Generación rápida y sin fisuras de poxvirus recombinantes utilizando el rango de host y la selección visual

Summary

Este es un método para generar virus de vacuna recombinante "sin cicatrices" utilizando la selección del rango de host y la identificación visual de virus recombinantes.

Abstract

El virus de la vacuna (VACV) fue fundamental en la erradicación del virus de la variola (VARV), el agente causante de la viruela, de la naturaleza. Desde su primer uso como vacuna, vacv se ha desarrollado como vector para vacunas terapéuticas y como virus oncolítico. Estas aplicaciones aprovechan el genoma fácilmente manipulado de VACV y la amplia gama de hosts como una plataforma excepcional para generar virus recombinantes con una variedad de aplicaciones terapéuticas. Se han desarrollado varios métodos para generar VACV recombinante, incluyendo métodos de selección de marcadores y selección dominante transitoria. Aquí, presentamos un refinamiento de un método de selección de rango de host junto con la identificación visual de virus recombinantes. Nuestro método aprovecha la presión selectiva generada por la proteína quinasa antiviral huésped R (PKR) junto con un gen de fusión fluorescente que expresa mCherry con la etiqueta E3L, uno de los dos antagonistas de PKR VACV. El casete, incluyendo el gen de interés y la fusión mCherry-E3L está flanqueado por secuencias derivadas del genoma VACV. Entre el gen de interés y mCherry-E3L hay una región más pequeña que es idéntica a los primeros 150 nucleótidos del brazo de 3', para promover la recombinación homóloga y la pérdida del gen mCherry-E3L después de la selección. Demostramos que este método permite una generación eficiente y sin problemas de rVACV en una variedad de tipos de células sin necesidad de selección de fármacos o cribado extensivo de virus mutantes.

Introduction

El virus de la vacuna (VACV) fue fundamental para la primera erradicación exitosa de un patógeno humano, el virus de la variola (VARV), de la naturaleza. Desde el exterminio del virus de la variola, los poxvirus, incluido el VVAC, han seguido siendo virus terapéuticos útiles tanto para la medicina humana como para la medicina animal. Por ejemplo, una vacuna contra el virus de la rabia basada en VCVa ha sido muy eficaz para prevenir la transmisión de la rabia silvática en Europa¹ y los Estados Unidos². Más recientemente, los poxvirus recombinantes que expresan una variedad de moléculas antitumorales (por ejemplo, anticuer....

Protocol

1. Generación del vector de recombinación

1. Diseñe imprimadores para generar el casete de selección. Diseñe cada amplificador individual con secuencias superpuestas con amplicons vecinos y el vector para facilitar el ensamblaje enzimático isotérmico de moléculas de ADN, también llamado ensamblaje Gibson, utilizando cualquiera de varias herramientas de diseño de imprimación en línea.
   NOTA: Este protocolo también se puede completar utilizando métodos tradicionales de clonación basados en en endonucleasas de restricción. En ese caso, diseñe imprimaciones con los sitios de restricción apropiados en lugar de con secuencias superpuestas.
2. Utilizando las ....

Results

Usamos el procedimiento diagramado en la Figura 1 para generar un VACV que carece de ambos antagonistas PKR E3L y K3L, reemplazando E3L por EGFP en un virus ya eliminado para K3L (vP872). La Figura 2 muestra placas fluorescentes rojas en células RK13 competentes de PKR indicativas de la expresión viral de mCherry-E3L, así como EGFP expresada en células RK13+E3L+K3L que confirman la pérdida de E3L y el colapso del marcador de selección mCherry-E3L.

Discussion

Aquí presentamos una variación de una estrategia de selección de marcadores transitorios ³² para generar virus de vacuna recombinante sin retener ADN extraño en el virus recombinante final. Nuestra estrategia utiliza presión selectiva mediada por la proteína antiviral huésped PKR en lugar de otras formas de presión selectiva como los antibióticos. El uso de genes antivirales de huésped elimina la posibilidad de cambios fenotípicos inducidos químicamente en las células, o un mayor riesgo de mutació.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2X-Q5 Master Mix	NEB	M0492L	Polimerasa de alta fidelidad utilizada en PCR
Ampicilina	ThermoFisher Scientific	11593027	Agente selectivo bacteriano
Raspadores de células desechables	ThermoFisher Scientific	08-100-242	Raspador de células para recolectar células infectadas
EVOS FL Auto 2 Sistema de imagen celular	ThermoFisher Scientific	AMAFD2000	Microscopio fluorescente
EVOS Light Cube, GFP	ThermoFisher	AMEP4651	GFP Cube
EVOS Light Cube, RFP	ThermoFisher	AMEP4652	RFP Cube
GenJet	SignaGen Laboratories	SL100489	Reactivo de transfección
Luria Bertani (LB) Caldo	Gibco	10855021	Medio de crecimiento bacteriano
Kit	de extracción de gel de ADN MonarcaKit	T1020L	utilizado para purificar amplicones y vectores linealizados
Kit de minipreparación de plásmido	monarca NEB	T1010L	Kit de minipreparación utilizado para purificar plásmidos
Espectrofotómetro NanoDrop One	ThermoFisher Scientific	ND-ONE-W	utilizado para medir la concentración de ARN y ADN
NEBuilder Master Mix	NEB	E2621L	Kit de montaje enzimático isotérmico utilizado para generar el vector de recombinación
Q500 Sonicator	Qsonica	Q500-110	Sonicator para lisados de virus
Células RK13	ATCC	CCL-37	Células de riñón de conejo
Placas de cultivo celular multipocillo VWR	VWR	10062-892	Placas de cultivo celular