Descubrimiento de genes conductores en tumores timos similares al cáncer de 29 años de origen colorrectal

Summary

Aquí se presenta un protocolo para descubrir los genes conductores sobreexpresados que mantienen las células similares al cáncer derivadas de las células HT29 colorrectales. RNAseq con bioinformática disponible se realizó para investigar y examinar las redes de expresión génica para esclarecer un mecanismo potencial implicado en la supervivencia de las células tumorales dirigidas.

Abstract

Las células madre cancerosas desempeñan un papel vital contra las terapias clínicas, contribuyendo a la recaída tumoral. Hay muchos oncogenes involucrados en la tumorigenesis y el inicio de las propiedades del tallo del cáncer. Dado que la expresión génica en la formación de tumores tirectales derivados del cáncer no está clara, se necesita tiempo para descubrir los mecanismos que trabajan en un gen a la vez. Este estudio demuestra un método para descubrir rápidamente los genes conductores implicados en la supervivencia de las células similares al cáncer colorrectal in vitro. En este estudio se seleccionaron y utilizaron células cancerosas HT29 colorrectales que expresan el LGR5 cuando se cultivan como esferoides y acompañan a un aumento de los marcadores de vástago CD133. El protocolo presentado se utiliza para realizar RNAseq con bioinformática disponible para descubrir rápidamente los genes controladores sobreexpresados en la formación de tumores tirásticos derivados del tallo colorrectal. La metodología puede detectar y descubrir rápidamente posibles genes conductores en otros modelos de enfermedades.

Introduction

El cáncer colorrectal (CRC) es una de las principales causas de muerte con alta prevalencia y mortalidad en todo el mundo^1,,2. Debido a mutaciones genéticas y amplificaciones, las células cancerosas crecen sin control proliferativo, lo que contribuye a la supervivencia celular^3,la antipoptosis⁴y la íltividad del cáncer^5,,6,,7. Dentro de un tejido tumoral, la heterogeneidad tumoral permite que las células tumorales se adapten y sobrevivan durante los tratamientos terapéut....

Protocol

1. Cultivo celular y formación de la tumoral

1. Cultivo de células HT29 en un plato de 10 cm que contiene el medio de águila modificada de Dulbecco (DMEM) con 10% de suero bovino fetal (FBS) y 1% de antibiótico de penicilina-estreptomicina (P/S).
2. Cultivar las células en una incubadora a 37oC con 5% de CO₂ y 95% de humedad en condiciones asépticas, hasta que alcancen el 80% de confluencia.
3. Trypsinize HT29 cells with 1 mL of 0.25% trypsin for 5 min at 37 oC and asly neutrally the trypsin by adding 2 mL of DMEM with 10% FBS and 1% P/S.
4. Cuente las células HT29 usando un hemocicómetro.
5. Añadir 2.000 células/pozo a un....

Results

Para establecer el modelo para investigar el mecanismo en las células madre cancerosas, se utilizaron células TI29 colorrectales para cultivar las tumoresferas similares al cáncer in vitro en una placa de baja unión que contiene B27, EGF, bFGF, HGF e IL6. Las tumoresferas >100 m de diámetro se formaron en 7 días(Figura 1A). Las tumoresferas se tripsinaronizaron a células individuales y se analizaron utilizando citometría de flujo para detectar la expresión LGR5 y CD133. LGR5 aumentó en la.......

Discussion

En este estudio, se utilizaron tumores de tipo tallo cultivado como modelo en el análisis de datos RNAseq con bioinformática disponible. Para un modelo de enfermedad, se utilizaron tumores timóferas derivadas de HT29. Debido a que las tumoresferas tienen resistencia a los medicamentos contra las terapias tumorales, el modelo establecido se puede utilizar para investigar los mecanismos detallados de resistencia mediante la investigación de las diferencias en la expresión génica. Además, la tecnología genómica que utiliza .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
imagen celular iRiS	Logos Biosystems, Inc	I10999	para observar la formación de tumoreras
Citometría de flujo	BD biosciences	FACSCalibur	para la detección de LGR5 y CD133 en las esferas tumorales
anti-LGR5-PE	Biolegend	373803	reactivo de detección LGR5
anti-CD133-PE	Biolegend	372803	Detección de CD133 reactivo
EGF	GenScript	Z00333	para el cultivo de tumores
bFGF	GenScript	Z03116	para el cultivo de tumoresferas
HGF	GenScript	Z03229	para el cultivo de tumoresferas
IL6	GenScript	Z03034	para el cultivo de tumoresferas
PureLink Kit de extracción de ARN	Invitrogen 12183025		ARN total para el análisis de RNAseq
Rendimiento de RNAseq	Biotools, Taiwán		El análisis de RNAseq se realiza comercialmente por Biotools, Ttaiwan
NetworkAnalyst	Institute of Parasitology, McGill University, Montreal, Quebec, Canadá		http://www.networkanalyst.ca/
Prism	GraphPad Software		un software de análisis estadístico