Aislamiento, Transfección y Cultura a Largo Plazo de Cardiomiocitos adultos de ratón y rata

Perwez Alam; Bryan  D. Maliken; Malina  J. Ivey; Shannon  M. Jones; Onur Kanisicak

doi:10.3791/61073

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Artículo de método

Aislamiento, Transfección y Cultura a Largo Plazo de Cardiomiocitos adultos de ratón y rata

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DOI:

10.3791/61073

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10 de octubre de 2020

Perwez Alam¹ , Bryan D. Maliken¹ , Malina J. Ivey¹ , Shannon M. Jones¹ , Onur Kanisicak¹

¹Department of Pathology and Laboratory Medicine, College of Medicine, University of Cincinnati

En este artículo

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para el aislamiento, la transfección y el cultivo a largo plazo de los cardiomiocitos adultos de ratón y rata.

Resumen

El cultivo ex vivo de los cardiomiocitos de mamíferos adultos (CM) presenta el sistema experimental más relevante para el estudio in vitro de biología cardíaca. Los CM de mamíferos adultos son células diferenciadas terminalmente con una capacidad proliferativa mínima. El estado postmitético de los CM adultos no sólo restringe la progresión del ciclo celular de cardiomiocitos, sino que también limita el cultivo eficiente de los CM. Además, la cultura a largo plazo de los CM adultos es necesaria para muchos estudios, como la proliferación de CM y el análisis de la expresión génica.

El ratón y la rata son los dos animales de laboratorio preferidos para el aislamiento de cardiomiocitos. Si bien la cultura a largo plazo de los CM de rata es posible, los CM de ratón adultos son susceptibles a la muerte y no pueden ser cultivados más de cinco días en condiciones normales. Por lo tanto, hay una necesidad crítica de optimizar el aislamiento celular y el protocolo de cultivo a largo plazo para los CM murine adultos. Con este protocolo modificado, es posible aislar y cultivar con éxito tanto los CM adultos de ratón como de rata durante más de 20 días. Además, la eficiencia de la transfección de siRNA de CM aislada aumenta significativamente en comparación con los informes anteriores. Para el aislamiento CM de ratón adulto, el método de perfusión Langendorff se utiliza con una solución enzimática óptima y tiempo suficiente para la disociación completa de la matriz extracelular. Con el fin de obtener CM ventriculares puras, ambas aurículas fueron diseccionadas y descartadas antes de proceder con la disociación y ensuciamiento. Las células se dispersaron en una placa recubierta de laminina, lo que permitió una fijación eficiente y rápida. Se permitió que los CM se conforman con 4-6 h antes de la transfección del SIRNA. Los medios de cultivo se actualizaron cada 24 horas durante 20 días, y posteriormente, los CM se fijaron y se tiñeron para marcadores específicos de los cardiacos como troponina y marcadores del ciclo celular como KI67.

Introducción

Las enfermedades cardíacas son una de las principales causas de muerte en todo el mundo. Casi todos los tipos de lesiones cardíacas resultan en una pérdida significativa de cardiomiocitos adultos (CM). Los corazones de mamíferos adultos son incapaces de reparar su lesión cardíaca debido a la naturaleza senescente del CM¹adulto. Por lo tanto, cualquier insulto al corazón adulto de los mamíferos resulta en una pérdida permanente de CM, lo que conduce a una reducción de la función cardíaca y la insuficiencia cardíaca. A diferencia de los mamíferos adultos, los animales pequeños como el pez cebra y los corazones newt pueden regenerar su lesión card....