Artículo de método

Doble en electroporación de utero para apuntar a poblaciones celulares separadas temporal y espacialmente

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DOI:

10.3791/61046

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14 de junio de 2020

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1Estructura de Recerca Interdisciplinar en Biotecnología y Biomedicina (ERI BIOTECMED), Departamento de Biología Celular, Biología Funcional y Antropología Física, Universidad de Valencia

Autores correspondientes: Cristina Gil-Sanz <cristina.gil@uv.es>

En este artículo

Resumen

La electroporación doble en el útero permite apuntar a las poblaciones celulares que están separadas espacial y temporalmente. Esta técnica es útil para visualizar las interacciones entre las poblaciones celulares que utilizan proteínas fluorescentes en condiciones normales, pero también después de experimentos funcionales para perturbar los genes de interés.

Resumen

En la electroporación del útero es una técnica de transferencia de ADN in vivo ampliamente utilizada para estudiar los mecanismos moleculares y celulares subyacentes a la corticogénesis de los mamíferos. Este procedimiento aprovecha los ventrículos cerebrales para permitir la introducción del ADN de interés y utiliza un par de electrodos para dirigir la entrada del material genético hacia las células que recubren el ventrículo, las células madre neurales. Este método permite a los investigadores etiquetar las células deseadas y/o manipular la expresión de genes de interés en esas células. Tiene múltiples aplicaciones, incluyendo ensayos dirigidos a la migración neuronal, rastreo de linaje y búsqueda de rutas axonales. Una característica importante de este método es su control temporal y regional, permitiendo la elusión de posibles problemas relacionados con la letalidad embrionaria o la falta de ratones conductores de CRE específicos. Otro aspecto relevante de esta técnica es que ayuda a reducir considerablemente las limitaciones económicas y temporales que implican la generación de nuevas líneas de ratón, que se vuelven particularmente importantes en el estudio de las interacciones entre los tipos celulares que se originan en áreas distantes del cerebro a diferentes edades de desarrollo. Aquí describimos una estrategia de electroporación doble que permite la focalización de poblaciones celulares que están separadas espacial y temporalmente. Con este enfoque podemos etiquetar diferentes subtipos de células en diferentes ubicaciones con proteínas fluorescentes seleccionadas para visualizarlas, y/o podemos manipular genes de interés expresados por estas diferentes células en los momentos adecuados. Esta estrategia mejora el potencial de la electroporación del útero y proporciona una poderosa herramienta para estudiar el comportamiento de las poblaciones celulares separadas temporal y espacialmente que migran para establecer contactos cercanos, así como las interacciones de largo alcance a través de proyecciones axonales, reduciendo los costos temporales y económicos.

Introducción

La corteza cerebral es una estructura muy compleja e intrincadamente organizada. Para lograr tal grado de organización, las neuronas de proyección cortical pasan por complejos procesos de desarrollo que requieren su generación temporal, la migración a su destino final en la placa cortical, y el establecimiento de conexiones de corto y largo alcance1,,2. Durante mucho tiempo, la forma clásica de estudiar la corticogénesis se basó en el uso de modelos murinos knockout o knock-in de genes de interés. Sin embargo, esta estrategia, y en particular el uso de ratones noqueadores condicionales, consume mucho tiempo y es costosa, y a veces presenta problemas adicionales con respecto a la existencia de redundancia genética o la falta de controladores CRE específicos, entre otras cuestiones. Uno de los enfoques que surgieron para tratar de abordar esos problemas y que hoy en día se utiliza ampliamente para estudiar el desarrollo cortical es en la electroporación del útero3,,4. En electroporación del útero es una técnica utilizada para la transgénesis somática, permitiendo la focalización in vivo de las células madre neurales y su progenie. Este método se puede utilizar para etiquetar las célulasmediantela expresión de proteínas fluorescentes 5,6, para la manipulación de genes in vivo (es decir, ensayos de ganancia o pérdida de función)7,8,9, para aislar cortices electroporados in vitro y células de cultivo8,10. Además, en la electroporación del útero permite el control temporal y regional de la zona objetivo. Esta técnica tiene numerosas aplicaciones y ha sido ampliamente utilizada para estudiar la migración neuronal, división de células madre, conectividad neuronal, y otros sujetos8,9,11,12.

El manuscrito actual describe el uso de una variante de electroporación in utero, llamado double in utero electroporation, para analizar las interacciones de las células en la corteza cerebral con diferentes orígenes temporales y espaciales. Estos estudios son extremadamente complejos de completar al emplear modelos murinos porque requieren el uso combinado de varias líneas transgénicas. Algunas de las aplicaciones del protocolo descrito en este documento incluyen el estudio de interacciones cercanas entre las células vecinas, así como las interacciones entre células distantes a través de proyecciones de largo alcance. El método requiere realizar dos cirugías independientes en electroporación del útero, separadas temporal y espacialmente, en los mismos embriones para dirigirse a diferentes poblaciones celulares de interés. La ventaja de este enfoque es la posibilidad de manipular la función génica en uno o ambos tipos de neuronas que utilizan animales de tipo salvaje. Además, estos experimentos funcionales se pueden combinar con la expresión de proteínas fluorescentes citoplasmáticas o etiquetadas por membrana para visualizar la morfología fina de las células objetivo, incluidas las dendritas y los axones, y analizar posibles diferencias en las interacciones celulares en comparación con un control (es decir, células etiquetadas únicamente con la proteína fluorescente).

El protocolo delineado aquí se centra en el estudio de las interacciones celulares dentro del neocortex, pero esta estrategia también podría utilizarse para examinar las interacciones con áreas extracorticales que se pueden apuntar utilizando la electroporación del útero, como el subpallium o el thalamus13,,14,o interacciones célula-célula en otras estructuras, como el cerlumín15. La focalización de diferentes áreas se basa en la orientación de los electrodos y en el ventrículo donde se inyecta el ADN (lateral, tercero o cuarto). Con la estrategia descrita aquí, podemos etiquetar un número sustancial de celdas, lo que es útil para evaluar los cambios generales en la conectividad/inervación en experimentos funcionales. Sin embargo, para estudiar los cambios finos en la conectividad, se pueden utilizar versiones modificadas de la electroporación en el útero para obtener el etiquetado más escaso e identificar celdas individuales16. En resumen, la electroporación doble en el útero es un método versátil que permite apuntar temporal y espacialmente a las poblaciones celulares separadas temporal y espacialmente y estudiar sus interacciones en detalle, ya sea en condiciones de control o combinadas con experimentos funcionales, reduciendo considerablemente los costos temporales y económicos.

Protocolo

El procedimiento aquí descrito ha sido aprobado por el comité ético encargado de la experimentación, el bienestar animal de la Universidad de Valencia y la Conselleria de Agricultura, Desarrollo Rural, Emergencia y Transición Ecológica de la Comunidad Valenciana, y se adhiere a las directrices del Consejo Internacional de Ciencias Animales de Laboratorio (ICLAS) revisado en el Real Decreto 53/2013 de la legislación española, así como en la Directiva 2010/63/UE del Parlamento Europeo y del Consejo.

NOTA: Este protocolo implica dos propósitos diferentes: 1) el primer estudio, conocido como "estrategia A", permite el análisis de las interacciones entre las células de Cajal-Retzius (células CR) y las neuronas de proyección cortical nacidas tempranas dentro del mismo hemisferio cerebral; 2) el segundo estudio, "estrategia B", se lleva a cabo con el fin de examinar la inervación de las neuronas de proyección callosal de capa superior al lado contralateral del neocórtex.

1. Preparación de precirugía

  1. Preparación del ADN
    1. Transformar químicamente o electrocompetentes células E. coli DH5 con los plásmidos de interés, placarlas en placas de agar LB con el antibiótico adecuado, e incubarlas durante la noche a 37 oC.
      NOTA: Todos los plásmidos utilizados aquí contienen el promotor general para el pollo -actina (CAG) que impulsa la expresión de una proteína fluorescente-reportera (CAG-mCherry y CAG-EGFP para la estrategia A y CAG-BFP y CAG-nFPFP-2A-mtdTomato para la estrategia B). Todos ellos contienen resistencia a la ampicilina (AMP).
    2. Escoge colonias individuales de cada transformación de plásmido e inicia un cultivo líquido de arranque en 2 ml de caldo de Luria + ampicilina (LB+AMP) en tubos de cultivo bacteriano durante 3 x 4 h a 37 oC con temblor vigoroso (200 rpm). Después, establecer un cultivo bacteriano más grande en un matraz Erlenmeyer de 500 ml añadiendo 200 ml de LB+AMP y 1 ml del cultivo de arranque. Incubar durante la noche a 37oC en el agitador orbital a 200 rpm.
    3. Utilice un kit de maxi-prep libre de endotoxinas (Tabla de Materiales) siguiendo las instrucciones del fabricante para obtener ADN plásmido puro y concentrado de los cultivos líquidos. Resuspender el ADN en 50-100 l de tampón Tris-EDTA (TE) libre de endotoxinas para obtener concentraciones de al menos 5 g/L.
    4. Para cada cirugía, preparar una solución con un volumen final de 10 l que contenga 1 l de tinte verde rápido, solución de ADN plásmido de interés para una concentración final de 1 g/L para cada plásmido, y tampón TE libre de endotoxinas. Por ejemplo, mezcle 1 l de tinte verde rápido, 2 ml de una solución de ADN plásmido de 5 g/L y 7 ml de tampón temís.
  2. Tirar de pipetas
    1. Tire de los capilares de vidrio borosilicato (1/0,58 mm de diámetro exterior/interior) en un tirador de micropipeta vertical hasta que la punta alcance una longitud de 1 x 1,5 cm y úsela con fórceps diseccionadoras en un ángulo de aproximadamente 30o bajo un alcance disección.
  3. Configuración de la sala de cirugía
    1. Coloque todo el equipo en la mesa de operaciones (es decir, pinzas, tijeras, fórceps, micropipetas, agujas y soporte para agujas). Encienda la almohadilla de calentamiento y cúbrala con una almohadilla absorbente quirúrgica estéril. Asegúrese de que el depósito de la máquina para la anestesia por inhalación esté lleno de isoflurano, que el tanque de oxígeno contenga suficiente oxígeno y que el sistema funcione correctamente.
      NOTA: La sala de cirugía y el material resistente deben mantenerse lo más estériles posible (es decir, todo el material debe ser autoclavizado antes de la cirugía y las superficies deben desinfectarse con 70% de etanol). Los electrodos de platino deben desinfectarse cuidadosamente primero con jabón germicida y segundo con un 70% de etanol antes de la cirugía.
    2. Preparar 100 ml de solución salina estéril al 0,9% (p/v) que contenga penicilina-estreptomicina 1:100 y llenar un plato de Petri de 10 cm. Coloque la placa encima de la almohadilla calentada para calentar la solución.
    3. Llene una jeringa de 1 ml con 150 ml de una solución analgésica (p. ej., 0,1 mg/kg de buprenorfina).
    4. Cargue la pipeta tirada con 5 ml de la solución final de ADN plásmido preparada en el paso 1.1.4. Conecte el capilar a un tubo aspirador controlado por la boca.

2. Primero en cirugía de electroporación del útero

  1. Coloque un ratón embarazada E11.5 (estrategia A) o E13.5 (estrategia B) C57BL/6 dentro de una cámara de inducción cerrada con isoflurano del 2,5% (v/v) a 0,8 L/min y espere hasta que se anestesice. Transfiera el ratón a la almohadilla de calentamiento y coloque su nariz en una máscara para la entrega constante de isoflurano. Compruebe la ausencia de un reflejo de pedal como indicador de la anestesia adecuada.
    NOTA: Laedad mbónica se determina en función del día en que se observa el tapón vaginal (E0.5).
  2. Inyectar a la hembra embarazada con la solución analgésica (0,1 mg/kg de buprenorfina) por vía subcutánea. Para evitar que los ojos se sequen durante el procedimiento, aplique una gota de pomada en cada ojo con un hisopo de algodón.
  3. Afeitar la zona abdominal del ratón con una maquinilla de afeitar eléctrica y lavar 2x con toallitas de etanol 70% (v/v), una vez con toallitas de yodo, y una última vez con una toallita de etanol.
  4. Use tijeras para hacer una incisión de 30 mm de largo a través de la piel en el lado derecho del animal y separar cuidadosamente la piel adyacente del músculo con una espátula contundente. Después, haga una segunda incisión en la pared abdominal.
  5. Cubra el abdomen con un pedazo de papel de tejido plegado previamente desinfectado con un 70% de etanol que contenga una hendidura de 40 mm de largo en su centro. Saque con cuidado el útero de la cavidad abdominal con fórceps de anillo.
    NOTA: El útero debe mantenerse húmedo con la solución salina caliente preparada en el paso 1.3.2 durante todo el procedimiento.
  6. Precargar las pipetas extraídas con la solución de ADN preparada en el paso 1.1.4. Inyectar 0,5 l de la solución de ADN por embrión en el ventrículo lateral del hemisferio seleccionado utilizando el tubo aspirador controlado por la boca hasta que el tinte verde rápido se note dentro del ventrículo.
  7. Coloque los electrodos de platino tipo fórceps lateralmente alrededor de la cabeza del embrión inyectado (como se muestra en la Figura 1A y la Figura 2A). Orientar los electrodos para apuntar a la región cerebral deseada. Dirija el polo positivo hacia la pared medial para electroporar el dobladillo cortical (estrategia A) o hacia la corteza lateral (estrategia B) para etiquetar las células generadas en esa área.
    NOTA: En todos los casos, el corazón y la placenta deben evitarse para garantizar la supervivencia embrionaria.
  8. Aplicar la secuencia específica de pulsos eléctricos con un electroporador de onda cuadrada siguiendo las indicaciones que se muestran en la Tabla 1 (estrategia A E11.5 embriones: cuatro pulsos de 25 V y 40 ms, separados por intervalos de 950 ms; embriones de estrategia B E13.5: cinco pulsos de 35 V y 60 ms, con intervalos de 950 ms).
  9. Coloque cuidadosamente el útero de nuevo en la cavidad abdominal con fórceps, llénelo con solución salina caliente y cierre la pared abdominal con una sutura de aguja 6-0. Unir los dos lados de la incisión inicial realizada en la piel, ya sea usando una aguja 6-0 de sutura o clips de sutura.
  10. Mantener el animal en la almohadilla de calentamiento y controlarlo hasta su recuperación de la anestesia. Proporcione una dosis extra de analgesia (150 l)   en una solución de hidrogel colocada en su jaula doméstica.
  11. 24 horas después de la cirugía, administrar una dosis extra de analgesia (150 l). Continúe la monitorización diaria mediante inspección visual para posibles dolores y angustia. Observar el comportamiento del animal, probar sus reflejos normales de las extremidades traseras e inspeccionar la sutura en busca de posibles signos de daño debido a lamer o rascarse de la herida.

3. Segundo en electroporación del útero

  1. Dos días después de la cirugía inicial, repita los pasos 2.1 a 2.3. Aunque la recuperación de las hembras embarazadas después de la cirugía es muy buena, compruebe que muestran un comportamiento normal y no presentan signos de dolor o angustia antes de realizar la segunda cirugía (E13.5 embriones para la estrategia A y E15.5 para la estrategia B).
  2. Haga una incisión de 30 mm de largo a través de la piel como en el paso 2.4 y una segunda incisión en la pared abdominal, esta vez en el lado izquierdo del animal. Exponga cuidadosamente el útero encima de un tejido desinfectado como se describe en el paso 2.5.
    NOTA: Tenga cuidado de no interferir con la incisión realizada anteriormente en el otro lado.
  3. Inyectar alrededor de 0,5 l por embrión de la solución de ADN en el ventrículo cerebral lateral del hemisferio previamente electroporado en el caso de la estrategia A y en el ventrículo cerebral lateral del hemisferio contralateral para la estrategia B.
    NOTA: Utilice únicamente embriones que muestren un desarrollo normal y que no se aparecen signos de reabsorción.
  4. Coloque los electrodos alrededor de la cabeza del embrión como se describe en el paso 2.7, dirigir el electrodo positivo hacia la corteza lateral y aplicar los pulsos apropiados siguiendo las indicaciones indicadas en la Tabla 1 (estrategia A E13.5 embriones: cinco pulsos de 35 V y 60 ms separados por intervalos de 950 ms; embriones de estrategia B E15.5: cinco pulsos de 50 V y 80 ms separados por intervalos de 950 ms).
  5. Continúe y termine la cirugía como se describe en los pasos 2.8 a 2.10.

4. Recolección y seccionamiento de tejidos

  1. Estrategia A
    1. Cuatro días después de la segunda electroporación (E17.5), realizar la luxación cervical de la hembra embarazada y colocarlo en una posición supina.
    2. Usando tijeras, haga una incisión ventral para extraer los cuernos uterinos y con fórceps colóquelos en un plato de Petri lleno de 1x solución salina tamponada por fosfato (PBS) colocada sobre hielo.
      NOTA: La baja temperatura hace posible la anestesia de los embriones.
    3. Usando pinzas, extrae los embriones del saco amniótico y transfiéralos con fórceps a un nuevo plato de Petri lleno de PBS bajo un alcance diseccionado. Sostenga cuidadosamente la cabeza de los embriones usando fórceps y lleve a cabo la disección cerebral con pinzas para primero extraer la piel sobre la cabeza y luego el cráneo. Usa una espátula para extraer los cerebros expuestos.
    4. Recoger los cerebros con una cuchara y depositarlos en un plato de 48 pozos lleno con la solución fijadora (4% [p/v] paraformaldehído [PFA] en 1x PBS). Pruebe inmediatamente el resultado exitoso de ambas electroporaciones examinando los cerebros utilizando un microscopio de epifluorescencia invertido, por ejemplo.
    5. Fijar los cerebros embrionarios durante la noche a 4 oC en un agitador orbital. Lavar con 1x PBS para eliminar trazas de PFA. Luego transfiéralos a PBS con conservantes antifúngicos (1x PBS-0.05% (p/v) de azida sódica).
      ADVERTENCIA: PFA y azida sódica son compuestos citotóxicos que requieren precaución especial durante su utilización.
    6. Incruste los cerebros fijados en un punto de fusión bajo del 4% (p/v) en 1 veces PBS y espere 10 min hasta que se solidifique. Pegarlos al soporte de tejido vibratomo usando pegamento de cianoacrilato con las bombillas olfativas mirando hacia arriba para obtener secciones coronales.
    7. Inicie el vibratomo y seleccione los parámetros deseados: 100 m de ancho, 0,60 m/s de velocidad y 0,60 mm de amplitud.
    8. Asegure el cerebro dentro del recipiente del vibratoma, llénelo con 1 solución PBS y comience a recolectar secciones seriales coronales con la ayuda de un cepillo en una placa de 48 pozos llena de 1x PBS-0.05% (p/v) azida sódica para tener una representación completa del cerebro (por ejemplo, alrededor de siete secciones por pozo y seis pozos por embrión).
    9. Monte las secciones deseadas en diapositivas de vidrio del microscopio con un cepillo fino. Cúbralos con cubreobjetos de vidrio. Para el almacenamiento a largo plazo añadir medio de montaje, que evita el fotoblanse y fotooxidación. Observe las diapositivas bajo un microscopio de epifluorescencia vertical para evaluar la eficacia de la electroporación.
  2. Estrategia B
    1. Deje que los cachorros previamente electrocalados en E13.5 y E15.5 nazcan y esperen hasta que P15 realice la perfusión transcardial utilizando la misma solución fijadora utilizada en el paso 4.1.4.
    2. Justo antes de la perfusión, administrar por vía intraperitoneal una dosis de 75/1 mg/kg de ketamina/medetomidina. Cuando se pierda el reflejo del pedal, fije el ratón en una posición supina y haga una incisión ventral después de la línea media usando tijeras para exponer tanto la caja torácica como el diafragma.
    3. Corta el diafragma y abre la caja torácica para acceder al corazón. Sostenga la caja torácica usando un hemostat y haga una incisión en la aurícula derecha con tijeras finas.
    4. Penetre el ventrículo izquierdo con una aguja conectada con un tubo flexible a una bomba de perfusión peristáltica. Iniciar la perfusión transcardial, suministrando al menos 25 ml de 4% de PFA a un flujo constante de 5,5 ml/min (tiempo total de 5 min).
    5. Disecciona el cerebro de los animales perfundidos. Primero, retire la piel sobre la cabeza con tijeras y fórceps. Comience a cortar el cráneo con tijeras y retire cuidadosamente las secciones de los huesos del cráneo hasta que se retiren por completo. Finalmente, extrae el cerebro con la ayuda de una espátula.
    6. Transfiera los cerebros a una placa de 24 pozos y fijelos con un 4% de PFA durante la noche a 4 oC en un agitador orbital. Detenga la fijación reemplazando la PFA por un azida sódica del 0,05% (p/v) en PBS.
      NOTA: Como se indica en el paso 4.1.5, es aconsejable realizar un lavado intermedio con 1x PBS.
    7. Repita los pasos 4.1.6 a 4.1.9, cambiando los parámetros del vibratomo para los cerebros postnatales (40 m de ancho, 1,20 m/s de velocidad y 0,5 mm de amplitud).
      NOTA: La inmunohistoquímica o la inmunofluorescencia se pueden llevar a cabo para detectar marcadores celulares específicos o mejorar la señal de proteínas fluorescentes utilizadas en la electroporación.

5. Imágenes y análisis de fluorescencia confocal

  1. Encienda el microscopio confocal, coloque las diapositivas del microscopio que contienen las secciones cerebrales montadas en el soporte de las diapositivas del microscopio y seleccione los canales a los que se tomarán las imágenes de fluorescencia (es decir, 420-460 nm para BFP, 490-540 nm para GFP y 570-620 nm para mCherry y tTomato).
  2. Realice el escaneo de muestras para obtener imágenes de mapa de cada sección cerebral en dos longitudes de onda diferentes para obtener una vista general de la salida de electroporación doble. Una vez terminado, seleccione la lente 10x y el modo de observación multi-area-Z-stack-timelapse. Esto permitirá programar la adquisición automática de imágenes de fluorescencia en diferentes localizaciones XYZ dentro de las secciones cerebrales.
  3. En cada una de las regiones elegidas (XY), establezca los parámetros de imagen adecuados (es decir, intensidad del láser, sensibilidad fotomultiplicalier y una resolución mínima de 1.024 x 1.024), así como la profundidad del escaneo (Z) según los planos de la muestra donde la fluorescencia es visible.
  4. Obtenga imágenes de bajo aumento (10x) de todas las regiones elegidas y expórtelas de OIF al formato TIFF utilizando el software del visor del microscopio.
  5. Cambie a la lente 60x, repita el paso 5.3 y capture imágenes de alto aumento para observar las interacciones celda-célula de una manera más detallada. Expórtelos como se indica en el paso 5.4.
  6. Abra las imágenes adquiridas con cualquier software de imágenes (por ejemplo, Fiji) para su posterior análisis.

Resultados

Las interacciones entre las células vecinas se originaron en lugares distales y en diferentes momentos: células De cajal-retzius (células CR) y neuronas de proyección cortical migratorias tempranas (estrategia A)

La interacción de las células CR y las neuronas de proyección cortical temprana se describió previamente como necesaria para regular la translocación somal a través de moléculas de adhesión a nectina y cadherina utilizando una estrategia de doble electroporación8. Las células CR se originan a partir del neuroepithelium en los bordes del palio y migran tangencialmente para poblar la parte más superficial de la corteza, la zona marginal17,18,19, mientras que las neuronas de proyección cortical se generan en la zona proliferativa de la corteza cerebral y migrar radialmente a la placa cortical naciente20. Hay una diferencia temporal en la generación de ambos tipos de células. Las células CR se generan en etapas embrionarias muy tempranas a partir de E10.521,22 y las neuronas de proyección cortical que migran por translocación somal nacen de E12.5–E13.523. Utilizando doble electroporación del útero, la brecha temporal entre las cirugías permite a las células CR, dirigidas a E11.5 en uno de sus lugares de origen (el dobladillo cortical), llegar a la zona marginal del neocórtex lateral incluyendo el área somatosensorial en el tiempo para establecer contactos con neuronas de proyección cortical etiquetadas en E13.5 (Figura 1A,B). Los principales procesos de neuronas de proyección que expresan GFP mejorada (EGFP) arbóreas profusamente en la zona marginal de la corteza y se entremezclan con los procesos de las células CR que expresan mCherry (Figura 1C). Los experimentos funcionales han demostrado que la perturbación de las moléculas de adhesión de células celulares expresadas por neuronas de proyección o células CR afecta a la arborización de sus procesos como consecuencia de contactos alterados entre ambos tipos de células8.

Interacciones de largo alcance entre células distales generadas en diferentes momentos: inervación de neuronas de proyección callosal de capa superior al lado contralateral del neocórtex (estrategia B)

Las neuronas de proyección cortical callosal están presentes en toda la corteza cerebral, siendo más abundantes en las capas superiores24. Estas neuronas proyectan sus axones a través del cuerpo calloso y contactan sus células diana, neuronas de proyección ubicadas a través de las diferentes capas de la corteza contralateral 25,,26,,27. Las neuronas de proyección de capa superior son evolutivamente más nuevas que las neuronas de capa inferior y se han expandido en gran medida en los primates28. Estas células son fundamentales para el pensamiento complejo y tareas asociativas más altas, y las disfunciones en grupos de genes expresados específicamente por esta población de células se han relacionado recientemente con el autismo29.

Con el fin de estudiar específicamente las interacciones de la subpoblación de neuronas de proyección callosal ubicadas en las capas superiores con sus células diana distribuidas por todo el hemisferio contralateral, desarrollamos un doble en el protocolo de electroporación del útero. Para etiquetar las células diana de las neuronas de proyección callosal de capa superior que realizamos en electroporación del útero en E13.5 utilizando un plásmido expreso de BFP (Figura 2AaC). Esta edad fue elegida estratégicamente porque permite no sólo la focalización de una amplia población de neuronas de proyección cortical incluyendo muchas neuronas de capa-V, sino también un número considerable de neuronas ubicadas en capas superiores(Figura 2C),básicamente cubriendo todas las áreas objetivo de las neuronas de proyección callosal del hemisferio contralateral. Una segunda electroporación en el lado contralateral en E15.5 se dirigió a la subpoblación de neuronas de proyección callosal de capa superior (expresando nEGFP y mtdTomato) (Figura 2A,B,D) pero no las neuronas de proyección de capa inferior nacidas a edades más tempranas. Por lo tanto, la necesidad de doble electroporación heterocrónica se justificó debido a los diferentes tiempos en la generación de las células proyectadas de interés y las células inervadas por ellas. Esas neuronas de la capa superior envían sus axones al hemisferio contralateral con un patrón de arborización característico (Figura 2C). Las diferencias en este patrón de arborización axonal típica podrían evaluarse al obtener o perder experimentos de función en células diana utilizando este protocolo de electroporación doble. El análisis de alto aumento muestra en detalle los axones callosales que se enervan las neuronas de proyección dirigida en el hemisferio contralateral (Figura 2E).

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Figura 1: Estrategia A. Doble en la estrategia de electroporación del útero para estudiar interacciones cercanas entre células con diferente origen espacial y temporal. (A) Esquemas del protocolo utilizado para atacar células CR que expresan mCherry y neuronas de proyección cortical que expresan EGFP. (B) Imagen representativa de una sección coronal de un cerebro después de una doble electroporación en el dobladillo cortical y la corteza lateral. Las células objetivo del dobladillo cortical (rojo) migran tangencialmente, poblando la zona marginal del neocórtex. Las células etiquetadas en la zona ventricular de la corteza generan neuronas de proyección cortical (verdes) que migran radialmente para entrar en la placa cortical naciente. Barra de escala a 200 m. (C) Ampliación del área encaminada en el panel B que muestra la corteza lateral y los dos tipos de celdas etiquetadas después del protocolo de electroporación doble. Las líneas discontinuas enmarcan la zona marginal y la placa cortical. Barra de escala a 100 m. El aumento de alto aumento a la derecha muestra un detalle de la zona marginal que contiene los procesos principales arborizados de las neuronas de proyección mezcladas con cuerpos y procesos de células CR. Barra de escala a 10 m. Ctx - corteza; Dobladillo - dobladillo cortical; MZ - zona marginal; CP - placa cortical; IZ - zona intermedia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Estrategia B. Estrategia de electroporación doble para estudiar interacciones de largo alcance entre células con diferente origen espacial y temporal. (A) Esquema que muestra la estrategia para dirigirse a diferentes poblaciones de neuronas de proyección cortical en el neocórtex lateral, incluyendo el área somatosensorial en diferentes hemisferios por doble en electroporación utero. Neuronas de proyección en la corteza somatosensorial del hemisferio derecho dirigidas a E13.5 expresada BFP. Las neuronas de proyección dirigidas en el lado contralateral dirigidos a E15.5 expresaron EGFP nuclear (nEGFP) y tdTomato dirigido a membrana (mtdTomato). (B) Imagen representativa de una sección coronal de un cerebro que se sometió a una doble cirugía de electroporación con los plásmidos mencionados en el panel A. Observe las diferentes distribuciones de las células etiquetadas por BFP o nEGFP y el etiquetado intenso de los axones de las neuronas de proyección callosal de capa superior (mtdTomato) etiquetadas en E15.5. Barra de escala a 500 m. (C) Imagen de la corteza somatosensorial situada en el hemisferio derecho en un cerebro electroporado doble. Observe la amplia distribución de las neuronas de proyección (azul) a través de las capas y la arboralización profusa de los axones callosales (rojo) provenientes de neuronas de proyección dirigidas en el hemisferio contralateral. Barra de escala a 100 m. (D) Imagen de la corteza somatosensorial en el hemisferio izquierdo de un cerebro electroporado doble. Observe la localización discreta de las neuronas de proyección dirigidas en la parte superior de la placa cortical como se muestra en la expresión de nEGFP (verde), así como el etiquetado rojo profuso que rodea los cuerpos celulares y todas las proyecciones neuronales (rojo). Barra de escala a 100 m. (E) Imágenes de gran aumento de la corteza somatosensorial en el hemisferio derecho que muestran detalles de la arborización de los axones callosales alrededor de las neuronas de proyección dirigidas. Barra de escala a 10 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

EstrategiaOrden de electroporaciónCélulas de destinoRegión objetivoVentrículo inyectadoUbicación de los electrodosVoltaje y pulsosPlásmidos utilizadosEdad del análisis
UnPrimeroCélula CR en E11.5Cortical HemIzquierdaPositivo en el hemisferio izquierdo (dirigido hacia la pared medial)25 V, 40 ms, 4pCAG-mCherryE17.5
SegundoNeuronas de proyección cortical en E13.5Cortex somatosensorialIzquierdaPositivo en el hemisferio izquierdo35 V, 60 ms, 5pCAG-EGFP
(dirigido hacia la corteza)
BPrimeroNeuronas de proyección cortical en E13.5Cortex somatosensorialCorrectoPositivo en el hemisferio derecho35 V, 60 ms, 5pCAG-BFPP15
(dirigido hacia la corteza)
SegundoNeuronas de proyección cortical en E15.5Cortex somatosensorialIzquierdaPositivo en el hemisferio izquierdo50 V, 80 ms, 5pCAG-nEGFP-2A-mTdTomato
(dirigido hacia la corteza)

Tabla 1: Resumen de las condiciones de electroporación utilizadas en los diferentes experimentos.

Supervivencia de embriones tras el doble en electroporación del útero en la Estrategia A
Número de camadasNúmero inicial de embrionesNúmero de embriones que sobreviven al primer EPNúmero de embriones que sobreviven al segundo EP% de supervivencia después del primer EP% de supervivencia después del segundo EP*% de la tasa de supervivencia mundial
9Número total(Promedio de la camada SD)Número total(Promedio de la camada SD)Número total(Promedio de la camada SD)75%83.33%62.50%
647,11 a 2,08485,33 x 1,22404,44 x 1,01
Número de embriones abortados después del primer EPNúmero de embriones abortados después del segundo EPNúmero total de embriones abortados% del aborto después del primer EP% del aborto después del segundo EP*% de la tasa mundial de abortos
Número total(Promedio de la camada SD)Número total(Promedio de la camada SD)Número total(Promedio de la camada SD)25%16.66%37.50%
161,8 x 1,0980,88 a 0,78242,67 x 1,32
*Supervivencia y aborto calculados teniendo en cuenta los embriones que sobrevivieron a la primera electroporación

Tabla 2: Supervivencia de embriones tras el doble en electroporación del útero en la Estrategia A.

Supervivencia de embriones y cachorros siguiendo la Estrategia B (doble EP E13.5 y E15.5)
Número de camadasNúmero inicial de embrionesNúmero de embriones que sobreviven al primer EPNúmero de cachorros nacidos después del doble EPNúmero de embriones que sobreviven en P15% de supervivencia después del primer EP% de supervivencia después del segundo EP% de supervivencia en P15
8Número total(Promedio de la camada SD)Número total(Promedio de la camada SD)Número total(Promedio de la camada SD)Número total(Promedio de la camada SD)88.46%82.69%55.77%
526,5 x 2465,75 x 2,05435,38 x 1,77293,63 x 1,6
Supervivencia de embriones y cachorros después de un EP único en E13.5
Número de camadasNúmero inicial de embrionesNúmero de cachorros nacidos después del EPNúmero de embriones que sobreviven en P15% de supervivencia después de EP% de supervivencia en P15
11Número total(Promedio de la camada SD)Número total(Promedio de la camada SD)Número total(Promedio de la camada SD)89.74%57.69%
787,1 x 1,64706,36 x 1,7454,09 x 2,07

Tabla 3: Supervivencia de los cachorros después del doble en electroporación del útero en la Estrategia B en comparación con la electroporación simple.

Discusión

El estudio de las interacciones célula-célula in vivo en regiones con alta densidad celular como la corteza cerebral es una tarea compleja. Los enfoques tradicionales, incluido el uso de anticuerpos para etiquetar las neuritas, no son adecuados debido a la falta de marcadores específicos para diferentes poblaciones celulares. El uso de modelos murino transgénicos, donde un tipo de célula particular expresa una proteína fluorescente, es útil para visualizar los procesos neuronales, pero esto depende de la disponibilidad de tales modelos. Esta tarea es aún más complicada cuando se trata de visualizar posibles diferencias en las interacciones entre dos tipos de células particulares tras la perturbación de los genes de interés, ya que implica el uso de otros modelos animales, como los ratones nocaut. Todas estas cuestiones complicaron estos estudios en el pasado debido a los costos económicos y temporales.

La aparición de nuevas técnicas que permitan la transgénesis somática in vivo, como la electroporación del útero, ofrece la posibilidad de diseñar estrategias como la descrita en este protocolo, que eluden el uso o generación de animales reporteros y noqueos combinados, haciendo este tipo de experimento más factible. Los resultados mostrados en esta publicación y los estudios publicados anteriormente8 demuestran que este protocolo 1) permite con éxito la focalización de poblaciones celulares con diferente origen temporal y espacial; 2) hace posible la visualización de contactos de células celulares con alta resolución; y 3) es útil para detectar diferencias en los contactos celulares después de experimentos funcionales.

A pesar del amplio uso de la electroporación del útero, esta técnica requiere un entrenamiento considerable para realizar de forma segura la cirugía, manipular los embriones sin dañarlos y asegurar la correcta focalización de la región deseada. Sin embargo, después de este entrenamiento, la supervivencia de las hembras embarazadas es excelente (alrededor del 100% en nuestras manos) y no hemos encontrado diferencias entre la electroporación simple y doble en el útero. Las hembras embarazadas electroporadas simples y dobles se recuperan muy rápidamente de la cirugía. En la gran mayoría de los casos, su comportamiento al día siguiente de una cirugía simple o doble parece normal y estas hembras embarazadas comen, beben, caminan e incluso trepan sin dificultades sin signos aparentes de dolor y angustia.

La supervivencia de los embriones después de la primera y la segunda electroporación también es buena en general, y la tasa de aborto disminuye a medida que aumenta la edad de los embriones(Tabla 2 y Tabla 3). La principal dificultad es la focalización exitosa en ambas electroporaciones. Con embriones más viejos a partir de E13.5, el grado de éxito es muy alto. Las edades tempranas como E11.5 son más difíciles porque el pequeño tamaño de los embriones hace que el manejo y la inyección sean más difíciles, lo que además afecta su supervivencia. Sin embargo, los embriones que sobreviven a la primera electroporación E11.5 presentan muy buenas tasas de supervivencia después de la segunda electroporación en E13.5(Tabla 2). Para mejorar el dominio con esta técnica, recomendamos encarecidamente practicar cirugías en cachorros a la E14.5 y probar progresivamente las cirugías a edades más tempranas.

Otro desafío es la supervivencia posnatal, porque las madres sometidas a cirugía no siempre cuidan de todos sus cachorros, aunque las hembras embarazadas solas o doble electroporated entregan a los cachorros sin problemas (Tabla 3) y su comportamiento y estado físico parecen normales. En nuestras manos, y con el momento descrito aquí, no encontramos diferencias importantes en la supervivencia posnatal después de una electroporación simple y doble(Tabla 3),pero para eludir los posibles problemas de supervivencia los cachorros pueden ser transferidos a las madres adoptivas al momento del parto cuando las madres reales muestran un comportamiento materno deficiente al nacer. Proporcionar material de anidación adicional y alimentos ricos a las hembras embarazadas antes de la fecha de parto también puede ayudar a aumentar las tasas de supervivencia de los cachorros.

Una de las principales ventajas de esta estrategia es el uso de ratones de tipo salvaje para estudios funcionales, pero también se puede aplicar, por ejemplo, a ratones reportero de CRE o ratones con hilo de té para genes de interés, cuando estén disponibles. En estos ratones, la electroporación de plásmidos que expresan CRE-recombinase permitirá la expresión permanente del gen reportero o la inactivación del gen deseado, respectivamente, en las células objetivo. Para experimentos funcionales también podemos controlar la expresión de la construcción solo en el tipo de celda de interés. Por ejemplo, un promotor neuronal se puede utilizar para manipular un gen candidato sólo en las neuronas y no en las células madre neurales, por lo tanto, la prevención de efectos no deseados a nivel de progenitor. Todas estas consideraciones, junto con el control del tiempo y la región objetivo, hacen del doble en electroporación del útero una técnica muy versátil para estudiar las interacciones célula-célula no sólo dentro de la corteza, sino también en otras estructuras que pueden ser dirigidas usando esta tecnología.

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Los autores agradecen a Cristina Andrés Carbonell y a los miembros de las instalaciones de Cuidado animal de la Universidad de Valencia por su asistencia técnica. También queremos agradecer a Isabel Fariñas y Sacramento R. Ferrón por los reactivos y compartir sus equipos con nosotros. I.M.W está financiado por un contrato de Garantía Juvenil de la Conselleria de Educación de Valencia (GJIDI/2018/A/221), D.dA.D está financiado por el Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (MICINN) (FPI-PRE2018-086150). C.Gil-Sanz posee una Beca Ramón y Cajal (RYC-2015-19058) del Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (MICINN). Esta obra fue financiada RYC-2015-19058 y SAF2017-82880-R (MICINN).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Ampicilina sal sódicaSigma-AldrichA9518-25G
Tubo aspiradorSigma-AldrichA5177-5EA
Hemostático mezclador para bebés (perfusión)Fine Science Tools (FST)13013-14
Capilar de vidrio de borosilicatoWPI1B100-6
Buprenorfina (BUPREX 0,3 mg/ml)Rb Pharmaceuticals Limited
plásmido CAG-BFPAmablemente proporcionado por U.Mü plásmido ller Lab
CAG-EGFPAmablemente proporcionado por U.Mü ller Lab
CAG-mPlásmido de cerezaAmablemente proporcionado por U.Mü llü Lab
CAG-mtdTomato-2A-nGFP plásmidoAmablemente proporcionado por U.Mü ller Lab
Microscopio confocalOlympusFV10i
Hisopos de algodónBFHCVDF
Pegamento de cianoacrilatoB. Braun Surgical 1050044
Visor de disecciónZeissstemi 305
Dumont Pinzas #5 Pinzas finasFine Science Tools (FST)11254-20
ECM830 Square Electroporador de ondasBTX45-0052
Maquinilla de afeitar eléctricaOster76998
Tampón TE sin endotoxinasQIAGEN1018499
Toallitas de etanolBFHCVDF
Pinzas de Graefe Extra FinasFine Science Tools (FST)11150-10
Pomada para los ojosAlcon682542.6
Tinte verde rápidoSigma-AldrichF7252-5G
Tijeras finasFine Science Tools (FST)14069-09
LEDs de fluorescenciaCoolLEDpE-300-W
Genopure Plasmid Maxi Kit3143422001
Halsted-Mosquito Hemostáticos (sutura)Fine Science Tools (FST)91308-12
Almohadilla térmicaUFESAAL5514
Microscopio de epifluorescencia invertidaNikonEclipse TE2000-S
Toallitas de yodoLorsoul
Vaporizador de isofluoranoCaudalímetroA15B5001
IsofluranoKarizoo586259
Ketamina (Anastemine)Fatro Ibé rica SL583889-2
Toallitas de precisión KimtechKimberly-Clark7252
LB (Lennox) Agar GENLabkemAGLB-00P-500
LB (Lennox) caldo GENLabkemLBBR-00P-500
Agarosa de bajo punto de fusiónFisher ScientificBP165-25
Medetomidina (Sedante)Dechra573749.2
cubreobjetos para microscopioMenel-Glä ser15747592
portaobjetos de microscopioLabboxSLIB-F10-050
Medio de montajeMicroscopía electrónica Ciencias 17984-25
Placas Mutiwell (24)SPL Life Sciences32024
Placas Mutiwell (48)SPL Life Sciences32048
NaCl (para solución salina)Fisher Scientific10112640
Aguja 25 g (BD Microlance 3)Becton, Dickinson and Company300600
Incubadora orbital S150Stuart Scientific5133
P Selecta IncubadoraJ. P. Selecta, s.a.
ParaformaldehídoPanReac AppliedChemA3813
Penicilina-EstreptomicinaSigma -AldrichP4333
Bomba de perfusión peristálticaCole-ParmerEW-07522-30
Pinza de platino, 5 mm de diámetroBtx45-0489
Sistema de cierre de piel Reflex - Clips de 7 mm, caja de 100AgnThos203-1000
Sistema de cierre cutáneo Reflex - Aplicador de clip, 7 mmAgnThos204-1000
Pinzas de anilloFine Science Tools (FST)11103-09
Azida sódicaPanReac AppliedChem122712-1608
Almohadilla absorbente quirúrgica (estéril)HK Suturaquirúrgica PD-M
(Surgicryl PGA 6-0)Materiales desutura SMI
Jeringa BYD11071512 1ml (BD plastipak)Becton, Dickinson and Company303172
Plato de cultivo de tejidos 100 x 20 mmFalcon353003
Extractor de micropipetas verticalesSutter Instrument CoP-30
Microscopio verticalNikonEclipse Ni
VibratomeLeicaVT1200S
921425 Roche 0485472

Referencias

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