Aquí se describe un protocolo para la determinación de cuatro metabolitos triptófanos diferentes generados en la vía kynurenina (kynurenina, 3-hidroxikynurenina, ácido xanthurenic, ácido 3-hidroxiyanthranilic) en el medio recogido de cultivos celulares cancerosos analizados por cromatografía líquida junto con una sola espectrometría de masa cuadrúpeda.
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Artículo de método
Cuantificación simultánea de kynureninas seleccionadas analizadas por cromatografía líquida-espectrometría de masas en medio recogido de cultivos celulares oncológicos
En este artículo
Resumen
Resumen
La vía kynurenina y los catabolitos de triptófano llamados kynurenines han recibido mayor atención por su participación en la regulación inmune y la biología del cáncer. Un ensayo de cultivo celular in vitro se utiliza a menudo para aprender sobre la contribución de diferentes catabolitos de triptófano en un mecanismo de la enfermedad y para probar estrategias terapéuticas. Medio de cultivo celular que es rico en metabolitos secretados y moléculas de señalización refleja el estado del metabolismo del triptófano y otros eventos celulares. Se desean nuevos protocolos para la cuantificación confiable de múltiples kynurenines en el complejo medio de cultivo celular para permitir un análisis fiable y rápido de múltiples muestras. Esto se puede lograr con cromatografía líquida junto con espectrometría de masas. Esta potente técnica se emplea en muchos laboratorios clínicos y de investigación para la cuantificación de metabolitos y se puede utilizar para medir kynurenines.
Aquí se presenta el uso de cromatografía líquida junto con espectrometría de masas de cuadrúpedo único (LC-SQ) para la determinación simultánea de cuatro kynureninas, es decir, kynurenina, 3-hidroxikynurenina, 3-hidroxiyanthranilic, y ácido xanthurenic en el medio recogido de células cancerosas cultivadas in vitro. Sq detector es fácil de usar y menos costoso en comparación con otros espectrómetros de masa. En el análisis SQ-MS, se generan y separan varios iones de la muestra según su relación de masa a carga específica(m/z),seguida de la detección mediante un modo de supervisión de iones únicos (SIM).
Este documento llama la atención sobre las ventajas del método notificado e indica algunos puntos débiles. Se centra en elementos críticos del análisis LC-SQ, incluida la preparación de muestras junto con la cromatografía y el análisis de espectrometría de masas. También se discuten el control de calidad, las condiciones de calibración del método y los problemas de efecto de matriz. Describimos una simple aplicación de 3-nitrotirosina como un estándar analógico para todos los analitos de destino. Como confirman los experimentos con óvulos humanos y células de cáncer de mama, el método LC-SQ propuesto genera resultados confiables y se puede aplicar aún más a otros modelos celulares in vitro.
Introducción
La vía kynurenina (KP) es la principal ruta del catabolismo del triptófano (Trp) en las células humanas. Indoleamina-2,3-dioxigenasa (IDO-1) en células extrahepáticas es la primera enzima limitante de KP y convierte Trp en N-formylkynurenine1. Otros pasos dentro de KP generan otros metabolitos secundarios, a saber, kynurenines que exhiben varias propiedades biológicas. Kynurenine (Kyn) es el primer catabolito Trp estable que muestra propiedades tóxicas y regula los eventos celulares después de unirse al receptor de hidrocarburos aryl (AhR)2. Posteriormente, Kyn se transforma en varias moléculas, ya sea espontáneamente o ....
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Protocolo
1. Preparación de soluciones estándar de stock estándar 3NT, Kyn, 3HKyn, 3HAA, XA
- Pesar los reactivos en un vial con la mayor precisión (0,3 mg cada uno). Para una mayor precisión, escale los reactivos, ajustando el volumen del disolvente según el paso 1.2.
- Disolver los reactivos en 300 μL del disolvente para obtener una solución de stock de 1 g/L. Disolver 3NT en 1% (v/v) ácido fórmico (FA) en agua; Kyn, 3HAA y XA en sulfóxido de dimetil (DMSO); 3HQuilino en agua acidificada al pH 2.5 con ácido clorhídrico (HCl).
PRECAUCIÓN: 3HAA irrita los ojos, la nariz, la garganta y los pulmones. Es perjudicial cuando se inhala, en contacto con la piel y si....
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Resultados
LC-MS presenta ventajas indiscutibles en la cuantificación de moléculas biológicamente activas, a pesar de que algunos componentes de especímenes complejos causan los llamados efectos de matriz y comprometen la ionización de analitos. Conduce a la supresión de iones o mejora de iones, disminuyendo fuertemente la precisión y afectando a un límite de detección/cuantificación de LC-MS, que se considera como un punto ''débil' del método. En nuestro protocolo, los iones son generados por la ionización de electrospray (ESI) en.......
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Discusión
Este documento presenta un protocolo detallado LC-SQ para la cuantificación simultánea de cuatro metabolitos Trp principales (3HKyn, Kyn, 3HAA, XA) que se miden en un medio a partir de células cancerosas humanas cultivadas in vitro. Se presta especial atención a la preparación de la muestra, el procedimiento de espectrometría cromatográfica/de masas y la interpretación de datos, los puntos más importantes dentro del análisis.
En general, el análisis LC-MS, debido a la alta sensibilida.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por la Unión Europea del Fondo Europeo de Desarrollo Regional en el marco del Programa Operativo de Desarrollo de Polonia Oriental 2007-2013 (POPW.01.03.00-06-003/09-00), por la Facultad de Biotecnología y Ciencias Ambientales de la Universidad Católica Juan Pablo II de Lublin (Beca de Jóvenes Científicos para Ilona Sadok), Centro Nacional de Ciencias de Polonia, OPUS13 (2017/25/B/NZ4/01198 para Magdalena Staniszewska, Investigadora Principal). Los autores agradecen a la Profesora Agnieszka Ścibior del Laboratorio de Estrés Oxidativo, Centro de Investigación Interdisciplinaria, JPII CUL por compartir el equipo para la cultulación celular y cu....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 3-hidroksy-DL-kynurenina | Sigma-Aldrich | H1771 | |
| Ácido 3-hidroxiantranílico | Sigma-Aldrich | 148776 | 97% |
| 3-nitro-L-tirosina | Sigma-Aldrich | N7389 | |
| Acetonitrilo | Supelco | 1.00029 | hypergrade para LC-MS LiChrosolv |
| Carbón activado | Supelco | 05105 | polvo |
| Balanza analítica | Ohaus | ||
| Columna analítica | Agilent Technologies | 959764-902 | Zorbax Eclipse Plus C18 resolución rápida HT (2,1 x 100 mm, 1,8 y micro; m) |
| formiato de amonio | Supelco | 7022 | para LC-MS, LiChropur, ≥ 99.0% |
| Albúmina sérica bovina | Sigma 1001887398 | ||
| Tapones para viales cromatográficos | Agilent Technologies | 5185-5820 | tapones de rosca azules,PTFE/sil rojo sepa |
| Placa de cultivo celular | Nest | 704004 | poliestireno, no pirogénico, estéril |
| Placa de cultivo celular | Biologix | 07-6012 | de 12 pocillos, no pirogénico, no tóxico, estéril |
| Incubadora de células | Thermo Fisher Scientific | HERAcell 150i | |
| Centrífuga | Cu Eppendorf | modelo 5415R | |
| Centrífuga | Eppendorf | modelo 5428 | |
| Tubos de centrífuga | Bionovo | B-2278 | tipo Eppendorf, 1,5 mL |
| Tubos de centrífuga | Bionovo | B-3693 | Tipo halcón, 50 mL, PP |
| Datos cromatográficos software de adquisición y análisis | Agilent Technologies | LC/MSD ChemStation (B.04.03-S92) | |
| Viales de inserción cromatográfica | Agilent Technologies | 9301-1387 | 100 µ L |
| Viales cromatográficos | Agilent Technologies | 5182-0714 | 2 mL, vidrio transparente |
| Dimetilsulfóxido | Supelco | 1.02950 | Uvasol |
| Dubelcco' s Águila Modificada' s Medio (DMEM) | PAN Biotech | P04-41450 | |
| Medidor doble de pH/conductividad | Mettler Toledo | SevenMulti | |
| Evaporador | Genevac | modelo EZ-2.3 Elite | |
| Suero fetal bovino | Sigma-Aldrich | F9665 | |
| Ácido fórmico | Supelco | 5.33002 | para LC-MS LiChropur |
| Frasco de vidrio para almacenamiento | de reactivosBionovo | S-2070 | 50 mL, columna de protección de vidrio transparente |
| Agilent Technologies | 959757-902 | Zorbax Eclipse Plus-C18 Columna de protección de diámetro estrecho (2,1 x 12,5 mm, 5 y micro; m) | |
| Ácido clorhídrico | Merck | 1.00317.1000 | |
| L-quinurenina | Sigma-Aldrich | K8625 | ≥ 98% (HPLC) |
| Agitador magnético | Wigo | ES 21 H | |
| Microbalanza | Mettler Toledo | modelo XP6 | |
| Sistema Milli-Q | Millipore | ZRQSVPO30 | Direct-Q 3 UV con bomba |
| Espectrómetro de masas cuadrupolar | Agilent Technologies | G1948B | modelo 6120 |
| Penicilina-Estreptomicina | Sigma-Adrich | 048M4874V | |
| Lector de placas | Bio Tek | Synergy 2 operado por Gen5 | |
| Cloruro de potasio | Merck | 1.04936.1000 | |
| Dihidrógeno fosfato de potasio | Merck | 1.05108.0500 | |
| Ensayo de proteínas Concentrado de reactivo de colorante | BioRad | 500-0006 | |
| Balancín balancín | Stuart | SSL4 | |
| Pipeta serológica | Nido | 326001 | 5 mL, poliestireno, no pirógeno, estéril |
| Cloruro de sodio | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| Fosfato de sodio dibásico | Merck | 1.06346.1000 | |
| Filtro de entrada de disolvente | Agilent Technologies | 5041-2168 | filtro de vidrio, 20 μ m tamaño de poro |
| Depósito de disolvente (para LC-MS) | Agilent Technologies | 9301-6524 | 1 L, vidrio transparente |
| Depósito de disolvente (para LC-MS) | Agilent Technologies | 9301-6526 | 1 L, vidrio ámbar |
| Programa de hojas de cálculo | Microsoft Office | Microsoft Office Excel | |
| Barra de agitación | Bionovo | 6-2003 | recubierta de teflón |
| Filtros de jeringa para cultivo filtración media | Bionovo | 7-8803 | celulosa regenerada, Ø 30 mm, 0,45 y micro; m |
| Filtros de jeringa para la filtración de componentes de fase móvil | Bionovo | 6-0018 | nylon, Ø 30 mm, 0,22 µ m |
| Placas de cultivo de tejidos | VWR | 10062-900 | 96 pocillos, estéril |
| Solución de tripsina-EDTA | Sigma-Aldrih | T4049-100 mL | |
| Sistema de cromatografía líquida de ultra alta resolución | Agilent Technologies | G1367D, G1379B, G1312B, G1316C | 1200 El sistema Infinity consta de muestreador automático (G1367D), desgasificador (G1379B), bomba binaria (G1312B), termostato de columna (G1316C) |
| Baño de ultrasonidos | Polsonic | 104533 modelo 6D | |
| Vortex | Biosan | modelo V-1 más | |
| ácido xanturénico | Sigma-Aldrich | D120804 | 96% |
Referencias
- Li, F., Zhang, R., Li, S., Liu, J. IDO1: an import ant immunotherapy target in cancer treatment. International Immunopharmacology. 47, 70-77 (2017).
- Heng, B., et al. Understanding the role of the kynurenine pathway in human breast cancer immun....
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Reimpresiones y permisos
