Cuantificación simultánea de kynureninas seleccionadas analizadas por cromatografía líquida-espectrometría de masas en medio recogido de cultivos celulares oncológicos

Summary

Aquí se describe un protocolo para la determinación de cuatro metabolitos triptófanos diferentes generados en la vía kynurenina (kynurenina, 3-hidroxikynurenina, ácido xanthurenic, ácido 3-hidroxiyanthranilic) en el medio recogido de cultivos celulares cancerosos analizados por cromatografía líquida junto con una sola espectrometría de masa cuadrúpeda.

Abstract

La vía kynurenina y los catabolitos de triptófano llamados kynurenines han recibido mayor atención por su participación en la regulación inmune y la biología del cáncer. Un ensayo de cultivo celular in vitro se utiliza a menudo para aprender sobre la contribución de diferentes catabolitos de triptófano en un mecanismo de la enfermedad y para probar estrategias terapéuticas. Medio de cultivo celular que es rico en metabolitos secretados y moléculas de señalización refleja el estado del metabolismo del triptófano y otros eventos celulares. Se desean nuevos protocolos para la cuantificación confiable de múltiples kynurenines en el complejo medio de cultivo celular para permitir un análisis fiable y rápido de múltiples muestras. Esto se puede lograr con cromatografía líquida junto con espectrometría de masas. Esta potente técnica se emplea en muchos laboratorios clínicos y de investigación para la cuantificación de metabolitos y se puede utilizar para medir kynurenines.

Aquí se presenta el uso de cromatografía líquida junto con espectrometría de masas de cuadrúpedo único (LC-SQ) para la determinación simultánea de cuatro kynureninas, es decir, kynurenina, 3-hidroxikynurenina, 3-hidroxiyanthranilic, y ácido xanthurenic en el medio recogido de células cancerosas cultivadas in vitro. Sq detector es fácil de usar y menos costoso en comparación con otros espectrómetros de masa. En el análisis SQ-MS, se generan y separan varios iones de la muestra según su relación de masa a carga específica(m/z),seguida de la detección mediante un modo de supervisión de iones únicos (SIM).

Este documento llama la atención sobre las ventajas del método notificado e indica algunos puntos débiles. Se centra en elementos críticos del análisis LC-SQ, incluida la preparación de muestras junto con la cromatografía y el análisis de espectrometría de masas. También se discuten el control de calidad, las condiciones de calibración del método y los problemas de efecto de matriz. Describimos una simple aplicación de 3-nitrotirosina como un estándar analógico para todos los analitos de destino. Como confirman los experimentos con óvulos humanos y células de cáncer de mama, el método LC-SQ propuesto genera resultados confiables y se puede aplicar aún más a otros modelos celulares in vitro.

Introduction

La vía kynurenina (KP) es la principal ruta del catabolismo del triptófano (Trp) en las células humanas. Indoleamina-2,3-dioxigenasa (IDO-1) en células extrahepáticas es la primera enzima limitante de KP y convierte Trp en N-formylkynurenine¹. Otros pasos dentro de KP generan otros metabolitos secundarios, a saber, kynurenines que exhiben varias propiedades biológicas. Kynurenine (Kyn) es el primer catabolito Trp estable que muestra propiedades tóxicas y regula los eventos celulares después de unirse al receptor de hidrocarburos aryl (AhR)². Posteriormente, Kyn se transforma en varias moléculas, ya sea espontáneamente o ....

Protocol

1. Preparación de soluciones estándar de stock estándar 3NT, Kyn, 3HKyn, 3HAA, XA

1. Pesar los reactivos en un vial con la mayor precisión (0,3 mg cada uno). Para una mayor precisión, escale los reactivos, ajustando el volumen del disolvente según el paso 1.2.
2. Disolver los reactivos en 300 μL del disolvente para obtener una solución de stock de 1 g/L. Disolver 3NT en 1% (v/v) ácido fórmico (FA) en agua; Kyn, 3HAA y XA en sulfóxido de dimetil (DMSO); 3HQuilino en agua acidificada al pH 2.5 con ácido clorhídrico (HCl).
   PRECAUCIÓN: 3HAA irrita los ojos, la nariz, la garganta y los pulmones. Es perjudicial cuando se inhala, en contacto con la piel y si....

Results

LC-MS presenta ventajas indiscutibles en la cuantificación de moléculas biológicamente activas, a pesar de que algunos componentes de especímenes complejos causan los llamados efectos de matriz y comprometen la ionización de analitos. Conduce a la supresión de iones o mejora de iones, disminuyendo fuertemente la precisión y afectando a un límite de detección/cuantificación de LC-MS, que se considera como un punto ''débil' del método. En nuestro protocolo, los iones son generados por la ionización de electrospray (ESI) en.......

Discussion

Este documento presenta un protocolo detallado LC-SQ para la cuantificación simultánea de cuatro metabolitos Trp principales (3HKyn, Kyn, 3HAA, XA) que se miden en un medio a partir de células cancerosas humanas cultivadas in vitro. Se presta especial atención a la preparación de la muestra, el procedimiento de espectrometría cromatográfica/de masas y la interpretación de datos, los puntos más importantes dentro del análisis.

En general, el análisis LC-MS, debido a la alta sensibilida.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-hidroksy-DL-kynurenina	Sigma-Aldrich	H1771
Ácido 3-hidroxiantranílico	Sigma-Aldrich	148776	97%
3-nitro-L-tirosina	Sigma-Aldrich	N7389
Acetonitrilo	Supelco	1.00029	hypergrade para LC-MS LiChrosolv
Carbón activado	Supelco	05105	polvo
Balanza analítica	Ohaus
Columna analítica	Agilent Technologies	959764-902	Zorbax Eclipse Plus C18 resolución rápida HT (2,1 x 100 mm, 1,8 y micro; m)
formiato de amonio	Supelco	7022	para LC-MS, LiChropur, ≥ 99.0%
Albúmina sérica bovina	Sigma 1001887398
Tapones para viales cromatográficos	Agilent Technologies	5185-5820	tapones de rosca azules,PTFE/sil rojo sepa
Placa de cultivo celular	Nest	704004	poliestireno, no pirogénico, estéril
Placa de cultivo celular	Biologix	07-6012	de 12 pocillos, no pirogénico, no tóxico, estéril
Incubadora de células	Thermo Fisher Scientific		HERAcell 150i
Centrífuga	Cu Eppendorf		modelo 5415R
Centrífuga	Eppendorf		modelo 5428
Tubos de centrífuga	Bionovo	B-2278	tipo Eppendorf, 1,5 mL
Tubos de centrífuga	Bionovo	B-3693	Tipo halcón, 50 mL, PP
Datos cromatográficos software de adquisición y análisis	Agilent Technologies		LC/MSD ChemStation (B.04.03-S92)
Viales de inserción cromatográfica	Agilent Technologies	9301-1387	100 µ L
Viales cromatográficos	Agilent Technologies	5182-0714	2 mL, vidrio transparente
Dimetilsulfóxido	Supelco	1.02950	Uvasol
Dubelcco' s Águila Modificada' s Medio (DMEM)	PAN Biotech	P04-41450
Medidor doble de pH/conductividad	Mettler Toledo		SevenMulti
Evaporador	Genevac		modelo EZ-2.3 Elite
Suero fetal bovino	Sigma-Aldrich	F9665
Ácido fórmico	Supelco	5.33002	para LC-MS LiChropur
Frasco de vidrio para almacenamiento	de reactivosBionovo	S-2070	50 mL, columna de protección de vidrio transparente
	Agilent Technologies	959757-902	Zorbax Eclipse Plus-C18 Columna de protección de diámetro estrecho (2,1 x 12,5 mm, 5 y micro; m)
Ácido clorhídrico	Merck	1.00317.1000
L-quinurenina	Sigma-Aldrich	K8625	≥ 98% (HPLC)
Agitador magnético	Wigo		ES 21 H
Microbalanza	Mettler Toledo		modelo XP6
Sistema Milli-Q	Millipore	ZRQSVPO30	Direct-Q 3 UV con bomba
Espectrómetro de masas cuadrupolar	Agilent Technologies	G1948B	modelo 6120
Penicilina-Estreptomicina	Sigma-Adrich	048M4874V
Lector de placas	Bio Tek		Synergy 2 operado por Gen5
Cloruro de potasio	Merck	1.04936.1000
Dihidrógeno fosfato de potasio	Merck	1.05108.0500
Ensayo de proteínas Concentrado de reactivo de colorante	BioRad	500-0006
Balancín balancín	Stuart	SSL4
Pipeta serológica	Nido	326001	5 mL, poliestireno, no pirógeno, estéril
Cloruro de sodio	Sigma-Aldrich	7647-14-5
Fosfato de sodio dibásico	Merck	1.06346.1000
Filtro de entrada de disolvente	Agilent Technologies	5041-2168	filtro de vidrio, 20 μ m tamaño de poro
Depósito de disolvente (para LC-MS)	Agilent Technologies	9301-6524	1 L, vidrio transparente
Depósito de disolvente (para LC-MS)	Agilent Technologies	9301-6526	1 L, vidrio ámbar
Programa de hojas de cálculo	Microsoft Office		Microsoft Office Excel
Barra de agitación	Bionovo	6-2003	recubierta de teflón
Filtros de jeringa para cultivo filtración media	Bionovo	7-8803	celulosa regenerada, Ø 30 mm, 0,45 y micro; m
Filtros de jeringa para la filtración de componentes de fase móvil	Bionovo	6-0018	nylon, Ø 30 mm, 0,22 µ m
Placas de cultivo de tejidos	VWR	10062-900	96 pocillos, estéril
Solución de tripsina-EDTA	Sigma-Aldrih	T4049-100 mL
Sistema de cromatografía líquida de ultra alta resolución	Agilent Technologies	G1367D, G1379B, G1312B, G1316C	1200 El sistema Infinity consta de muestreador automático (G1367D), desgasificador (G1379B), bomba binaria (G1312B), termostato de columna (G1316C)
Baño de ultrasonidos	Polsonic		104533 modelo 6D
Vortex	Biosan		modelo V-1 más
ácido xanturénico	Sigma-Aldrich	D120804	96%