Presentamos un protocolo detallado para el sistema de silenciamiento de microARN (VbMS) basado en el virus de la papa X (PVX) para caracterizar funcionalmente los microARN endógenos (miRNAs) en la papa. Las moléculas de imitación objetivo (TM) de miRNA de interés se integran en el vector PVX y se expresan transitoriamente en la papa para silenciar la familia objetivo de miRNA o miRNA.
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Artículo de método
Silenciamiento de microARN a base de X del virus de la papa (VbMS) en la papa.
En este artículo
Resumen
Resumen
El silenciamiento de microARN basado en virus (VbMS) es una herramienta rápida y eficiente para la caracterización funcional de microARN (miARN) en plantas. El sistema VbMS se ha desarrollado y aplicado para varias especies de plantas, incluyendo Nicotiana benthamiana, tomate, Arabidopsis, algodón y plantas monocotiledóneas como el trigo y el maíz. Aquí, describimos un protocolo detallado que utiliza vectores VbMS basados en PVX para silenciar los miRNAs endógenos en la papa. Para derribar la expresión de un miRNA específico, se diseñan moléculas mímicas (TM) objetivo de miRNA de interés, integradas en vectores de virus vegetales, y expresadas en papa por infiltración de Agrobacterium para unirse directamente al miRNA endógeno de interés y bloquear su función.
Introducción
Los microARN de las plantas (miRNAs) se caracterizan por ser ARN reguladores de 20 a 24 nucleótidos de longitud, codificados nuclearmente1 y desempeñan un papel fundamental en casi todos los aspectos de los procesos biológicos de las plantas, incluidos el crecimiento y el desarrollo2,3, la fotosíntesis y el metabolismo4,5,6,7, la síntesis y señalización hormonal8,9, las respuestas bióticas y abióticas1....
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Protocolo
1. Cultiva plantas de papa.
- Propagar plantas de papa in vitro en tubos de cultivo (25 x 150 mm) con medios Murashige y Skoog (MS) más vitamina de Gamborg (mezcla de sal basal de MS, vitamina de Gamborg, sacarosa de 30 g/L, 3,5 g/L de agar, pH = 5,7). Coloque los tubos en la sala de crecimiento por debajo de 20–22 °C, fotoperíodo de luz de 16 h/8 h de luz y de intensidad de luz de 120 μmol/m2∙s1.
NOTA: Los nuevos brotes y raíces normalmente se desarrollan en 1-2 semanas a partir de las plantas. Propague plantas con medios vitamínicos frescos de MS / Gamborg cada mes. - Cuatro semanas después, trasplante plantas in vitro al sue....
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Resultados
La Figura 2 muestra las plantas de papa PVX-STTM165/166 (Katahdin) con crecimiento ectópico de los tejidos de las hojas desde el lado abaxial de la lámina de la hoja a lo largo de las venas. También se han observado fenotipos más severos, como la formación de hojas en forma de trompeta. Por el contrario, no se observó ninguna anomalía fenotípica en las plantas de control de PVX. Estos resultados muestran que el sistema VbMS fue efectivo para suprimir la función endógena del miRNA en plantas .......
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Discusión
Presentamos un sistema de silenciamiento de miRNA basado en PVX para caracterizar la función de los miRNAs endógenos en papa mediante la integración del diseño STTM en el vector PVX. El sistema VbMS demostró ser eficaz en el silenciamiento de miRNA165/166 en papa, una familia de miRNA altamente conservada en todas las especies de plantas.
El enfoque de MT se ha desarrollado para interferir con la expresión de miRNAs basado en un imitador artificial del objetivo de miRNA que está diseñado para .......
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Agradecimientos
Agradecemos al Dr. Yule Liu de la Universidad de Tsinghua por proporcionar el vector PVX-LIC. Este trabajo fue apoyado por un fondo de puesta en marcha de Texas A&M AgriLife Research y el Proyecto Hatch TEX0-1-9675 del Instituto Nacional de Alimentos y Agricultura del USDA a JS.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 100 y micro; M dATP y 100 µ M dTTP | Omega Bio-tek, Inc., Norcross, Norcross, GA 30071 , EE. UU. | TQAC136 | |
| 3 M Acetato de sodio, pH 4.0. | Teknova, Hollister, CA 95023, EE. UU | ||
| Acetosiriringa | TCI America, Portland, OR 97203, EE. UU. | D2666-25G | |
| Cepas de Agrobacterium tumefaciens: GV3101, GV2260 o EHA105. | |||
| Cloroformo | VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, EE. UU. | VWRV0757-950ML | |
| Dimetilsulfóxido, DMSO | TCI America, Portland, OR 97203, EE. UU. | D0798-25G | |
| DTT | VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, EE. UU. | VWRV0281-25G | |
| E. coli DB3.1 | para el mantenimiento de PVX-LIC y pTRV2e que contienen el gen ccdB | ||
| E. coli DH5 y alfa; | para las construcciones de destino generadas por clonación de LIC | ||
| Fertilizante: Peters Peat Lite Special 15-0-15 Dark Weather Feed | ICL Specialty Fertilizers, Summerville, SC 29483, EE. UU. | G99260 | |
| Reactivos de PCR de alta fidelidad: KAPA HiFi ADN polimerasa con dNTP | Roche Secuenciación y Ciencias de la Vida, Kapa Biosystems, Wilmington, MA, EE. UU | . 7958960001 | |
| Alcohol isoamílico | VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, EE. UU. | VWRV0944-1L | |
| Koptec Etanol puro – 200 Proof | Decon Labs, Rey de Prusia, PA 19406 , EE. UU. | V1005M | |
| MES | TCI America, Portland, OR 97203, EE. UU. | M0606-250G | |
| MgCl2 | ThermoFisher, Waltham, MA 02451, EE. UU. | MFCD00149781 | |
| Transcriptasa | inversa M-MuLVNueva Inglaterra BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 EE. UU. | M0253L | |
| Espectrómetro de nanogotas: NanoDrop OneC Espectrofotómetro UV-Vis de microvolumen con Wi-Fi | ThermoFisher, Waltham, MA 02451, EE. UU. | ND-ONEC-W | |
| : Bio-Rad Sistema de PCR MyCycler | Bio-Rad, Hercules, California 94547, EE. UU | 170-9703 | |
| Máquina de PCR: Eppendorf Mastercycler pro | Eppendorf, Hauppauge, NY 11788, EE. UU. | 950030010 | |
| Medidor de pH | Sper Scientific, Scottsdale, AZ 85260, EE. UU | Medidor de pH / mV de sobremesa - 860031 | |
| Fenol: cloroformo: alcohol isoamílico (25:24:1), pH 6,7/8,0. | VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, EE. UU. | VWRV0883-400ML | |
| Phytagel: Gellan Gum | Alfa Aesar, Tewksbury, MA 01876, EE. UU. | J63423-A1 | |
| PVX Vector VIGS: PVX-LIC | Zhao et al., 2016 | ||
| Máquina de PCR en tiempo real: QuantStudio 6 Flex Sistema de PCR en tiempo real | ThermoFisher, Waltham, MA 02451, EE. UU | 4485697 | |
| Reactivo de PCR en tiempo real: KAPA SYBR® Kit FAST qPCR Master Mix (2x) Roche | Secuenciación y Ciencias de la Vida, Kapa Biosystems, Wilmington, MA 01887, EE. UU. | 7959389001 | |
| Enzima de restricción: SmaI | New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 EE. UU | R0141S | |
| Reactivos de transcripción inversa: qScript cDNA SuperMix | Quanta BioSciences, Gaithersburg, MD 20877 , EE. UU | 95107-100 | |
| Kit de extracción de ARN: E.Z.N.A. Arn vegetal Kit | Omega Bio-tek, Inc., Norcross, Norcross, GA 30071 , EE. UU | SKU: D3485-01 | |
| Inhibidor de ARNasa Murine | New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 EE. UU | M0314L | |
| RNAzol RT | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63103, EE. UU. | R4533 | |
| Suelo: Metro-Mix 360 | Sun Gro Horticulture, Agawam, MA 01001-2907, EE. UU. | Metro-Mix 360 | |
| T4 ADN polimerasa y tampón | New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA | M0203S |
Referencias
- Axtell, M. J., Meyers, B. C. Revisiting Criteria for Plant MicroRNA Annotation in the Era of Big Data. The Plant Cell. 30 (2), 272-284 (2018).
- Chen, X. Small RNAs and Their Roles in Plant Development. Annual Review of Cell and Developmental Biology....
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Reimpresiones y permisos
