Métodos estandarizados para medir la inducción de la respuesta de choque térmico en Caenorhabditis elegans

La respuesta de choque térmico (HSR) es una respuesta de estrés celular universal inducida por un error de proteína citosólica causado por aumentos de temperatura y otras tensiones proteóxicas. La activación de la HSR en Caenorhabditis elegans conduce a la regulación transcripcional de genes de choque térmico como hsp-70 y hsp-16.2. Muchas proteínas de choque térmico (HSP) funcionan como chaperones moleculares que restauran la homeostasis plegable de proteínas, o proteostasis, interactuando directamente con proteínas mal plegados o dañados. El regulador maestro del HSR es el factor de transcripción Heat Shock Factor 1 (HSF-1), cuya activación se controla elegantemente a través de múltiples mecanismos^1.

El papel de HSF-1 no se limita al estrés. HSF-1 es necesario para el crecimiento y desarrollo normal, ya que la eliminación de hsf-1 conduce a la detención larvaria². El HSF-1 también es importante durante el envejecimiento y las enfermedades neurodegenerativas relacionadas con la edad caracterizadas por la acumulación de agregados proteicos y la incapacidad para mantener la proteostasis. El derribo de hsf-1 causa acumulación de agregados de proteínas y una vida útil acortada, mientras que la sobreexpresión de hsf-1 reduce la agregación de proteínas y prolonga la vida útil^3,,4. Por lo tanto, la regulación del HSF-1 a nivel molecular tiene amplias implicaciones para la fisiología y la enfermedad del organismo.

C. elegans es un poderoso organismo modelo para la investigación de HSR porque el HSR se puede medir a los niveles molecular, celular y de organismo^4,,5,,6. Destacando el poder de este modelo, se han descubierto avances clave en la delineación de la vía HSR, como las diferencias específicas de tejido en la regulación HSR, en C. elegans^7,8. Además, C. elegans es ampliamente utilizado para la investigación del envejecimiento y es un sistema emergente para el modelado de enfermedades relacionadas con la interrupción de la proteostasis.

Aunque los experimentos de choque térmico con C. elegans pueden ser rápidos y reproducibles, hay varias preguntas a considerar antes de comenzar. Por ejemplo, ¿qué temperatura se debe utilizar para la inducción del HSR y cuánto tiempo deben exponerse los gusanos? ¿Es mejor usar una incubadora seca o un baño de agua? ¿Qué etapa de desarrollo se debe utilizar? Desafortunadamente, las metodologías utilizadas para investigar el HSR varían ampliamente de laboratorio a laboratorio, causando confusión al seleccionar las mejores metodologías y dificultando la comparación de resultados en todo el campo.

Presentamos protocolos robustos y estandarizados para el uso de RT-qPCR, reporteros fluorescentes y termorecovery para medir el HSR. Si bien estos tres enfoques son complementarios, cada uno tiene ventajas y desventajas únicas. Por ejemplo, RT-qPCR es la medición más directa y cuantitativa del HSR, y este ensayo se puede ampliar fácilmente para incluir muchos genes diferentes inducibles por choques térmicos. Sin embargo, RT-qPCR es el más caro, puede ser técnicamente difícil, y requiere el uso de equipos especializados. Por el contrario, los reporteros fluorescentes tienen la ventaja de medir las diferencias específicas de los tejidos en la inducción de HSR. Sin embargo, son difíciles de cuantificar con precisión, sólo pueden medir la inducción por encima de un determinado umbral y requieren el uso de un microscopio de fluorescencia. Además, las cepas reporteras descritas aquí se retrasan en el desarrollo en comparación con la cepa N2 estándar. Aunque las cepas de reporteros más recientes que contienen transgenes de copia única están disponibles, no se han probado aquí⁹. El tercer ensayo, el termorecovery, tiene la ventaja de proporcionar una lectura fisiológicamente relevante a nivel del organismo. Sin embargo, este ensayo es sin duda el menos sensible y más indirecto. Por último, analizamos algunas variaciones comunes que se encuentran en estos ensayos y proponemos un conjunto de mejores prácticas para facilitar la investigación en este campo.

1. Mantenimiento y sincronización de C. elegans

1. Mantener los gusanos a 20 oC en placas de hidrosalto de crecimiento (NGM) sembradas con la bacteria OP50 Escherichia coli transfiriendo varios adultos a placas frescas aproximadamente 2 veces por semana¹⁰. Se debe tener cuidado para evitar que los gusanos se quemen sin alimentos, ya que esto puede afectar su fisiología¹¹.
   1. Preparación de placas NGM.
      1. Mezclar 3 g de NaCl, 2,5 g de Bacto-peptona, 20 g de agar y desionizado (DI) H₂O hasta 1 L en un matraz.
      2. Autoclave la mezcla para la esterilización.
      3. Deje que la mezcla se enfríe a 50 oC.
      4. Añadir 25 mL de 1 M KH₂PO₄ (pH a 6), 1 ml de 1 M CaCl₂, 1 mL de 1 M MgSO₄y 1 ml de colesterol (5 mg/ml en etanol 100%).
      5. Utilizando una técnica estéril, vierta la mezcla en placas de 6 cm para producir aproximadamente 100 placas. El vertido de placas es más fácil si la mezcla se transfiere primero a un vaso estéril de 300 ml.
      6. Deje que 1 día se solidifique a temperatura ambiente (RT) antes de sembrar con bacterias o almacenar a 4 oC.
   2. Siembra de bacterias OP50 en placas NGM.
      1. Cultivar un cultivo bacteriano OP50 durante la noche saturado en LB a 30 oC o 37 oC.
      2. Colocar aproximadamente 300 l del cultivo sobre el centro de una placa NGM de 6 cm.
      3. Deje que las placas se sequen en RT durante 1-3 días según sea necesario para que el césped bacteriano se adhiera a la placa. Las placas se pueden utilizar o almacenar a 4 oC.
2. Cultivar los gusanos sincrónicamente ya sea aislando huevos recién puestos (descritos aquí) o alternativamente recogiendo huevos después de disolver gusanos con lejía.
   1. Transfiera aproximadamente 10 gusanos adultos gravid a un plato fresco usando una lámina de alambre de platino. La sincronización de la coherencia de los huevos funciona mejor si los adultos están en el primer día de la edad adulta.
   2. Después de aproximadamente 1 h, retire los gusanos de la placa. Esto debe resultar en 40-60 huevos por placa, dependiendo de las condiciones y la cepa.

2. Imágenes fluorescentes de los reporteros de HSR

1. Sincronizar los gusanos (sección 1.2) y mantener a 20 oC hasta la etapa de desarrollo deseada. Para las cepas de reportero fluorescente AM446 (hsp-70p::gfp) y CL2070 (hsp-16.2p::gfp), los gusanos adultos jóvenes que aún no han alcanzado la madurez reproductiva se generan 64 h después de la sincronización de puesta de huevos.
   NOTA: El tiempo de desarrollo varía con cada cepa y la temperatura a la que se elevan los gusanos. Ambas cepas de reporteros de HSR presentan un ligero retraso en el desarrollo en relación con N2. Es importante destacar que la magnitud de la inducción del HSR disminuye aproximadamente 2-4 veces después del inicio de la madurez reproductiva (ver Discusión).
2. Choque térmico de los gusanos envolviendo las placas con película de parafina y sumergiéndose en un baño de agua circulante a 33 oC durante 1 h. Una tira delgada de película de parafina debe ser envuelta 2x alrededor de la placa para sellar los bordes. No cubra la parte inferior de la placa o podría interferir con la transferencia de calor. Sumerja las placas boca abajo con un portatubos de ensayo y un peso de plomo. Recuerde incluir una muestra de control negativo (sin choque de calor) si es necesario.
   NOTA: Si la película de parafina no es segura, el agua entrará en la placa y la placa no debe utilizarse para la recopilación de datos.
3. Recuperar los gusanos retirando las placas del baño de agua y secándose con una toalla de papel. Retire la película de parafina e incubar los gusanos a 20 oC durante 6-24 h. Este período de recuperación permite tiempo suficiente para la síntesis de GFP y el plegado antes de la toma de imágenes.
4. Prepare diapositivas para imágenes. Las diapositivas deben prepararse frescas para cada uso.
   1. Haga una solución de agarosa al 3% en agua y caliente con un microondas hasta que la agarosa se disuelva.
   2. Coloque una diapositiva de microscopio para obtener imágenes entre otras dos diapositivas de microscopio que tengan una tira de cinta de laboratorio para crear un espaciador para la almohadilla de agarosa.
   3. Con una pipeta de 1.000 l, coloque una gota (150 oL) de la agarosa calentada al 3% en el centro de la corredera del microscopio.
   4. Cubra inmediatamente la diapositiva del microscopio con una diapositiva de microscopio en blanco perpendicular a la primera diapositiva para que la corredera superior se apoye en la cinta de laboratorio en las diapositivas adyacentes. Esto extiende la gota de agarosa para crear una almohadilla de ancho uniforme.
   5. Retire con cuidado la corredera superior.
5. Inmovilizar los gusanos mediante el uso de una pipeta de 200 l para añadir una pequeña gota (5 l) de 1 mM de levamisol en Tampón M9 al centro de la almohadilla de agarosa. A continuación, transfiera 10 gusanos a la gota de levamisol utilizando una lámina de alambre de platino. Cubrir con un cubreobjetos. El sellado del cubreobjetos no es necesario para un microscopio vertical. Opcionalmente, los gusanos se pueden alinear cuando se paralizan esparciendo el levamisol, al exterior de la almohadilla de agarosa, y alineando los gusanos con una selección de alambre de platino. Alternativamente, el levamisol se puede absorber con una toallita de laboratorio.
   NOTA: Imagen tan pronto como sea posible, porque la incubación prolongada en levamisol podría alterar la fluorescencia.
6. Imagen de los gusanos usando un microscopio de fluorescencia. Los detalles de la captura de imágenes varían según el microscopio y el software.
   NOTA: Para comparar directamente las intensidades de imagen, utilice ajustes de microscopio idénticos en una sesión de imágenes. Evite sobresaturar la imagen.

3. Medición de la expresión génica HSR utilizando RT-qPCR

1. Sincronizar los gusanos (sección 1.2) y mantener a 20 oC hasta la etapa de desarrollo deseada. Para los gusanos N2, los gusanos adultos jóvenes que aún no han alcanzado la madurez reproductiva se generan 60 h después de la sincronización de puesta de óvulos.
   NOTA: El tiempo de desarrollo varía con cada cepa y la temperatura a la que se elevan los gusanos. Es importante destacar que la magnitud de la inducción del HSR disminuye aproximadamente 2-4 veces después del inicio de la madurez reproductiva (ver Discusión).
2. Gusanos de choque térmico como se describe en el paso 2.2.
3. Saque las placas del baño de agua, retire la película de parafina e inmediatamente recoja los gusanos. Los gusanos se pueden recoger lavando suavemente las placas con 1 ml de M9, recogiendo el líquido en un tubo de microcentrífuga, y luego retirando el M9 después de la centrifugación a 400 x g durante 1 min.
4. Lyse los gusanos y purificar el ARN mediante la extracción orgánica.
   1. Añadir 250 l de reactivo de aislamiento de ARN (ver Tabla de materiales).
   2. Tubos de vórtice a mano durante 30 s.
   3. Tubos de vórtice durante 20 min a 4oC utilizando un accesorio de tubo de microcentrífuga (ver Tabla de materiales).
   4. Añadir 50 l de cloroformo.
   5. Vórtice para 30 s.
   6. Incubar las muestras en RT durante 3 min.
   7. Centrifugar a 14.000 g durante 15 min a 4oC.
   8. Transfiera la capa acuosa (es decir, la capa superior, 125 l) a un nuevo tubo de microcentrífuga.
      NOTA: Evite la capa orgánica y el material en la interfaz.
   9. Añadir 50 l de cloroformo.
   10. Vórtice para 30 s.
   11. Incubar las muestras en RT durante 3 min.
   12. Centrífuga a 14.000 g durante 5 min a 4oC.
   13. Transfiera la capa acuosa (100 l) a un nuevo tubo de microcentrífuga.
       NOTA: Evite la capa orgánica y el material en la interfaz.
   14. Precipitar ARN con un volumen igual (es decir, 100 l) de isopropanol.
   15. Incubar a -20oC durante al menos 30 min, pero preferiblemente durante la noche.
       NOTA: El experimento se puede pausar aquí y el ARN se puede almacenar a -20 oC.
   16. Pele el ARN por centrifugación a 14.000 g durante 30 min a 4oC.
   17. Retire la mayor cantidad posible del sobrenadante sin alterar el pellet.
       NOTA: El pellet será pequeño y puede no ser visible. El pellet puede no adherirse firmemente al lado del tubo, por lo que es necesario tener precaución para evitar desalojarlo.
   18. Lavar el pellet con 250 ml de etanol helado al 70% hecho con H₂O libre de RNase.
   19. Centrifugar a 14.000 g durante 5 min a 4oC.
   20. Retire tanto sobrenadante como sea posible sin alterar el pellet.
   21. Realice un giro rápido en RT para eliminar cualquier 70% de etanol restante.
   22. Seque el pellet dejando los tubos abiertos en RT el tiempo que sea necesario; típicamente por lo menos 20 minutos Los tubos se pueden cubrir con un tejido libre de pelusas o papel de aluminio para evitar la contaminación.
   23. Resuspender el pellet en 20 l de H₂O libre de RNase.
   24. Determinar la concentración de ARN utilizando un espectrofotómetro de volumen pequeño (2 l).
       NOTA: El experimento se puede pausar aquí y el ARN se puede almacenar temporalmente a -20 oC o por debajo de ella.
5. Elimine el ADN residual incubando con DNase I. Se recomienda utilizar un kit disponible comercialmente (ver Tabla de Materiales)y seguir las instrucciones del fabricante.
   1. Con este kit, prepare una reacción de 20 l con 500 ng de ARN y 1 l de DNase I en un baño de agua de 37 oC durante 30 min.
   2. Añadir 2,5 l de reactivo de inactivación DNase (incluido en el kit) a cada muestra e incubar a RT durante 5 minutos con parpadeo/vórtice ocasional.
   3. Gire hacia abajo a 14.000 x g durante 2 min.
   4. Sin perturbar el pellet blanco, transfiera 15 l de sobrenadante a un microtubo fresco para la síntesis de ADNc.
6. Llevar a cabo la síntesis de ADNr. Se recomienda utilizar un kit disponible comercialmente (ver Tabla de Materiales)y seguir las instrucciones del fabricante.
   1. Con el kit, prepare una reacción de 20 l con 15 ml de ARN tratado con DNase I del paso anterior y 1 l de transcriptasa inversa.
   2. Utilice el siguiente programa para la síntesis de ADNC: 25 oC durante 5 min, 46 oC durante 20 min, 95 oC durante 1 min, 4oC de retención.
   3. Diluir el ADNc añadiendo 80 l de H₂O libre de RNase directamente a la muestra.
   4. Brevemente vórtice, luego gire hacia abajo y guárdelo a -20 oC hasta que sea necesario.
7. Realice qPCR. Se recomienda utilizar un kit disponible comercialmente (ver Tabla de Materiales)y seguir las instrucciones del fabricante.
   1. Con el kit, prepare una reacción de 25 l que contenga 2 l de ADNn y 200 nM (cada uno) de imprimadores hacia delante y hacia atrás en un pocómo de una placa de 96 pocillos.
   2. Las secuencias de primer para medir los genes de choque térmico, hsp-70 y hsp-16.2y 18S rRNA (para un control de normalización) se enumeran en la Tabla de Materiales. Se pueden utilizar varios controles de normalización como se desee.
   3. Muestras de ADNc diluidos 50 veces antes de la medición de 18S para asegurarse de que el ensayo está en el rango lineal. Las condiciones adecuadas de qPCR varían según el kit y los imprimadores utilizados (ver Resultados representativos).
   4. Utilice un sistema de detección de PCR en tiempo real (consulte la Tabla de materiales)para qPCR con 40 ciclos de 95 oC para la desnaturalización de 5 s, 58 oC para el recocido de 30 s y 72 oC para la extensión de 30 s.
      NOTA: Las temperaturas óptimas de recocido pueden variar según las imprimaciones y las condiciones.
   5. Cuantifique utilizando el método de curva estándar¹²o el método de curva estándar .

4. Ensayo termorecovery para medir HSR a nivel de organismo

1. Sincronizar los gusanos (sección 1.2) y mantener a 20 oC hasta la etapa de desarrollo deseada. Para los gusanos N2, los gusanos adultos jóvenes que aún no han alcanzado la madurez reproductiva se generan 60 h después de la sincronización de puesta de óvulos.
   NOTA: El tiempo de desarrollo varía con cada cepa y la temperatura a la que se elevan los gusanos. Es importante destacar que la magnitud de la inducción del HSR disminuye aproximadamente 2-4 veces después del inicio de la madurez reproductiva (ver Discusión).
2. Choque térmico de los gusanos como se describe en el paso 2.2 durante 6 h.
3. Retire las placas del baño de agua, retire la película de parafina y deje que los gusanos se recuperen por incubación a 20 oC durante 48 h.
4. Cuente el número de gusanos que pueden arrastrarse inmediatamente después de la estimulación mecánica sin movimiento brusco o parálisis.
   NOTA: La incubación de 6 h es óptima para el examen de condiciones que reducen la termorecovery, pero pueden ser necesarios tiempos de exposición más largos para buscar condiciones que mejoren el termorecovery.

Utilizando los protocolos descritos en este manuscrito, la inducción de HSR se midió utilizando reporteros fluorescentes, RT-qPCR y ensayos de termorecovery. En cada caso, el procedimiento de la sección 1.2 se utilizó para generar gusanos adultos jóvenes sincronizados que no habían alcanzado la madurez reproductiva.

Para visualizar la inducción de HSR a nivel celular, se analizaron las cepas de reportero fluorescente AM446 (hsp-70p::gfp) y CL2070 (hsp-16.2p::gfp) siguiendo la sección 2 del protocolo. En las muestras de control negativo sin choque de calor, el reportero hsp-16.2 sólo mostró autofluorescencia normal, pero el reportero hsp-70 tenía fluorescencia constitutiva en el músculo del depresor anal como se informó previamente4 (Figura 1A). Después de 1 h de choque de calor a 33 oC, se observó fluorescencia robusta en ambos reporteros; sin embargo, el patrón de expresión era distinto dependiendo del reportero utilizado(Figura 1B). El reportero hsp-70 era el más brillante en el intestino y la espermateca, mientras que el reportero hsp-16.2 era más brillante en la faringe. Además, el reportero hsp-16.2 tenía un alto grado de variabilidad de gusano a gusano en la cantidad de inducción como se describió anteriormente, pero el reportero hsp-70 no13.

Una variación comúnmente utilizada de la sección 2 es realizar el choque de calor en una incubadora seca en lugar de un baño de agua circulante. Por lo tanto, también se probó la diferencia entre las dos metodologías. Se encontró que ambos protocolos resultaron en una inducción robusta de los dos reporteros fluorescentes utilizando nuestras condiciones, aunque se recomienda un baño de agua circulante como una mejor práctica (ver Discusión) (Figura 1B).

Para probar la dependencia de los reporteros en el factor de transcripción HSF-1, se utilizó la alimentación de ARNi para derribar hsf-1 antes de que se midiera la inducción del reportero. Se encontró que la fluorescencia de ambas cepas se redujo severamente tras el derribo de HSF-1, lo que indica que estos reporteros dependen de HSF-1 como se describe en la literatura4 (Figura 2). Sin embargo, también se observó que la fluorescencia faríngea persistía en ambos reporteros en el derribo de hsf-1, lo que es consistente con los informes anteriores de que el músculo faríngeo es resistente a los ARNi al alimentara 14.

Para cuantificar la inducción completa del gusano del HSR a nivel molecular, se midieron dos HSP endógenos con RT-qPCR utilizando la sección 3 del protocolo. Las muestras se midieron en triplicado, se generó una curva estándar para cada una de las imprimaciones y se analizó una curva de fusión para cada muestra para el control de calidad. Se encontró que un choque de calor de 33 oC durante 1 h dio lugar a más de 2.000 veces en la expresión relativa para dos genes de choque térmico, hsp-70 y hsp-16.2 (Figura 3). Estos resultados muestran que ambos genes endógenos son adecuados para medir la inducción de HSR y que un choque de calor de 33 oC durante 1 h es suficiente para generar una respuesta sustancial. Sin embargo, se debe tener precaución al interpretar el grado absoluto de inducción de choque térmico, ya que los niveles de ARNm en ausencia de choque térmico son muy bajos.

Para analizar una respuesta fisiológica al choque térmico, se probó un ensayo de termotracción de organismo utilizando la sección 4 del protocolo. Se encontró que la exposición de los gusanos a un choque térmico de 6 horas a 33 oC condujo a una disminución del 20% en los gusanos con movimiento normal después de una recuperación de 48 h(Figura 4A). La dependencia de este ensayo en el factor de transcripción HSF-1 se probó utilizando RNAi de alimentación para derribar hsf-1 antes de exponer los gusanos al estrés. Se encontró que el derribo de hsf-1 causó una disminución dramática en el movimiento normal, con >95% de los gusanos mostrando movimiento brusco o parálisis después de ser empujado con un pico de alambre de platino.

Comparamos este ensayo termorecovery con un ensayo organismal alternativo ampliamente utilizado comúnmente conocido como termotolerancia. En el ensayo de termolerencia, los gusanos se exponen a una temperatura continua de 35 oC utilizando una incubadora seca, y el porcentaje de gusanos vivos se mide en varios puntos de tiempo. Utilizando este ensayo, se encontró que los gusanos de control expuestos continuamente a 35 oC murieron después de aproximadamente 8 horas de exposición (Figura 4B). Sin embargo, cuando la dependencia de este ensayo en HSF-1 se probó utilizando la reducción de RNAi, se encontró que la inhibición de hsf-1 no causó una disminución en la termolerance. Se han demostrado resultados similares utilizando mutaciones de HSF-1 (ver Discusión). Por lo tanto, no se recomienda el uso del ensayo de termotolerancia para medir el HSR, y el termorecovery es el método preferido para examinar el HSR a nivel de organismo.

Figura 1: Inducción de HSR medida con reporteros fluorescentes. (A) La expresión basal y( B) inducible por calor de hsp-70p::gfp y hsp-16.2p::gfp reporter cepas después de 1 h de choque térmico a 33 oC en un baño de agua o incubadora. Los gusanos se criaron en la bacteria OP50 durante 64 h, se impactaron térmicamente y luego se recuperaron a 20 oC durante 8 h antes de la toma de imágenes. Como referencia, los gusanos sin choque térmico en (A) se renormalizaron en (B) para que coincidan con el alcance y la saturación de los gusanos con choque térmico. Se muestran imágenes representativas de dos réplicas experimentales. Barra de escala de 250 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: La inducción del HSR medida con reporteros fluorescentes depende de HSF-1. Las cepas que contienen los reporteros hsp-70p::gfp y hsp-16.2p::gfp aumentaron al control (L4440 vector vacío) o las placas hsf-1 RNAi durante 64 h, se expusieron a un choque térmico de 1 h a 33 oC en un baño de agua, y luego se recuperaron a 20 oC durante 8 h antes de la toma de imágenes. Se muestran imágenes representativas de dos réplicas experimentales. Barra de escala de 250 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Inducción del HSR medida con RT-qPCR. Los gusanos N2 se criaron en bacterias HT115 durante 60 h y luego se impactaron térmicamente durante 1 h en un baño de agua de 33oC. Los niveles relativos de ARNm de hsp-70 (C12C8.1) y hsp-16.2 se muestran normalizados a un control sin choque térmico. Los valores trazados son la media de cuatro réplicas biológicas y las barras de error representan sem. SeM. La significación estadística se calculó utilizando la prueba t de un estudiante no parís. **p < 0.01. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: La termorresono, pero no la termotolerancia, depende de HSF-1. Los gusanos N2 se elevaron en control (L4440) o las placas hsf-1 RNAi durante 60 h y luego se cambiaron a: (A) Un baño de agua de 33 oC durante 6 h y se recuperaron a 20 oC durante 48 horas antes de anotar para el movimiento normal (termorecovery), o (B) A 35 oC de incubadora seca y se extrajo cada 2 h hasta muerto (termolerantencia). Cada ensayo se realizó con n .30 individuos en 2 días independientes. Se muestra el promedio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los autores no tienen nada que revelar.