Uso de la citometría de flujo para detectar y cuantificar la formación de sangre alterada en el pez cebra en desarrollo

Resumen

Este ensayo es un método simple para cuantificar las células hematopoyéticas en el desarrollo de peces cebra embrionarios. Los glóbulos del pez cebra disociado se someten a análisis de citometría de flujo. Esto permite la detección de defectos sanguíneos en animales mutantes y después de la modificación genética.

Resumen

La diversidad de linajes celulares que comprenden sangre madura en animales vertebrados surge de la diferenciación de células hematopoyéticas madre y progenitoras (HSPCs). Este es un proceso crítico que ocurre a lo largo de la vida útil de los organismos, y la interrupción de las vías moleculares implicadas durante la embriogénesis puede tener consecuencias catastróficas a largo plazo. Por multitud de razones, el pez cebra(Danio rerio)se ha convertido en un organismo modelo para estudiar la hematopoyesis. Los embriones de pez cebra se desarrollan externamente, y para 7 días la posfertilización (dpf) han producido la mayoría de los subtipos de células sanguíneas definitivas que persistirán durante su vida útil. Se han desarrollado ensayos para evaluar el número de células hematopoyéticas, utilizando principalmente manchas histológicas específicas, técnicas de hibridación in situ y microscopía de animales transgénicos que utilizan promotores específicos de células sanguíneas que impulsan la expresión de proteínas fluorescentes. Sin embargo, la mayoría de los ensayos de tinción y las técnicas de hibridación in situ no cuantifican con precisión el número de células sanguíneas presentes; sólo las grandes diferencias en el número de celdas se visualizan fácilmente. La utilización de animales transgénicos y el análisis de individuos con microscopía fluorescente o confocal se pueden realizar, pero la cuantificación de estos ensayos se basa en contar manualmente o utilizar software de imágenes costoso, ambos de los cuales pueden cometer errores. El desarrollo de métodos adicionales para evaluar el número de células sanguíneas sería económico, más rápido e incluso podría automatizarse para evaluar rápidamente el efecto de la modificación genética mediada por CRISPR, la reducción de transcripción mediada por morpholino y el efecto de los compuestos farmacológicos que afectan a la hematopoyesis a gran escala. Este nuevo ensayo para cuantificar las células sanguíneas se realiza desvinculando embriones enteros de pez cebra y analizando la cantidad de células sanguíneas etiquetadas fluorescentemente presentes. Estos ensayos deben permitir la aclaración de las vías moleculares responsables de la generación, expansión y regulación de células sanguíneas durante la embriogénesis, lo que permitirá a los investigadores descubrir aún más nuevos factores alterados durante las enfermedades de la sangre, así como vías esenciales durante la evolución de la hematopoyesis vertebrada.

Introducción

La producción de sangre (hematopoyesis) es un proceso de desarrollo esencial que comienza por primera vez en el embrión temprano. Este proceso comienza generando glóbulos rojos primitivos y macrófagos directamente a partir del mesodermo, y más tarde se desplaza hacia la producción de células madre hematopoyéticas y progenitoras (HSPCs). Estas células madre, que son multipotentes, generan todas las variedades de células sanguíneas maduras en el organismo. Capaz de auto-renovación, el sistema se repone continuamente a través de estos HSPCs. Mientras que este proceso comienza temprano en el desarrollo, hematopoyesis continúa durante la vida del animal, proporcionando la capacidad de transportar oxígeno a sitios distantes del cuerpo, para detener el sangrado después de la lesión, y para proteger el cuerpo de la infección. El desarrollo de este complejo sistema se controla temporal y espacialmente durante el desarrollo y cualquier perturbación en la producción de células sanguíneas puede ser catastrófico para el organismo, lo que resulta en anemia, trombocitopenia, leucopenia y leucemia.

Un modelo animal popular utilizado para la investigación hematopoyética es el pez cebra(Danio rerio)porque tienen un desarrollo sanguíneo similar en comparación con los seres humanos. De hecho, muchos de los genes y vías moleculares utilizados durante la hematopoyesis se conservan a lo largo de la evolución de los vertebrados, lo que nos permite aprender sobre los genes humanos estudiando el pez cebra. Es importante destacar que los embriones de pez cebra se desarrollan fuera del cuerpo y en 7 días han generado la mayoría de los tipos de células sanguíneas maduras, lo que permite la visualización directa del sistema hematopoyético en un corto período de tiempo. El pez cebra también es extremadamente fecunda, lo que permite a los investigadores observar un mayor número de muestras en un corto período de tiempo, lo que también es importante para generar datos reproducibles. El tiempo de corta generación y desarrollo externo del pez cebra prevé una manipulación y observación más sencillas durante los estudios de mutagénesis^1,2,3,4,5 y cribado de drogas^6,7,8,9,10. Esto permite que un panel de compuestos terapéuticos prometedores para los trastornos sanguíneos humanos se pruebe rápida y eficientemente.

Es importante destacar que los peces cebra también son genéticamente aptos, y el genoma se secuencia y anota. Esta tractabilidad permite realizar técnicas genéticas inversas como el derribo mediado por morpholino(MO)y la ablación genética mediada por CRISPR. Los peces cebra también han demostrado su utilidad como modelo para realizar pantallas genéticas delanteras; muchos genes esenciales y vías involucradas en la formación de sangre de vertebrados se han descubierto de esta manera. También se han desarrollado numerosos métodos de observación de células sanguíneas en peces cebra. Si bien existen técnicas tradicionales de tinción histológica, también es posible realizar la hibridación in situ para transcripciones específicas de la sangre. Es importante destacar que también existen numerosas líneas transgénicas de peces mediante las cuales las proteínas fluorescentes son expresadas por promotores específicos del linaje, permitiendo el etiquetado de células sanguíneas específicas con proteínas fluorescentes¹¹. Esto permite a los investigadores realizar observaciones de hasta el minuto de génesis, expansión y regulación de células sanguíneas en un organismo vivo con el tiempo.

En general, la conservación del sistema hematopoyético, la presencia y el fácil desarrollo de líneas transgénicas, la fácil visualización y el corto tiempo de generación han hecho del pez cebra un modelo económico, rápido y adaptable de hematopoyesis. Para mejorar la caja de herramientas de técnicas disponibles para los investigadores de peces cebra, desarrollamos este ensayo para cuantificar sólidamente el número de células sanguíneas en embriones. El método consiste en digerir animales transgénicos y realizar citometría de flujo para glóbulos fluorescentes. De esta manera, las células sanguíneas de animales mutantes, el efecto de la modificación del MO y crispr, y el efecto de las moléculas pequeñas se pueden analizar cuantitativamente de una manera rápida y reproducible. Estos ensayos son formas fáciles de usar y económicas de enumerar las células sanguíneas, permitiendo el examen de su generación, proliferación y mantenimiento a lo largo del tiempo.

Protocolo

El consejo asesor del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad Estatal de California, Chico, aprobó todos los métodos descritos a continuación.

NOTA: Se recomienda tratar embriones con 1-fenilo 2-tiourea (PTU; Tabla 1) a las 24 horas de postfertilización (HPF) para prevenir la pigmentación que afecta negativamente a la discriminación por fluorescencia por citometría de flujo. Todos los procedimientos enumerados a continuación son aceptables para la citometría de flujo y la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS). Sin embargo, si el objetivo de uno es cultivo de las células hematopoyéticas después de FACS, a continuación, adherirse a prácticas estériles al procesar muestras. El protocolo de blanqueo y preparación de muestras de embriones de manera estéril se ha descrito anteriormente^12.

1. Desconorionación de embriones de pez cebra de 48 CV

1. Con embriones (al menos 5, pero no más de 200 embriones) en una placa de Petri de plástico de 10 cm, incline la placa para que los embriones se hundan hasta el borde inferior.
   NOTA: Es fácil inclinar el plato quitando la tapa y colocando la tapa debajo de un borde de la placa Petri.
2. Retire y deseche tanto medio E3(Tabla 1)como sea posible y agregue 500 μL de proteasa de deschorionación (10 mg/ml). Incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos.
3. Después de 5 minutos, recoge la placa De Petri (manteniendo todos los embriones en el borde inferior de la placa), y toca suavemente el lado de la placa De Petri, permitiendo que los embriones se froten suavemente contra la parte inferior de la placa para eliminar completamente las corales.
4. Con una botella de compresión, añadir ~ 20 ml de medio E3 para diluir la proteasa. Permita que los embriones se asienten y retiren el medio E3 decantando.
5. Repita el paso 1.4 3x para eliminar todos los rastros de la proteasa de deschorionation.
   NOTA: Para que cada muestra individual analice, se requieren al menos 5 embriones. Este procedimiento de desconocupación puede acomodar hasta 200 embriones por placa de Petri. Las muestras se pueden agrupar en esta etapa y separarse más tarde si lo desea. Alternativamente, la deschorionación manual se puede realizar desgarrando suavemente los carros con fórceps del relojero. Esto es ventajoso cuando hay un pequeño número de embriones. Por lo general, el pez cebra eclosionará de sus corales por 72 CVf. Sin embargo, es posible que los embriones gravemente malformados no requieran desconorionación (ya sea manual o química) después de ese tiempo.

2. Preparación de muestras de embriones para la disociación

1. Con una pipeta P1000, coloque 5-10 embriones en un solo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
2. Retire el medio E3 con una pipeta y deseche.
   PRECAUCIÓN: Pipeta con cuidado, ya que los embriones se pueden descartar fácilmente durante los siguientes pasos.
3. Añadir 1 ml de 10 mM de ditiotiothreitol (TDT) en medio E3 para eliminar el recubrimiento de moco que rodea el pez cebra embrionario^11,12,13,14. Poner el tubo de microcentrífuga horizontalmente, e incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos.

3. Disociación embrionaria

1. Lave los embriones 3x con 1 ml de solución salina tamponada de fosfato de Dulbecco (DPBS) con Ca²⁺ y Mg²⁺ para eliminar rastros de TDT. Después del último lavado añadir 500 μL de DPBS con Ca²⁺ y Mg²⁺ y 5 μL de 5 mg/ml (26 U/mL) proteasa de disociación.
   NOTA: Se pueden utilizar otras soluciones almacenadas en búfer isotónicas, pero deben contener Ca²⁺ y Mg²⁺ para que la enzima de disociación funcione correctamente.
2. Incuba muestras a 37 °C en una coctelera orbital horizontal a 185 rpm durante 60 min. Triturar embriones con una pipeta P1000 hasta que las muestras estén completamente disociadas.
   PRECAUCIÓN: Tenga cuidado de no sobredigestar los embriones; algún tejido sólido debe estar presente, y no debe ser completamente homogéneo. Es posible sobredigestar, lo que destruirá los glóbulos objetivo que se observarán en el citómetro de flujo(Figura suplementaria 1).
   NOTA: Este procedimiento funciona mejor para embriones de 48-72 HPf. Las etapas posteriores pueden requerir una incubación más larga con proteasa de disociación. El tiempo para diferentes etapas debe determinarse empíricamente. Hay métodos alternativos más rápidos para disociar el tejido embrionario, pero se encuentra empíricamente que este método, aunque toma 60 min, es lo suficientemente suave y exhaustivo como para permitir un aislamiento eficiente de las células hematopoyéticas vivas.

4. Preparación de embriones disociados para la citometría de flujo

1. Pipetear los 5 embriones disociados en el depósito superior de un tubo inferior redondo de poliestireno de 5 ml con una tapa de colador celular de 35 μmM.
2. Enjuague las células añadiendo 4 ml de solución salina tamponada de fosfato (PBS) sin Ca²⁺ o Mg²⁺ a la tapa del colador del tubo de poliestireno de 5 ml que contiene las células filtradas.
   NOTA: También se pueden utilizar otras soluciones amortiguadas isotónicas, pero deben carecer de Ca²⁺ o Mg²⁺ para diluir y hacer que la enzima de disociación sea ineficaz.
3. Tubos centrífugas a 4 °C y 300 x g durante 5 minutos para peletizar las células. Con una pipeta, retire y deseche el sobrenadante. Resuspend las células en 500 μL de PBS (sin Ca²⁺ o Mg^2+).

5. Cytometría de flujo

1. Vórtice suave la suspensión celular y añadir 1:1,000 manchas de células muertas rojas (Tabla de Materiales).
   NOTA: La mancha roja de células muertas es un tinte permeable a las células que permite la exclusión de células muertas y desechos de las células objetivo y es una excelente opción de tinte para la discriminación celular muerta, ya que está excitado por el láser de 633 nm, que es diferente del láser de 488 nm utilizado para excitar fluoróforos comunes como la proteína fluorescente verde (GFP) y DsRed. De esta manera, no hay superposición espectral de células muertas y células sanguíneas transgénicas. El yoduro de propidio (PI) a 1 mg/ml es una alternativa barata a la mancha roja de células muertas, pero asegúrese de reservar algunas muestras manchadas sólo con PI, así como muestras sólo con el fluoróforo de interés para establecer la compensación del instrumento. De lo contrario, las señales de PI y fluoróforos como GFP se superponen, lo que resulta en resultados falsos positivos. Si el citómetro de flujo también tiene un láser de 405 nm, otros tintes como la mancha de la célula de papá azul también son una excelente opción.
   PRECAUCIÓN: Al analizar los glóbulos, tenga en cuenta que después de 30 minutos ciertos tipos de células comenzarán a fagocitos de la mancha roja de células muertas. Mantenga las células protegidas de la luz y del hielo hasta su análisis y realice la citometría de flujo en un plazo de 30 minutos a partir de la adición del tinte.
2. Análisis de citometría de flujo
   NOTA: Cada cytómetro de flujo es un poco diferente, pero los siguientes pasos ayudarán a preparar muestras para su análisis en la mayoría de las máquinas. Para los usuarios nuevos para fluir citometría, busque el consejo de alguien que es un experto en la pieza de equipo en particular. Las siguientes instrucciones pertenecen al cytómetro de flujo BD FACSAria Fusion.
   1. Encienda el citómetro y permita que los láseres se calienten durante 20 minutos. Depósito de residuos vacío, llenar el depósito de vaina con la solución adecuada (varía en función del citómetro de flujo) e iniciar el sistema de fluidos.
      NOTA: Por lo general, hay un procedimiento de inicio determinado para cada tipo de cytómetro de flujo; seguir ese procedimiento de inicio cuidadosamente.
   2. En el software de análisis, dibuje cinco gráficas (Figura 1A).
      1. Tenga la primera gráfica de puntos medir dispersión hacia adelante (FSC) en el eje x y dispersión lateral (SSC) en el eje y. Establezca fsc como lineal y SSC como registro.
         NOTA: EL FSC es una medida del tamaño de la célula, y SSC es una medida de granularidad; esto permitirá la discriminación de las células de los desechos. Las poblaciones embrionarias de células sanguíneas de pez cebra no se separan por tamaño y granularidad de la misma manera que las células sanguíneas adultas de pez cebra descritas anteriormente¹⁵. En su lugar, aparecerán en la misma población con todas las demás células embrionarias digeridas.
      2. Establezca el segundo trazado para examinar la altura FSC (H) frente a la anchura FSC (W). Establezca el tercer trazado para medir SSC (H) frente a SSC (W).
         NOTA: Este paso se utiliza para excluir los dobletes (celdas que están pegadas juntas cuando pasan a través del láser).
      3. Establezca el trazado del cuarto punto para medir la mancha roja de la célula muerta en el eje x (dependiendo del citómetro esto suele ser equivalente al filtro utilizado para la aloficocianina [APC]) y SSC en el eje y. Esto permitirá la discriminación de las células vivas de las células muertas.
         NOTA: Los conjuntos de filtros de cada cytometer pueden ser diferentes. Asegúrese de utilizar el filtro de detección correcto para el tinte de discriminación de células muertas.
      4. La quinta parcela mide el flúor de elección. Visualice esto como un histograma del flúor (Figura 1) o utilice una gráfica de puntos (Figura suplementaria 2).
         NOTA: Al examinar más de un flúor en el mismo animal, se recomienda utilizar una gráfica de puntos para ver ambos parámetros al mismo tiempo. Si existe alguna posibilidad de que los fluoróforos tengan superposición espectral entre sí(Figura suplementaria 2),también se recomienda una gráfica de puntos. Utilice los ajustes de Área (A) para calcular el área bajo la curva generada por el pulso láser del cytómetro para todos los parámetros, ya que son más precisos.
   3. Cargue la muestra y reduzca el caudal para que la muestra no se agote rápidamente. Ajuste la configuración fsc y SSC para que la mayor parte de la población celular se pueda ver claramente (Figura 1A).
   4. Dibuje una puerta alrededor de la población celular y etiquete las celdas. Asegurándose de que la segunda gráfica de puntos esté cerrada en las celdas, excluya los dobletes primero gating en fsc y luego en singletes SSC.
   5. En la cuarta gráfica ajustar la configuración de manchas de celda muerta roja para que haya claramente una población negativa. Dibuje una puerta alrededor de estas celdas y etiquete las celdas vivas. En la quinta parcela, puerta en las células vivas y examinar las células negativas y positivas del fósforo. Dibuje una puerta alrededor de las celdas positivas.
      NOTA: Esta estrategia jerárquica de gating examina un solo fósforo₊ células que residen en la puerta de las células vivas, que también residen en la puerta de la celda. Se encargue de establecer las puertas correctamente. Estas puertas se pueden personalizar dependiendo del experimento.
   6. Ejecute cada ejemplo, recopilando al menos 25.000 eventos de células en vivo.
   7. Siga el procedimiento de apagado para apagar los fluidos. Rellene el tanque de vaciar y vacíe el tanque de residuos.
      NOTA: A menudo es difícil visualizar flúor⁺ células cuando la expresión proteica es baja, o la población celular es rara. Para garantizar que los parámetros se establecen correctamente, el fluoróforo^- embriones hermanos deben prepararse junto con para dibujar correctamente las puertas y ajustar las tensiones láser (Figura suplementaria 2). Si la población celular objetivo es rara, recopile más de 25.000 eventos. Con 5-10 animales digeridos, uno debe ser capaz de recoger millones de eventos. El número total de fluoróforos⁺ células también se puede obtener con estos datos. Basta con contar el número total de células de la muestra con un hemociclo y multiplicar el porcentaje de fluoróforo⁺ células para obtener el número absoluto de fluoroforo⁺ células por pez.

Resultados

Para enumerar los glóbulos rojos en el pez cebra embrionario, se inyectaron¹⁶ embriones lcr:GFP 16 en una etapa celular con PBS, 7.0 ng/nL ism1 MO, o 7.0 ng/nL ism1 MO con 7.0 ng ism1 mRNA^12. A 48 CV fueron digeridos y sometidos a análisis de citometría de flujo. Después de analizar el porcentaje de GFP⁺ glóbulos rojos de cada muestra (cada muestra es 5 embriones seleccionados aleatoriamente;

Discusión

El pez cebra es un excelente sistema modelo para estudiar la hematopoyesis de vertebrados primitiva y definitiva. En las últimas décadas, se han desarrollado y refinado múltiples ensayos, permitiendo que el pez cebra se convierta en un modelo rápido y económico para probar fármacos, generar y probar mutantes genéticos, y en general permitiendo a los investigadores analizar vías moleculares esenciales para la hematopoyesis. Este protocolo utiliza peces cebra embrionarios que permiten una recopilación rápida de datos, el u...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tubo MCF de 1,5 ml	FisherBrand	05-408-129
Placa de Petri de poliestireno easygrip de 10 mm	Corning Falcon	351008
5 ml Tubo de fondo redondo de poliestireno con tapón de filtro de células	Corning Falcon	352235
BD FACSAria Citómetro de flujo de fusión	BD Biosciences
Dithiolthreitol (DTT)	Sigma-Aldrich
DPBS (10x) con Ca2+ y Mg2+	Life Technologies	14080-055
FBS 500 mL	Gemini Bio-Products	100-108
HyClone PBS (1x)	GE Healthcare Life Sciences	sh30256.01
Libreasa	Roche Sigma-Aldrich	5401119001	proteasa
de disociaciónPronase	Roche Sigma-Aldrich	11459643001	proteasa de decorionación
SYTOX Tinción de células muertas rojas	Invitrogen	S34859