Aquí se presenta el protocolo para un ensayo de quimiotaxis in situ, un dispositivo microfluídico desarrollado recientemente que permite estudios de comportamiento microbiano directamente en el medio ambiente.
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Artículo de método
Ensayo de Chemotaxis Situ para Examinar el Comportamiento Microbiano en Ecosistemas Acuáticos
En este artículo
Resumen
Resumen
Los comportamientos microbianos, como la motilidad y la quimiotaxis (la capacidad de una célula para alterar su movimiento en respuesta a un gradiente químico), están muy extendidos en los dominios bacteriano y arqueal. La quimiotaxis puede dar lugar a ventajas sustanciales de adquisición de recursos en entornos heterogéneos. También desempeña un papel crucial en las interacciones simbióticas, enfermedades, y procesos globales, como el ciclo biogeoquímico. Sin embargo, las técnicas actuales restringen la investigación de quimiotaxis al laboratorio y no son fácilmente aplicables en el campo. Aquí se presenta un protocolo paso a paso para el despliegue del ensayo de quimiotaxis in situ (ISCA), un dispositivo que permite un interrogatorio robusto de quimiotaxis microbiana directamente en el entorno natural. El ISCA es un dispositivo microfluídico que consiste en una matriz de 20 pozos, en la que se pueden cargar productos químicos de interés. Una vez desplegados en ambientes acuosos, los productos químicos se difunden fuera de los pozos, creando gradientes de concentración que los microbios detectan y responden nadando en los pozos a través de la quimiotaxis. El contenido del pozo se puede muestrear y utilizar para (1) cuantificar la fuerza de las respuestas quimiotácticas a compuestos específicos a través de la citometría de flujo, (2) aislar y cultivar microorganismos sensibles, y (3) caracterizar la identidad y el potencial genómico de las poblaciones que responden a través de técnicas moleculares. La ISCA es una plataforma flexible que se puede implementar en cualquier sistema con una fase acuosa, incluyendo ambientes marinos, de agua dulce y de suelo.
Introducción
Diversos microorganismos utilizan motilidad y quimiotaxis para explotar ambientes de nutrientes irregulares, encontrar huéspedes, o evitar condiciones perjudiciales1,2,3. Estos comportamientos microbianos pueden a su vez influir en las tasas de transformación química4 y promover asociaciones simbióticas en los ecosistemas terrestres, de agua dulce y marinos2,,5.
La quimiotaxis ha sido ampliamente estudiada en condiciones de laboratorio durante los últimos 60 años
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Protocolo
Se recomienda ejecutar la sección 1 antes de los experimentos de campo para optimizar los resultados.
1. Optimización de laboratorio
NOTA: Los volúmenes descritos en el procedimiento de optimización son suficientes para un único ISCA (compuesto por 20 pozos).
- Preparación del producto químico de interés
NOTA: La concentración óptima para cada quimioatractant a menudo debe determinarse en condiciones de laboratorio antes de los despliegues sobre el terreno. El campo de concentración química disminuirá en magnitud con la distancia de la fuente (pozo ISCA), lo que significa que la concentración experimen....
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Resultados
Esta sección presenta los resultados de laboratorio utilizando el ISCA para probar la respuesta quimiotáctica de los microbios marinos a un rango de concentración de glutamina, un aminoácido conocido por atraer bacterias del suelo14. La concentración de glutamina que provocó la respuesta quimiotáctica más fuerte en las pruebas de laboratorio se utilizó para realizar un ensayo de quimiotaxis en el medio marino.
Para realizar las pruebas de laboratorio, las comunidades de.......
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Discusión
A escala de microorganismos acuáticos, el medio ambiente está lejos de ser homogéneo y a menudo se caracteriza por gradientes físicos/químicos que estructuran las comunidades microbianas1,,15. La capacidad de los microorganismos móviles para utilizar el comportamiento (es decir, quimiotaxis) facilita la bifurcación dentro de estos microambientes heterogéneos1. Estudiar la quimiotaxis directamente en el medio ambiente tiene el potencial de .......
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Divulgaciones
Los autores no declaran ningún conflicto de intereses.
Agradecimientos
Esta investigación fue financiada en parte por la Iniciativa de Microbiología Marina de la Fundación Gordon y Betty Moore, a través de la subvención GBMF3801 a J.R.S. y R.S., y un Premio investigador (GBMF3783) a R.S., así como una beca del Consejo Australiano de Investigación (DE160100636) a J.B.R., un premio de la Fundación Simons a B.S.L. (594111), y una subvención de la Fundación Simons (542395) a R.S. como parte de la Colaboración de Principios de Ecosistemas Microbianos (PriME).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Pegamento acrílico | Evonik | 1133 | Acrifix 1S 0116 |
| Lámina acrílica | McMaster-Carr | 8505K725 | O de otra empresa |
| Cinta adhesiva | Scotch | 3M 810 | Scotch Magic tape |
| Autoclave | Systec | D-200 | O de otra empresa |
| Centrífuga de sobremesa | Fisher Scientific 75002451 | O de otra empresa | |
| Cuerda elástica | Paracord Planet 667569184000 | O de otra empresa | |
| Tubo de centrífuga - 2 mL | Sigma Aldrich | BR780546-500EA | Tubo Eppendorf |
| Tubo de centrífuga cónico - 15 mL | Tubo Fisher Scientific | 11507411 | Falcon |
| Tubo de centrífuga cónico - 50 mL | Fisher Scientific | Tubo 10788561 Falcon | |
| Brazo de despliegue | Irwin | 1964719 | O una empresa diferente |
| Enchufe de la carcasa de despliegue | Fisher Scientific | 21-236-4 | Ver alternativas en el manuscrito |
| Toallitas desechables | Kimtech - Fisher Scientific | 06-666 | Kimwipes |
| Citómetro de flujo | Beckman | C09756 | CYTOFlex |
| Glutaraldehído 25% | Sigma Aldrich | G5882 | O otra empresa |
| Colorante verde fluorescente | Sigma Aldrich | S9430 | SYBR Green I - dilución final 1:10.000 |
| Cartucho de filtro GP hidrófilo - 0,2 y micro; m | Merck | C3235 | Filtro Sterivex Ensayo |
| quimiotaxis in situ (ISCA) | - | - | Contactar con los autores correspondientes |
| Cortadora láser | Epilog Laser | Fusion pro 32 | O de otra empresa |
| Luria Bertani Caldo | Sigma Aldrich | L3022 | O de otra empresa |
| Caldo marino 2216 | VWR | 90004-006 | Difco |
| Nylon tornillos de cabeza plana ranurados | McMaster-Carr | 92929A243 | M 2 y veces; 4 y veces; 8 mm |
| Juego de pipetas | Fisher Scientific | 05-403-151 | O de otra compañía |
| Puntas de pipeta - 1 mL | Fisher Scientific | 21-236-2A | O de otra compañía |
| Puntas de pipeta - 20 µ L | Fisher Scientific | 21-236-4 | O de otra empresa |
| Puntas de pipeta - 200 µ L | Fisher Scientific | 21-236-1 | O de otra empresa |
| Sal marina | Sigma | Aldrich S9883 | Para agua de mar artificial |
| Pipeta serológica - 50 mL | Sigma Aldrich | SIAL1490-100EA | O de otra empresa Filtro |
| jeringa - 0,02 y micro; m | Whatman | WHA68091002 | Filtro Anatop |
| Filtro de jeringa - 0.2 µ m | Fisher Scientific | 10695211 | O de otra empresa |
| Aguja de jeringa 27G | Henke Sass Wolf | 4710004020 | 0.4 × 12 mm |
| Jeringas - 1 mL | Codau | 329650 | Insulina Luer U-100 |
| Jeringas - 10 mL | BD | 303134 | O de otra empresa |
| Jeringas - 50 mL | BD | 15899152 | O |
| tubo de otra empresa rack - 15 mL | Thomas Scientific | 1159V80 | O de otra empresa |
| Rack de tubos - 50 mL | Thomas Scientific | 1159V80 | O de otra empresa |
| Acero de alta velocidad sin recubrimiento Grifo de uso general | McMaster-Carr | 8305A77 | O de otra empresa |
| Filtro de vacío - 0.2 y micro; m | Filtro Merck | SCGPS05RE | Steritop |
Referencias
- Stocker, R. Marine microbes see a sea of gradients. Science. 338, 628-633 (2012).
- Raina, J. B., Fernandez, V., Lambert, B., Stocker, R., Seymour, J. R. The role of microbial motility and chemotaxis in symbiosis. Nature Reviews Microbiology. 17, 284-294 (2019).
- Chet, I., A....
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