra los constituyentes mencionados anteriormente mezclados con componentes de sabor adicionales). Discutiremos los resultados generales y los desafíos junto con la aplicabilidad de este enfoque experimental para la evaluación de tales mezclas.

Protocol

1. Montaje del sistema CAG

1. Asamblea de CAG
   1. Coloque el capilar en la ranura capilar de los bloques de calentamiento de aluminio, con el extremo de salida sobresaliendo unos 5 mm.
   2. Apriete ligeramente los tornillos de las dos mitades de los bloques calefactores de aluminio.
   3. Ensamble los elementos calefactores (a) y el termopar (b) en los bloques calefactores de aluminio (c), con los cables sobresaliendo a través de la tapa trasera de aluminio (d) (Figura 4A).
   4. Asegúrese de que los cables de los elementos calefactores estén conectados a un adaptador y asegúrese de que estén rectos.
   5. Ensamble el tubo PEEK interior (g) con el tubo SS exterior (e). Asegúrese de que los accesorios push-in de 2 x 4 mm (f) estén firmemente asegurados en el tubo exterior SS (e) (Figura 4B).
   6. Coloque las juntas tóricas (3 x 30 mm) en las dos ranuras del tubo PEEK interior (g) e inserte el tubo PEEK interior (g) en el tubo SS exterior (e) desde el extremo frontal.
   7. Coloque los elementos calefactores de aluminio ensamblados en el respaldo trasero SS (i), con la tapa trasera de aluminio mirando hacia el respaldo trasero SS, y deslice el conjunto interno del tubo PEEK / SS exterior sobre los elementos calefactores de aluminio para que quepan firmemente con el respaldo trasero SS (i) (Figura 4C).
   8. Coloque la tapa frontal de aluminio (h) sobre el elemento calefactor de aluminio, dentro del tubo PEEK interior. Asegúrese de que el capilar sobresalga ligeramente de la tapa frontal de aluminio. Instale los tres tornillos de plomo SS (j) alrededor del respaldo trasero SS y apriete firmemente.
   9. Coloque el adaptador PEEK (k) sobre la parte delantera interior del tubo PEEK. Asegúrese de que el adaptador PEEK encaje en la ranura frontal del tubo PEEK interior. Coloque el programador de 25 mm (l) sobre el adaptador PEEK y a través de los tres tornillos de plomo SS. Apriete a mano las tuercas sobre el programador de modo que el adaptador PEEK esté apretado (Figura 4D).
   10. Conecte los elementos calefactores al controlador de temperatura y el capilar a la bomba peristáltica y la solución líquida de prueba.
   11. Conecte el aire comprimido para el flujo de aire caliente al CAG a través de los accesorios push-in de 2 x 4 mm (Figura 4B, [f]).
   12. Ensamble el CAG a la pieza de vidrio y conecte el enfriamiento CAG y los flujos de aire de primera dilución (aire procesado; Figura 3). Agregue una segunda entrada de flujo de dilución cuando sea necesario, así como puertos de muestreo de aerosoles y una unión T reguladora (Figura 5).
2. Procedimiento de limpieza CAG
   1. Retire el CAG de la configuración del conjunto de vidrio CAG y limpie el vidrio con toallitas secas hasta que el vidrio esté visiblemente seco.
   2. Observe la salida capilar del CAG para detectar obstrucciones. Si se puede observar la deposición de partículas en la salida del capilar, cambie el capilar. Del mismo modo, al notar una reducción en la administración de aerosoles, reemplace el capilar por uno nuevo.
   3. Desmonte el CAG siguiendo los pasos 1.1.9 a 1.1.1.
   4. Vuelva a montar el CAG siguiendo los pasos 1.1.1 a 1.1.9 una vez que se cambie el capilar.

2. Cálculo de la concentración y dilución del aerosol CAG

1. Cálculo teórico de TDF
   1. Calcule el TDF basado en la concentración de la formulación líquida (llamada solución madre / concentración aquí) y el LFR:
      
      TDF: flujo de aire de dilución total (L/min)
      C_Stock: concentración de stock 2%, p/p)
      LFR: Caudal de líquido (g/min)
      _Objetivo C: concentración objetivo (μg/L)
   2. Usando una solución con nicotina al 2% (p/p), con una concentración objetivo de aerosol de nicotina a 15 μg/L y una LFR de 0,35 g/min, supongamos que el rendimiento del 100% será el siguiente:
      
      
2. Cálculo teórico de LFR
   1. Calcule el LFR en función de la concentración de la solución madre líquida y el TDF:
      
      LFR: caudal de líquido (g/min)
      _Objetivo C: concentración objetivo (μg/L)
      TDF: flujo de aire de dilución total (L/min)
      C_Stock: concentración de stock (%, p/p)
   2. Usando una solución con nicotina al 2% (p/p), con una concentración objetivo de aerosol de nicotina a 15 μg/L y un TDF de 300 L/min, supongamos que un rendimiento del 100% será el siguiente:
      
      
3. Cálculo del rendimiento real (%) basado en datos experimentales
   1. Sobre la base de los cálculos teóricos anteriores, realice las ejecuciones de ingeniería iniciales para cuantificar la concentración real del constituyente del aerosol (C_Actual) y obtener el rendimiento real (AY) del aerosol CAG. Realice un ajuste más fino de la concentración de aerosol utilizando los mismos cálculos para el ajuste de TDF o LFR.
      
      AY: rendimiento real (%)
      C_Real: concentración real de componentes del aerosol (μg/L)
      TDF: flujo de aire de dilución total (L/min)
      C_Stock: concentración de stock (%, p/p)
      LFR: caudal de líquido (g/min)
   2. El uso de una solución que contiene 2% (p/p) de nicotina, con una concentración medida de aerosol de nicotina de 15 μg/L, TDF de 320 L/min y LFR de 0,35 g/min dará como resultado el siguiente AY de nicotina:
      
      

3. Generación de aerosoles CAG

1. Inicio de la generación de aerosoles
   1. Pesar y registrar el valor del líquido de prueba, el agitador magnético y la botella a un 0,01 g más cercano. Las formulaciones líquidas se preparan con los componentes descritos en la Tabla 1.
   2. Suministre los ajustes de flujo de aire respectivos (±5%) (Figura 5):
      Aire comprimido para flujo calentado: 2 L/min
      Flujo de refrigeración: 10 L/min
      Primer flujo de dilución: 150 L/min
      Segundo flujo de dilución: 160 L/min
      Caudal de residuos: 172 L/min
   3. Ajuste el punto de ajuste de control de temperatura en el controlador de temperatura digital a 250 ° C y comience a calentar el CAG.
   4. Coloque la solución de caldo líquido con una barra de agitación magnética en un agitador magnético. Coloque el tubo de entrada de la bomba peristáltica en la solución de prueba.
   5. Encienda la bomba peristáltica y ajuste el flujo al LFR ±5% (g/min).
   6. Cuando la temperatura CAG alcance los 250 ± 1 °C, comience la generación de aerosoles iniciando la bomba peristáltica para entregar líquido de prueba al CAG.
   7. Compruebe si el aerosol se genera cerca de la punta capilar y registre el tiempo necesario para calcular el caudal másico. Si no se genera ningún aerosol, verifique todo el equipo y la configuración nuevamente. Si todavía no se genera aerosol, es muy probable que el capilar esté bloqueado y necesite ser reemplazado.
2. Durante la generación de aerosoles
   1. Escurra el líquido que se condensa en la configuración de vidrio cada 60 minutos, para garantizar una generación de aerosoles constante y estable.
3. Detener la generación de aerosoles
   1. Retire el tubo de la botella de solución de prueba y cambie el líquido de prueba a agua desionizada y registre el tiempo para calcular el caudal másico.
   2. Espere hasta que el vapor de agua salga del capilar, apague el controlador de temperatura y mantenga la bomba peristáltica encendida durante al menos 10 minutos para enjuagar y limpiar el capilar.
   3. Pesar y registrar el valor del líquido de prueba y la botella hasta el 0,01 g más cercano y calcular el caudal másico utilizando la siguiente ecuación:
      
   4. Apague el aire comprimido utilizado como flujo calentado.
   5. Si es necesario, retire el CAG de la configuración del ensamblaje y limpie el tubo de vidrio con toallitas secas y vuelva a montar el CAG.

4. Determinación analítica de los componentes

NOTA: El muestreo de aerosol se realiza en dos posiciones: a) en el aerosol sin diluir (tanto el aire de primera dilución como el segundo flujo de dilución se apagan durante el muestreo sin diluir) y b) en el aerosol diluido con todas las diluciones proporcionadas (Figura 5). Hasta tres puertos de muestreo están disponibles en cada una de las posiciones de muestreo, a y b, lo que permite la recolección simultánea de ACM y otros equipos / sondas para el análisis de las características del aerosol. La línea de muestreo se instala perpendicularmente a la dirección del flujo de aerosol y se conecta a una bomba de vacío que permite extraer un cierto volumen de aerosol (dependiendo de la velocidad de flujo de la bomba y la duración de la muestra).

1. Determinación de la masa recolectada en aerosol (ACM)
   NOTA: La fase de partículas del aerosol queda atrapada en una almohadilla filtrante de fibra de vidrio (diámetro: 44 mm, retención del tamaño de partícula: 1,6 μm). Los pesos ACM antes y después del muestreo se miden con soportes filtrantes para minimizar las pérdidas en el pesaje debido a la evaporación de componentes volátiles.
   1. Coloque un filtro en el soporte del filtro y coloque las tapas del filtro.
   2. Pese el soporte del filtro hasta los 0,0001 g más cercanos con el filtro antes de la recogida de muestras y documente el peso.
   3. Conecte el soporte del filtro que contiene el filtro al flujo de aerosol e inicie la recolección de muestras.
   4. Después de la recolección de muestras, pese el filtro con el soporte del filtro y las tapas, y documente el peso final.
   5. Calcule el ACM utilizando la siguiente fórmula:
      
      ACM: concentración de ACM (μg/L)
      Wb: peso del filtro y del portafiltros antes del muestreo (g) a 0,0001 g más cercano
      Wa: peso del filtro y del portafiltros después del muestreo (g) a 0,0001 g más cercano
      V_aerosol: Volumen de aerosol (L) que pasa a través del filtro, calculado utilizando:
      Tiempo de muestreo (min) x flujo de muestreo (L/min)
   6. Retire la almohadilla del filtro del soporte del filtro y deposite en un vial de vidrio de 25 ml que contenga 5 ml de etanol. Extraiga el ACM agitando la almohadilla de filtro en un agitador de laboratorio durante 30 minutos a 400 rpm.
   7. Centrifugar el vial de vidrio de 25 ml durante 5 min a 290 x g y recoger el sobrenadante para la cuantificación de PG/VG y la fase particulada de la nicotina.
2. Determinación de la concentración de nicotina (o sabor)
   NOTA: El aerosol queda atrapado en una columna de muestra que contiene tierra de diatomeas de poro ancho especialmente procesada, una matriz químicamente inerte para su uso en un rango de pH de 1 a 13 (Figura 6).
   1. Prepare la columna de muestra dentro de los 15 minutos antes de comenzar la recolección de muestras de aerosol.
      1. Para determinar las concentraciones de nicotina, agregue 2 ml de ácido sulfúrico de 0.5 M. Para determinar los sabores, agregue 2 ml de isopropanol.
   2. Compruebe el flujo de muestreo.
      1. Encienda la bomba de vacío y, utilizando el equipo de flujo calibrado que proporciona una precisión de 1 ccm / min, verifique el caudal con una columna de muestra conectada a la línea de muestreo. Ajuste el flujo con la válvula de aguja al rango de 700 ccm / min ± 5%.
      2. Apague la bomba de vacío.
   3. Recogida de muestras
      1. Agregue los dos adaptadores a la columna de muestra de acuerdo con su lado de entrada y salida (Figura 6). Conecte el tubo a la línea de muestreo de vacío a través del adaptador de salida.
      2. Conecte el conjunto de la columna de muestra al puerto de muestreo a través del adaptador de entrada.
      3. Inicie la recolección de muestras encendiendo la bomba de vacío.
      4. Registre la hora de inicio del muestreo.
      5. Después de un tiempo de muestreo preestablecido, 10 min en el punto de muestreo sin diluir A y 30 min en el punto de muestreo diluido B, apague la bomba de vacío y registre el tiempo.
      6. Quite la columna de muestra del puerto de muestreo.
      7. Retire los adaptadores de la columna de muestra y selle la columna de muestra con una membrana de película para evitar pérdidas debidas a evaporación o contaminación. Etiquete la columna de muestra de acuerdo con el nombre de muestra correspondiente.
      8. Guarde la columna de muestra sellada en un refrigerador (2-8 °C) hasta el análisis.
   4. Determinación de las concentraciones de carbonilo
      NOTA: Los carbonilos quedan atrapados en una almohadilla de filtro de vidrio conectada en serie a un microimpinger lleno de 2,4-dinitrofenilhidracina (DNPH) disuelto en acetonitrilo.
3. Preparación para la captura
   1. Llene el microimpinger con 10 mL de 15 mM DNPH en acetonitrilo.
      1. Preparar una almohadilla filtrante (véase el párrafo 4.1).
      2. Comprobar el flujo de muestreo
   2. Encienda la bomba de vacío y compruebe el caudal de la línea de muestreo utilizando un equipo de flujo calibrado que proporciona una precisión de 1 ccm/min. Ajuste el flujo con la válvula de aguja al rango de 700 ccm / min ± 5%.
      1. Apague la bomba de vacío.
   3. Recogida de muestras
      1. Conecte el soporte del filtro vinculado al microimpinger al puerto de muestreo.
      2. Conecte la línea de muestreo al vacío a la salida del microimpresor.
      3. Inicie la recolección de muestras encendiendo la bomba de vacío.
      4. Registre la hora de inicio del muestreo.
      5. Después de un tiempo de muestreo preestablecido, 10 min en el punto de muestreo sin diluir a y 30 min en el punto de muestreo diluido b, apague la bomba de vacío y registre el tiempo.
      6. Desconecte la trampa de muestreo del puerto de muestreo.
      7. Vacíe el impinger en un vial de vidrio. Rellene la solución de DNPH a 10 ml con acetonitrilo.
      8. Determine el peso de la almohadilla filtrante y extráigalo en la solución de DNPH-acetonitrilo agitando. Deseche la almohadilla de filtro después de la extracción.
      9. Tome una alícuota de 1 ml de la solución de carbonilo-DNPH y agregue 50 μL de piridina para estabilizar la solución.
      10. Guarde las alícuotas en un congelador a ≤-12 °C hasta su análisis.

Results

Reproducibilidad de los aerosoles CAG
Para demostrar la reproducibilidad del aerosol generado por CAG, se utilizó una solución líquida base que contenía PG, VG, nicotina, agua y etanol (71.72%, 17.93%, 2%, 5.85% y 2.5%, respectivamente) durante 10 tiradas de generación de aerosoles separadas. Los parámetros de aerosolización y muestreo se resumen en la Tabla 2. La caracterización química de los aerosoles generados por CAG confirmó el alto grado de reproducibilidad de los resultados obtenidos utilizando el sistema. Bajo los mismos flujos de aire de calentamiento, enfriamiento y dilución, así como las mismas condiciones de muestreo, las concentraciones de ACM, nicotina, VG y PG fueron estables durante las tiradas de generación de aerosoles, con una desviación estándar relativa de 2.48%, 3.28%, 3.43% y 3.34% de ACM, Nicotina, VG y PG respectivamente (Figura 7).

Las concentraciones de ocho carbonilos, a saber, acetaldehído, acetona, acroleína, butiraldehído, crotonaldehído, formaldehído, metil etil cetona y propionaldehído, se midieron durante tres series consecutivas de generación de aerosoles CAG. Como era de esperar con los aerosoles generados en condiciones controladas constantes, los rendimientos de todos los analitos de carbonilo se mantuvieron bajos (Tabla 3), sin alcanzar los límites de cuantificación (LOQ) del método analítico para la mayoría de los compuestos. Solo el acetaldehído y el formaldehído tuvieron rendimientos superiores a la LOQ. Las concentraciones de formaldehído en la muestra de aerosol diluido mostraron una alta variabilidad (±32%) debido a la volatilidad de este analito, así como a los rendimientos cercanos a la LOQ. Los datos confirmaron la ausencia de productos líquidos de degradación térmica en aerosoles generados por CAG. La adición de una mezcla de sabores influyó en la composición carbonilo del aerosol. En el presente caso, los rendimientos de acetaldehído y butiraldehído aumentaron drásticamente, de valores cercanos a la LOQ a 2,06 y 1,56 μg/L, respectivamente, en el aerosol diluido destinado a entrar en la cámara de exposición. Estos datos resaltan el efecto de la composición de la mezcla de sabor en la composición del aerosol y enfatizan la necesidad de investigar la toxicidad potencial de ciertas sustancias aromatizantes en una formulación de e-líquido en una etapa temprana, antes de la evaluación final in vivo de los estudios de exposición a largo plazo.

PSD de los aerosoles generados por CAG
El PSD de los aerosoles generados por CAG se midió bajo diferentes flujos de enfriamiento y primera dilución para evaluar el impacto de estas condiciones en las características físicas del aerosol generado a partir de la solución líquida base que contiene PG, VG, agua y nicotina solamente. Este procedimiento es esencial para identificar las condiciones apropiadas para producir aerosoles con tamaños de partículas en el rango respirable.

En el presente estudio, los flujos de enfriamiento y primera dilución se modificaron en pasos de 10 L/min para mantener el mismo volumen total de flujo de aerosol (Tabla 4). El flujo de líquido (0,5 ml/min), el flujo calentado (2 L/min) y el segundo flujo de dilución (150 L/min) se mantuvieron constantes. Se tomaron muestras de aerosol del punto de muestreo diluido b (Figura 5). La DSP se determinó mediante el uso de un calibrador de partículas aerodinámico que mide los tamaños de partícula de 0,5 a 20 μm, a un caudal de muestreo de 5 L/min y diluido adecuadamente para su uso con el equipo. El MMAD y el GSD fueron reportados por el calibrador de partículas aerodinámico para cada tirada de generación de aerosoles.

El aumento en el flujo de enfriamiento y la disminución simultánea en el flujo de primera dilución tuvieron un impacto en el tamaño de las partículas de aerosol (Tabla 4). La mayor influencia en el tamaño de partícula se observó al cambiar el flujo de enfriamiento de 10 a 20 L/min y el primer flujo de dilución de 160 a 150 L/min. El MMAD se duplicó con creces en estas condiciones de 1,47 a 4,03 μm. El tamaño promedio de las partículas de aerosol continuó creciendo con el aumento de las tasas de flujo de enfriamiento, aunque en proporciones más bajas que las observadas entre 10 y 20 L / min. La distribución del diámetro aerodinámico de las partículas de aerosol se desplazó claramente hacia diámetros más grandes al comparar los aerosoles generados a un flujo de enfriamiento de 10 L/min con los generados a 20-50 L/min (Figura 8).

Eficiencia de captura de sabores de e-líquidos
Como se discutió anteriormente, debido a su volatilidad, varios componentes líquidos son continuamente propensos a la transferencia de masa gas-líquido dependiendo de las condiciones termodinámicas locales. Además, los métodos analíticos tienen una cierta capacidad para atrapar tales constituyentes. Las mediciones reales del rendimiento nos permiten medir la capacidad de los métodos químicos para la detección y cuantificación precisas de componentes seleccionados (por ejemplo, debido a su potencial de condensación o reacciones, algunos componentes podrían no llegar a su destino, es decir, la cámara de exposición en caso de estudios de inhalación). Por lo tanto, al evaluar varias formulaciones de e-líquidos aromatizados, es esencial poder determinar el método de captura más eficiente para la evaluación química del aerosol. Posteriormente, esto nos permite medir la tasa de transferencia para cada componente, que está dictada por las pérdidas a menudo presentes debido al transporte de aerosoles desde el lugar de generación hasta la cámara de exposición. En el presente caso, se realizó un estudio adicional con un líquido que contenía una mezcla de sustancias aromatizantes. El aerosol se generó con los parámetros CAG enumerados en la Tabla 2 y se atrapó después de la dilución (posición b, Figura 5), con el caudal de muestreo establecido en 0,7 L/min durante 30 min. El atrapamiento se realizó en columnas de muestreo preacondicionadas con 2 ml de isopropanol. Los cartuchos fueron eluidos con isopropanol poco después de la finalización del período de captura, hasta que se recuperaron 20 ml de la solución. Encontramos que la eficiencia de captura generalmente debe investigarse y determinarse para cada componente del sabor.

Para el 70% de los componentes de sabor investigados, tuvimos tasas de recuperación >60%, lo que se correlacionó bien con los puntos de ebullición (volatilidad) de los sabores. Este hecho implica que los estudios toxicológicos por inhalación que contengan mezclas complejas deben realizarse con especial atención a la transferencia y entrega de aerosol al sitio de exposición.

Figura 1: Principio de funcionamiento del generador de aerosol capilar (CAG). El líquido se bombea a un capilar calentado eléctricamente entregando ráfagas de vapores sobresaturados calientes, que se enfrían por el flujo de aire, causando nucleación y condensación repentinas, lo que lleva a la formación de aerosoles. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Configuración experimental típica de CAG y elementos clave. (A) Vista general del conjunto de CAG, que muestra la bomba peristáltica que une la solución de stock líquido con el CAG, el conducto de aire de dilución y el proceso de formación de aerosoles. (B) Vista detallada del CAG, con elementos capilares y calefactores. (C) Vista transversal de la configuración de generación de aerosoles del ensamblaje CAG. Detalles de los flujos de aire de enfriamiento y dilución. El tubo de vidrio tiene dos compartimentos separados. El flujo de enfriamiento es empujado hacia el CAG y entra en contacto con el vapor generado por el líquido para producir el aerosol. El flujo de dilución se empuja hacia el aerosol formado para diluir este último. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Detalles del dispositivo CAG: vista transversal. El flujo de calentamiento se introduce alrededor de los elementos calefactores para enfriar el cuerpo CAG externo, evitando la condensación del reflujo de líquido en la punta del capilar y para estabilizar la explosión del chorro de vapor. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Montaje CAG. El capilar y el elemento calefactor (A) se insertan en un tubo PEEK interior, y este conjunto se desliza en un tubo exterior de acero inoxidable (B). El conjunto está tapado y firmemente fijado en un soporte utilizando tornillos de plomo de acero inoxidable (C, D). El capilar que sobresale del extremo posterior está unido a través de tubos a la bomba peristáltica y la formulación líquida. Abreviaturas: SS, acero inoxidable. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Configuración de generación de aerosoles CAG para experimentos de exposición in vivo . El muestreo de aerosoles para el análisis se realiza en dos posiciones: (a) aerosol sin diluir: la primera etapa de dilución se apaga durante el muestreo; b) aerosol diluido, justo antes de entrar en la cámara de exposición. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Columna de muestra con adaptadores adjuntos. Antes del muestreo, la columna de muestra está preacondicionada con 0,5 M de ácido sulfúrico para el análisis de nicotina o isopropanol para el análisis del sabor. El adaptador de entrada está conectado al flujo de aerosol generado por CAG y el adaptador de salida a la bomba de vacío. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: Caracterización y reproducibilidad de aerosoles generados por CAG. Concentración de concentraciones de ACM, nicotina, PG y VG durante 10 ciclos experimentales separados de generación de aerosoles con la misma solución de base líquida. ACM, 1105,45 ± 27,4 μg/L; Nicotina, 20,16 ± 0,7 μg/L; VG, 227,15 ± 7,8 μg/L; PG, 656.59 ± 22.0 μg/L. Las barras de error representan la desviación estándar. Abreviaturas: ACM, masa recolectada en aerosol; PG, propilenglicol; VG, glicerol. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 8: Alteraciones en la distribución del tamaño de partícula del aerosol generado bajo varios caudales de enfriamiento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

	BASE (PG/VG/N)	SABOR (PG/VG/N/F)
Componente	PG/VG/N (g/1000g)	PG/VG/N/F (g/1000g)
Ácido benzoico	3.33	3.33
PG	240.00	238.91
Agua	150.00	150.00
Ácido láctico	3.33	3.33
Ácido acético	3.33	3.33
Mezcla de sabores mezclados	0.00	1.20
Glicerina	560.01	559.90
Nicotina	40.00	40.00
Suma	1000.00	1000.00

Tabla 1: Componentes de formulación de material E-líquido¹⁸

Protocolo de aerosolización			Protocolo de muestreo
Parámetros	Sin diluir	Diluido	Parámetros	Ubicación sin diluir A	Ubicación diluida B
Temperatura CAG (°C)	250
Caudal de la bomba (ml/min)	0.5	0.5	Tiempo de muestreo (min)	10	30
Flujo de aire calentado (L/min)	2	2	Flujo de muestreo (ACM) (L/min)	0.7	1.5
Flujo de aire de refrigeración (L/min)	10	10	Flujo de muestreo Extrelut (L/min)	0.7	0.7
1ª dilución de aire (L/min)	NA	150	Flujo de muestreo Carbonilos (L/min)	0.7	0.7
2ª dilución de aire (L/min)	NA	160
Residuos (L/min)	NA	172

Tabla 2: Parámetros de generación, dilución y muestreo de aerosoles

Carbonilos	Líquido base (PG/VG/Nicotina)		Solución de stock de sabor alta concentración con nicotina (PG/VG/Nicotina/Sabores)
	Muestra de aerosol sin diluir μg/L	Muestra de aerosol diluido μg/L	Muestra de aerosol sin diluir μg/L	Muestra de aerosol diluido μg/L
Acetaldehído	0,834 ± 0,096	0.119*	45.346 ± 1.134	2.058 ± 0.202
Acetona	< LOQ	< LOQ	< LOQ	< LOQ
Acroleína	< LOQ	< LOQ	< LOQ	< LOQ
Butiraldehído	< LOQ	< LOQ	36.475 ± 0,996	1.557 ± 0.179
Crotonaldehído	< LOQ	< LOQ	0,052 ± 0,001	< LOQ
Formaldehído	0,731 ± 0,072	0,072 ± 0,023	0,158 ± 0,007	0,026 ± 0,004
Metil Etil Cetona	< LOQ	< LOQ	0,570 ± 0,015	< LOQ
Propionaldehído	< LOQ	< LOQ	0,085 ± 0,001	< LOQ

Tabla 3: Determinación de carbonilos en el aerosol generado por CAG. Los valores promedio de tres generaciones de aerosoles se ejecutan con la misma solución de base líquida sola y con una mezcla de sabor. Solo una muestra en tres tiradas tuvo valores superiores al límite inferior de cuantificación (LOQ) del método.

Ajustes (L/min)		Diámetro de la gota de aerosol
Flujo de enfriamiento	1er flujo de dilución	MMAD (μm)	GSD
10	160	1,47 ± 0,04	2,07 ± 0,01
20	150	4,03 ± 0,18	2,13 ± 0,04
30	140	4,74 ± 0,04	1,89 ± 0,02
40	130	5,35 ± 0,04	1,80 ± 0,01
50	120	5,23 ± 0,03	1,76 ± 0,01

Tabla 4: Determinación del tamaño de partícula del aerosol (diámetro de la gota) bajo diferentes condiciones de flujo de aire. Abreviaturas: MMAD, diámetro aerodinámico medio de masa; GSD: desviación estándar geométrica.

Discussion

La generación de aerosoles con CAG ayuda a reducir la variabilidad de los procesos de aerosolización específicos del dispositivo EC, lo que permite una evaluación objetiva y controlable de la propia formulación de e-líquido en aerosol. Se ha demostrado que los aerosoles generados por CAG son representativos de los aerosoles generados por las CE⁷. Pueden generarse de forma reproducible con la misma composición y características y, por lo tanto, son especialmente adecuados para estudios de exposición in vivo a largo plazo que requieren grandes volúmenes de aerosol durante un largo período de tiempo⁸.

La configuración de CAG es relativamente simple de montar y fácil de mantener. Sin embargo, los parámetros de funcionamiento, como el caudal de líquido y los respectivos caudales de aire siguen siendo críticos para la producción de aerosol controlado, lo que requiere la optimización del método de acuerdo con el propósito de aplicación del aerosol generado por CAG.

Los resultados presentados en el estudio actual muestran que la tasa de flujo de aire de enfriamiento tiene un efecto claro en la distribución del tamaño de las partículas de aerosol. El flujo de aire de enfriamiento tiene un impacto directo no solo en la nucleación de los vapores generados, sino también en la condensación, debido al enfriamiento de la tubería interna en la que fluye el aerosol generado. Además, el aerosol denso es propenso a efectos de coagulación sustanciales. Combinados, estos procesos son complejos y su interacción e influencia en la formación de aerosoles son bastante difíciles de generalizar para los e-líquidos, temperaturas y flujos específicos. La composición suplementaria del flujo de aire (seco o humidificado con un porcentaje fijo de humedad relativa), en particular, el contenido de agua, influirá en el intercambio de calor y masa, lo que llevará no solo al crecimiento de condensación modulada de las partículas de aerosol, sino también a la condensación de la pared. Por lo tanto, las modificaciones de los parámetros de este método se consideran a los efectos de su uso en términos de control de la División del^{Sector Privado 17,19}.

La presencia de productos químicos con baja solubilidad o altos puntos de ebullición podría limitar la efectividad del aerosol generado por CAG debido a la precipitación dentro del capilar y la obstrucción del capilar con el tiempo. Dependiendo de los productos químicos presentes en el aerosol, la temperatura para operar el CAG debe ajustarse para generar el vapor. Además, la estabilidad de la formulación líquida debe evaluarse regularmente. La adición de componentes, incluidos los sabores, con diferentes puntos de ebullición influirá en la composición final del aerosol¹⁴ y la partición gas-líquido. Podría ser necesario adaptar la temperatura capilar y el flujo de aire de calentamiento para evitar el reflujo y la deposición de líquido cerca del capilar caliente, lo que podría resultar en la generación de productos incontrolados de degradación térmica (como carbonilos) debido a la larga duración de la retención del líquido a alta temperatura. Además, el control de la temperatura utilizada para generar el vapor en el capilar tiene un impacto en el lugar donde el vapor comienza a formarse en el capilar: cuanto mayor es la temperatura, antes se forma el vapor. Con una temperatura capilar más alta, el vapor que sale del capilar tardará más en enfriarse por el flujo de aire de enfriamiento y, por lo tanto, comenzará a nuclearse y condensarse en un aerosol más lejos de la punta capilar, lo que ayudará a evitar un efecto de reflujo¹⁹.

Los estudios actuales de toxicología in vivo de e-líquidos son limitados en la reproducción de aerosoles de cigarrillos electrónicos debido a la complejidad logística para cumplir con la escala de aerosol requerida, como en un estudio TG 413 de la OCDE²⁰. El protocolo presentado en este estudio ofrece una visión general sobre el ensamblaje CAG y la configuración utilizada en Philip Morris International para la generación de aerosoles in vivo en estudios de exposición a largo plazo¹⁸. Estos datos pueden servir como un buen punto de partida para un mayor ajuste en otro entorno de laboratorio (por ejemplo, sistemas de administración de fármacos²¹) o para la adaptación a los requisitos específicos de un estudio en particular.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tapa delantera de aluminio	Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Suiza	Hecho a medida	Especialmente diseñado, 1 x
Bloque calefactor de aluminio, diámetro de la ranura 0,4 mm	Phil Gunn Machine Co., Inc, VA, EE. UU	B-505432	2 x
Tapa trasera de aluminio	Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Suiza	Hecho a medida	1 x
Almohadillas de filtro de vidrio Cambridge	GE Healthcare UK Limited	9703-9654	44 mm de diámetro
21 G SS, 160 mm	Phil Gunn Machine Co., Inc, VA, USA	304H21RW	1 x
Toallitas secas	Contec Inc. , SC, EE. UU.	Toallitas Prosat saturadas con material de limpieza de alcohol isopropílico
Caudalímetro	TSI, Shoreview, MI, EE. UU	Serie 4100, 0-20 L/min	o equivalente
Calibrador Gilibrator-2	Sensidyne, San Petersburgo FL, EE. UU.	Gilian Gilibrator-2	Calibrador de flujo de aire
Acoplamientos de vidrio	Labo Service, Kontich, Bélgica	QVF
Tubería de vidrio	Labo Service, Kontich, Bélgica	QVF	25 y 40 mm
Elementos calefactores	Phil Gunn Machine Co., Inc, VA, EE. UU	. LDC01864	4 x
Grasa de alta temperatura	Lubriplate Lubricant Company, NJ, EE. UU.	Grasa multiusos de alta temperatura	Mantenimiento CAG
Tubo interior de PEEK	Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Suiza	Hecho a medida	1 x
Agitador magnético	IKA-Werke GmbH & Co. KG, Staufen, Alemania	C-MAG HS 4	o equivalente
Micro impingers	Labo Service, Kontich, Bélgica	Tubo
	Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Suiza	A medida	1 x
Adaptador de PEEK	Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Suiza	A medida	Construido a medida, 1 x
Bomba peristáltica	Watson-Marlow Fluid Technology Group, Falmouth, Reino Unido	Watson-Marlow 530 U	o equivalente
Racor a presión	Festo Pte Ltd	NPQM-DK-M5-Q4-P10	1 x
Columna de muestra Extrelut NT3 cartucho	Merk Sigma-Aldrich	115095
SS 25 mm tapón de montaje	Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Suiza	Hecho a medida	Especialmente construido, 1 x
Tornillo de avance SS M8	Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Suiza	Hecho a medida	3 x
Tuerca SS M8	Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Suiza	Hecho a medida	3 x
Respaldo trasero SS	Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Suiza	Hecho a medida	Especialmente diseñado, 1 x
Controlador de temperatura	Cole Parmer GmbH, Wertheim, Alemania	Digi-Sense TC 9600	o equivalente
Termopar tipo K	RS Components GmbH, Wä denswil, Suiza	814-0147	1 x