Artículo de método

Ensayo basado en flujo para la identificación de moduladores de la autofagia para la osteoartritis

DOI:

10.3791/61078

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8 de julio de 2020

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1Grupo de Biología del Cartílago, Servicio de Reumatología, Instituto de Investigación Biomédica de A Coruña (INIBIC), Complejo Hospitalario Universitario de A Coruña, 2Biofarma Research Group, Center for Research in Molecular Medicine and Chronic Diseases (CIMUS), Universidad de Santiago de Compostela

En este artículo

Resumen

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Este artículo detalla el monitoreo del flujo de autofagia para identificar nuevas moléculas mediante el cribado por imágenes basadas en células.

Resumen

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La autofagia es un mecanismo central para regular la homeostasis. Las alteraciones de la autofagia contribuyen a las enfermedades relacionadas con el envejecimiento. Los métodos fenotípicos para identificar los reguladores de la autofagia podrían utilizarse para la identificación de nuevas terapias. Este artículo describe un flujo de trabajo de cribado por imágenes basado en células desarrollado para monitorizar el flujo autofágico utilizando LC3 como indicador del flujo autofágico (mCherry-EGFP-LC3B) en condrocitos humanos. La adquisición de datos se realiza utilizando un microscopio automatizado del sistema de detección de imágenes de alto contenido. Se desarrolló y validó un protocolo de análisis de imágenes automatizado basado en algoritmos para identificar moléculas que activan el flujo autofágico. Se informan pasos críticos, notas explicativas y mejoras con respecto a los protocolos actuales de monitoreo de autofagia. Los enfoques de cribado fenotípico fisiológicamente relevantes para determinar las características distintivas del envejecimiento pueden facilitar estrategias de descubrimiento de fármacos más eficaces para las enfermedades musculoesqueléticas relacionadas con la edad.

Introducción

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Muchas enfermedades crónicas están asociadas con las características distintivas del envejecimiento, incluida la autofagia defectuosa. La artrosis (OA) es la enfermedad articular más prevalente y tiene un gran impacto en la restricción de las actividades cotidianas en la población envejecida, pero aún no se dispone de medidas preventivas ni de tratamientos modificadores de la enfermedad2.

El envejecimiento articular y la artrosis se asocian con características que definen la progresión de la degeneración del cartílago, incluida la autofagia defectuosa y la senescencia 3,4. Dirigirse a la autofagia en los tejidos musculoesqueléticos puede ayudar a encontrar innovaciones terapéuticas para las enfermedades reumatológicas 5,6. La modulación farmacológica de la autofagia es un mecanismo prometedor y relevante para la intervención en modelos preclínicos de enfermedad7. En la artrosis, la activación de la autofagia se ha utilizado para prevenir la disfunción articular8. Los métodos para monitorear la autofagia basados en protocolos sólidos y reproducibles que permiten el análisis cuantitativo se pueden utilizar para identificar agentes novedosos y facilitar la orientación farmacológica de las características distintivas del envejecimiento relevantes para la enfermedad.

El flujo de autofagia refleja la actividad de degradación y es una medida relevante para identificar nuevas moléculas que activan la autofagia9. Este estudio describe un método desarrollado para determinar el flujo autofágico mediante la medición de la actividad de degradación autofágica utilizando una línea celular reportera de autofagia en condrocitos humanos (TC28a2). La expresión transitoria de mCherry-EGFP-LC3- permite el monitoreo simultáneo de los eventos de formación y degradación de autolisosomas al cuantificar las diferencias en la sensibilidad al pH entre las señales de GFP y mCherry LC3 en los lisosomas de células vivas10.

La adaptación de este método de citometría de flujo a un sistema de monitorización de imágenes de expresión estable en condrocitos vivos puede permitir la identificación de moléculas que activan el flujo autofágico en el contexto de la biología del cartílago.

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Protocolo

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1. Generación de línea celular reportera de autofagia de condrocitos humanos inmortalizados

NOTA: La generación de una línea celular reportera de autofagia por transfección estable de pBABE-mCherry-GFP-LC3 mediante el establecimiento de una lectura cuantitativa de citometría de flujo se describió anteriormente11. Se utilizaron dos líneas celulares en la transfección retroviral: HEK 293-T17 durante el proceso de cotransfección y T/C28a2 en la etapa de infección.

  1. Proceso de cotransfección
    1. Prepare el medio de crecimiento para las células HEK 293-T17: 500 ml de medio esencial mínimo de Eagle (EMEM), 10% de suero fetal bovino (FBS) y 1% de penicilina-estreptomicina (P/S). Almacene el medio de crecimiento a 4 °C y caliéntelo a 37 °C antes de cada uso.
    2. Siembre 1 x 106 células HEK 293-T17 por pocillo en placas de cultivo celular de 100 mm, incube a 37 °C y 5% de CO2, y asegúrese de que estén a ~75% de confluencia antes de comenzar el proceso de cotransfección.
    3. Retire el medio de cultivo, enjuague con la solución salina equilibrada de Hank (HBSS) y agregue 8 mL de EMEM con 2% de FBS y 1% de P/S.
    4. En un tubo cónico, agregue 10 μg, 3 μg y 7 μg de pBABE-puro mCherry-EGFP-LC3B, VSV. plásmidos G y pCL-Eco, respectivamente. A continuación, añadir 200 μL de medio sérico reducido 1x (Tabla de materiales). Agregue el reactivo de transfección (Tabla de materiales) como una mezcla no liposomal de lípidos para tener una proporción de 1:3 (1 μg de ADN: 3 μg de reactivo de transfección; volumen final = 60 μL).
      NOTA: Se prepara un total de 20 μg de mezcla por cada placa de celda de 10 cm que se va a transfectar.
    5. Incubar la mezcla durante 20 min a temperatura ambiente. Transfiera con cuidado la mezcla de transfección gota a gota a las celdas de empaque HEK 293-T17. Incubar las células a 37 °C y 5% de CO2 al menos 48 h antes de comprobar la expresión de proteínas verdes y rojas mediante microscopía fluorescente.
      NOTA: En estas condiciones, más del 75% de las células deben ser positivas para la fluorescencia. Asegúrese de que la eficiencia de la transfección sea alta (por ejemplo, más del 75% de las células son positivas). Utilice ADN plasmídico de alta calidad (p. ej., predominantemente superenrollado y libre de ADN, ARN y proteínas genómicos; altamente concentrado; libre de endotoxinas y sales), así como cultivos celulares de alta calidad (p. ej., homogéneos, de paso bajo, monocapa, transfectados en la fase de crecimiento exponencial, libres de micoplasma).
  2. El mismo día de la cotransfección, prepare condrocitos T/C28a2.
    1. Prepare el medio de crecimiento celular T/C28a2: 500 mL de medio Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco, 10% de suero fetal de ternero (FCS) y 1% P/S. Almacene el medio de crecimiento a 4 °C y caliente a 37 °C antes de cada uso.
    2. Siembre 2 x 10condrocitos de 5 T/C28a2 en dos multiplacas de 6 pocillos e incube durante 48 h a 37 °C y 5% de CO2.
  3. Proceso de infección retroviral
    1. Aspire el medio de cultivo de las células de empaquetado retroviral HEK 293-T17 obtenido del paso 1.1.5. Enjuague 1 vez con 4 ml de HBSS y aspire HBSS.
    2. Añadir 2 mL de tripsina y esperar 2 min a 37 °C. Neutralice la tripsina añadiendo 6 mL de medio de cultivo HEK 293-T17 y transfira las células y el medio en tubos cónicos de 15 mL.
    3. Centrifugar las celdas a 400 x g durante 5 min. Transfiere el sobrenadante a un filtro estéril a través de una membrana de 0,45 μm.
    4. Aspire el medio de cultivo de condrocitos T/C28a2 de las multiplacas de 6 pocillos. Infecte las células T/C28a2 añadiendo 2 mL de suspensión viral (paso 1.3.3) por pocillo en 6 multiplacas de pocillos. Use un pocillo para el control (es decir, células no transfectadas), agregando 2 mL de medio de crecimiento celular T/C28a2 en lugar de suspensión viral.
    5. Incubar durante 48 h a 37 °C y 5% de CO2.
  4. Para llevar a cabo el proceso de selección, se utiliza una selección de antibióticos en las células transfectadas para eliminar las células no transfectadas y obtener una población celular homogénea.
    NOTA: El vector retroviral pBABE-puro mCherry-EGFP-LC3B proporciona resistencia a los antibióticos de los mamíferos a la puromicina, lo que permite la selección de un cultivo celular estable después de la transfección viral. Las curvas de muerte para la concentración óptima de puromicina de los condrocitos T/C28a2 deben establecerse con antelación para establecer las condiciones adecuadas para seleccionar los clones de células portadoras del transgén con altos niveles de expresión.
    1. Prepare el medio de crecimiento de la línea celular estable T/C28a2-pBABE-puro mCherry-EGFP-LC3B: 500 mL de DMEM, 10% FCS, 1% P/S y 2,5 μL/mL de puromicina. Almacene el medio a 4 °C y caliente a 37 °C antes de cada uso.
    2. Cambia el medio. Por cada multiplaca de 6 pocillos, aspire el medio de cultivo, enjuague 1 vez con 2 mL de HBSS y aspire. Añadir 2 mL de medio e incubar a 37 °C y 5% de CO2. Este es el comienzo del proceso de selección.
    3. Reemplace el medio cada 2 días y observe las células muertas y las poblaciones de células resistentes a la puromicina. Compare los resultados con las células de control no transfectadas, que no son resistentes a la puromicina y mueren.
  5. Para iniciar la selección clonal, asegúrese de que las poblaciones monoclonales hayan crecido. Por cada multiplaca de 6 pocillos:
    1. Agregue 200 μL de medio por pocillo en una multiplaca de 96 pocillos.
      NOTA: Cada celda seleccionada de la multiplaca de 6 pocillos se plateará en pocillos individuales de la multiplaca de 96 pocillos.
    2. Utilice un microscopio para identificar cada población monoclonal en las multiplacas de 6 pocillos. Se pueden observar colonias formadas a partir de células individuales.
    3. Aspire el medio de cultivo de 6 multiplacas de pocillos, enjuague 1 vez con 2 mL de HBSS y aspire HBSS.
    4. Agregue 10 μL de tripsina a cada población monoclonal para transferir células individuales a cada pocillo de las 96 multiplacas de pocillos. Incubar durante 48 h a 37 °C y 5% de CO2.
  6. Después de 48 h, reemplace el medio con 100 μL de medio fresco por pocillo. Repita este procedimiento hasta que se formen colonias debido a la expansión de células individuales.
  7. Una vez que una sola célula se ha expandido bien, coloque cada población monoclonal en pocillos individuales de 24 pocillos, 6 pocillos y placas de cultivo celular de 100 mm.
  8. Genere una línea celular monoclonal estable utilizando un método de clasificación de una sola célula.
    1. Aspire el medio de cultivo a partir de placas de cultivo celular de 100 mm. Enjuague 1 vez con 8 mL de HBSS y aspire.
    2. Añadir 2 mL de tripsina en cada placa e incubar durante 2 min a 37 °C. Neutralizar la tripsina añadiendo 8 mL de medio de cultivo.
    3. Centrifugar las células a 252 x g durante 5 min y desechar el sobrenadante. Agregue 4 mL de HBSS a cada gránulo celular, vuelva a suspenderlo con cuidado y transfiéralo a los tubos de citometría.
    4. Inyecte cada muestra de célula en un citómetro de flujo (Tabla de Materiales) con tecnología de clasificación de células y celdas separadas con alta fluorescencia verde y roja.
    5. Transfiera las células seleccionadas a tubos cónicos de 15 mL y centrifuga las celdas a 252 x g durante 5 min. Agregue el pellet de celda a un matraz T-25 con 9 mL de medio de crecimiento de línea celular estable. Incubar a 37 °C y 5% deCO2.
      NOTA: Después de la clasificación celular, se deben obtener tres poblaciones monoclonales (Tabla 1).
  9. Pasadas las 24 h, retira el medio y añade 8 mL de medio fresco. Repita este procedimiento cada 2 días hasta que las células alcancen la confluencia.
    NOTA: Para estudiar el flujo autofágico, se pueden utilizar dos controles: la rapamicina como referencia de señal de flujo autofágico alto y la cloroquina como referencia de señal de flujo autofágico bajo. Preparar una solución madre de rapamicina de 10 mM en dimetilsulfóxido (DMSO) y una solución madre de cloroquina de 30 mM enH2O y almacenar a -20 °C. Para seleccionar la mejor población monoclonal mediante el ensayo de la expresión mCherry y GFP, se pueden utilizar dos métodos: citometría de flujo (paso 1.10) o análisis de imágenes fluorescentes de alto contenido (paso 1.11).
  10. Citometría de flujo
    1. Siembre 2,5 x 105 células por pocillo de cada población monoclonal en placas de 12 pocillos al menos 24 h antes del tratamiento en 1 mL de medio de crecimiento de línea celular estable e incube a 37 °C y 5% de CO2.
    2. El día del tratamiento, retire el medio, agregue 1 mL de medio de crecimiento de línea celular estable suplementado con 2% de FCS por pocillo. Añadir 10 μM de rapamicina y 30 μM de cloroquina al medio de crecimiento de la línea celular estable con un 2% de FCS e incubar durante 16 h a 37 °C y 5% de CO2.
    3. Retire el medio, enjuague con 1 ml de HBSS por pocillo y aspire.
    4. Añadir 500 μL de tripsina en cada pocillo, incubar 1 min a 37 °C y neutralizar la reacción añadiendo 500 μL de medio de cultivo. Raspe las células y transfiéralas a tubos cónicos.
    5. Centrifugar las células a 252 x g durante 5 min y aspirar el sobrenadante. Enjuague los gránulos celulares con 500 μL de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Centrifugar a 252 x g durante 5 min y desechar el sobrenadante.
    6. Agregue 500 μL de PBS, transfiera las células a los tubos de citometría e inyecte cada muestra en el equipo de citometría. Para cada condición, recoge 10.000 eventos.
    7. Para seleccionar la población monoclonal por citometría de flujo, utilice un láser de 488 nm para excitar EGFP y un láser de 633 nm para mCherry. A continuación, establezca una relación de fluorescencia de mCherry y EGFP para seleccionar la población celular con alto y bajo flujo autofágico.
  11. Análisis de imágenes fluorescentes de alto contenido
    1. Siembre 4 x 103 células de cada población monoclonal por pocillo en placas de 384 pocillos (pared negra/fondo transparente) en medio de crecimiento suplementado con 10% de FCS, 1% de P/S y 2,5 μL/mL de puromicina. Incubar a 37 °C y 5% de CO2 durante 24 h antes del tratamiento.
    2. Retire el medio y agregue 10 μM de rapamicina y 30 μM de cloroquina en 50 μL de medio de crecimiento de línea celular estable suplementado con 2% de FCS por pocillo. Incubar durante 16 h a 37 °C y 5% de CO2.
    3. Retire el medio, enjuague con 50 μL de HBSS por pocillo y aspire. Fije las celdas con paraformaldehído (PFA) al 4% durante 10 min a 37 °C. Retire el PFA y enjuague con 50 μL de HBSS por pocillo.
    4. Para identificar los núcleos celulares, teñir con Hoechst 33342 (2,5 μg/mL) durante 10 min a 37 °C. Aspire el tinte Hoechst 33342, enjuague con 50 μL de HBSS por pocillo y agregue 50 μL de PBS por pocillo.
    5. Realizar la adquisición y el análisis de datos del flujo autófago obtenido por la plataforma HTS como se describe en la sección 3.
      NOTA: El criterio para seleccionar la población monoclonal se basa en si el flujo autofágico aumentó o disminuyó con rapamicina o cloroquina, respectivamente (Tabla 1). Los clones con altos niveles de expresión de mCherry y GFP son más apropiados para la cuantificación precisa del análisis de imágenes fluorescentes de alto contenido del flujo de autofagia.

2. Ensayo de flujo autofágico basado en imágenes en condrocitos vivos

NOTA: Después de seleccionar un clon, inicie el ensayo para cuantificar el flujo autofágico.

  1. Utilizando una pipeta electrónica portátil de 384 canales, siembre 4 x 103 celdas del clon seleccionado (paso 1.11) por pocillo en placas de 384 pocillos (pared negra/fondo transparente) en 50 μL de medio de crecimiento de línea celular estable suplementado con 10% de FCS, 1% de P/S y 2,5 μL/mL de puromicina por pocillo. Incubar a 37 °C y 5% de CO2 durante 24 h antes del tratamiento.
  2. El día del experimento, prepare una placa de intervalo para la adición de compuestos.
    1. Añada un volumen de cada compuesto/controles y medio de crecimiento de línea celular estable a la placa de intervalo utilizando tecnología de manejo de líquidos acústicos y una pipeta electrónica de 384 canales, respectivamente, para obtener una concentración de intervalo.
      NOTA: Los controles de este ensayo incluyeron un medio de crecimiento de líneas celulares estables suplementado con FCS al 2%, 30 μM de cloroquina y 10 μM de rapamicina. Las concentraciones de intervalo dependerán de la concentración final deseada. Por ejemplo, en este ensayo, se agregaron cloroquina y rapamicina en 50 μL de medio de crecimiento de línea celular estable por pocillo para obtener una concentración de intervalo de 300 μM y 100 μM, respectivamente.
    2. Utilizando un robot lavadora de microplacas, aspire el medio de la placa celular de forma automatizada y agregue 45 μL de medio de crecimiento de línea celular estable suplementado con un 2% de FCS por pocillo.
    3. A continuación, transfiera 5 μL por pocillo de la placa de intervalo a la placa de ensayo para obtener una concentración final utilizando otra estación de trabajo automatizada de manipulador de líquidos.
  3. Incubar a 37 °C y 5% de CO2 durante 16 h. Con un robot lavadora de microplacas, aspire el medio.
  4. Fije las celdas con 50 μL de PFA al 4% por pocillo durante 10 min a 37 °C. Lavar con 50 μL de HBSS por pocillo.
  5. Teñir los núcleos con Hoechst 33342 (2,5 μg/mL) durante 10 min a 37 °C. Aspire Hoechst 33342 y enjuague con 50 μL de HBSS por pocillo.
  6. Agregue 50 μL de PBS por pocillo. La placa ya está lista para la lectura, la recopilación de datos y el análisis posterior.
    NOTA: Este protocolo se describe para el cribado de alto rendimiento (HTS). Sin embargo, si se utilizan pocos compuestos, se pueden agregar manualmente, sin instrumentos automáticos. La manipulación mínima de las células y el sobrenadante mediante instrumentos de manipulación de líquidos calibrados y/o pipetas electrónicas facilita la preparación exitosa de monocapas de cultivo celular para la cuantificación del flujo de autofagia mediante el análisis de imágenes fluorescentes de alto contenido.

3. Adquisición de datos y análisis del flujo autofágico

  1. Para la adquisición de datos, utilice un sistema de cribado de alto contenido (HCS) y un microscopio automatizado, que permite la adquisición y el análisis automatizados de imágenes mediante un algoritmo de procesamiento de imágenes.
  2. Para desarrollar un protocolo de adquisición, seleccione varios canales y tiempos de exposición (Tabla 2) para identificar los núcleos y la formación de autofagosomas y autolisosomas durante eventos de flujo autofágico.
  3. Para cada pozo, recoja imágenes de cuatro campos que cubran la superficie del pozo y en cuatro pilas a partir de 8 μm separadas por una distancia de trabajo de 0,2 μm. Capture las imágenes con un objetivo de 60x para obtener imágenes celulares detalladas.
  4. Analice los datos utilizando el software de análisis de imágenes proporcionado por el microscopio HCS. Para desarrollar un algoritmo de protocolo de análisis robusto para el monitoreo del flujo de autofagia, seleccione el método más apropiado para la segmentación automatizada de imágenes celulares y para detectar específicamente las manchas correspondientes a la activación de LC3. Realice la secuencia de análisis final agregando métodos, pasos de segmentación de celdas e instrucciones de cuantificación como se describe a continuación:
    1. Haga clic en el bloque de creación Buscar núcleos y elija el canal de colorante nuclear Hoechst 33342. Seleccione Método y elija los núcleos de población de salida.
    2. Haga clic en el bloque de creación Buscar citoplasma y elija el canal de colorante citoplasmático Fluoresceína. Seleccionar método | Umbral individual.
    3. Haga clic en el bloque de creación Buscar citoplasma (2) y elija la RFP del canal de colorante citoplasmático. Seleccionar método | Umbral individual.
    4. Haga clic en el bloque de creación Población y seleccione los núcleos de población de estudio. Seleccione el método Filtros comunes (Eliminar objetos de borde) y elija la población de salida Núcleos dentro de los bordes.
    5. Haga clic en el bloque de creación Buscar puntos y elija el canal de marcador específico Fluoresceína. Seleccione los núcleos de la población de estudio dentro de los bordes y seleccione la región de estudio Citoplasma. Seleccione Método y elija la población de salida Puntos dentro de los bordes.
    6. Haga clic en el bloque de creación Buscar puntos (2) y elija la RFP de canal de marcador específica. Seleccione la población de estudio Núcleos dentro de los bordes y seleccione la región de estudio Citoplasma (2). Seleccione Método y elija la población de salida Puntos (2) Dentro de los bordes.
    7. Haga clic en el bloque de creación Calcular propiedades de intensidad y elija el canal de marcador específico Fluoresceína. Seleccione los núcleos de la población de estudio dentro de los bordes y seleccione el punto de la región de estudio. Seleccione Método y elija las propiedades de salida Intensidad, Fluoresceína puntual, Bordes interiores.
    8. Haga clic en el bloque de creación Calcular propiedades de intensidad y elija la RFP de canal de marcador específica. Seleccione los núcleos de la población de estudio dentro de los bordes y seleccione el punto de la región de estudio (2). Seleccione Método y elija las propiedades de salida Intensidad Punto (2) RFP Bordes interiores.
    9. Haga clic en el bloque de creación Definir resultados , seleccione Núcleos de población dentro de los bordes, seleccione Número de objetos de los núcleos (media), seleccione Puntos de intensidad relativa Fluoresceína - media por pocillo y seleccione Puntos de intensidad relativa (2) - RFP - media por pocillo.
  5. Para cuantificar el flujo autófico, utilice el mismo método descrito anteriormente para el análisis de citometría de flujo11. Establecer la relación mCherry/EGFP de las manchas de intensidad relativa.
    NOTA: Las celdas con mayor flujo son menos verdes, lo que aumenta la relación mCherry/EGFP en la celda. Identificar y cuantificar con precisión un número significativo de las señales relevantes provenientes de los eventos de flujo de autofagia en las células es muy importante para establecer diferencias estadísticamente significativas.

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Resultados

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El flujo autofágico puede monitorizarse en las células mediante modulación farmacológica o mediante la respuesta al estrés celular. Se emplearon condrocitos humanos inmortalizados (T/C28a2) para desarrollar una línea celular reportera de autofagia utilizando LC3 como reportero fluorescente (mCherry-EGFP-LC3B) para la autofagia. La Figura 1 muestra el flujo de trabajo esquemático del ensayo de cribado desde el desarrollo de la línea celular reportera de autofagia en condrocitos humanos (mCher...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La autofagia defectuosa es un sello distintivo importante de la degeneración articular relacionada con el envejecimiento, pero aún no se dispone de tratamientos preventivos ni modificadores de la enfermedad dirigidos a la autofagia para ladegeneración del cartílago. Dada su relevancia e implicaciones clínicas, la autofagia se ha convertido en un objetivo de interés para el descubrimiento y desarrollo de fármacos, aunque los métodos para monitorear directamente los...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este estudio ha sido financiado por el Instituto de Salud Carlos III- Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades, España, Plan Estatal 2013-2016 y el Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER), "Una manera de hacer Europa", PI14/01324 y PI17/02059, por la plataforma Innopharma Pharmacogenomics aplicada a la validación de dianas y descubrimiento de fármacos candidatos a fases preclínicas, Ministerio de Economía y Competitividad. También agradecemos a la Fundación para la Investigación en Reumatología (FOREUM) por su apoyo.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Placa de cultivo celular de 100 mmCorning430167Placa de cultivo celular
Multiplaca de 12 pocillosCorning353043Placa de cultivo celular
15 mL Tubo cónico de centrífugaFalcon-Corning352095Tubo cónico
de centrífuga Multiplaca de 24 pocillosCorning351147Placa de cultivo celular
Matrazde cultivo celular de 25 cm2Matraz de cultivo celular Falcon-Corning
353014 Multiplaca de 384 pocillos PerkinElmer6007550Placa de cultivo celular
Multiplaca de 6 pocillosCorning351146Placa de cultivo celular
Multiplaca de 96 pocillosCorning353077Placa de cultivo celular
Tecnología acústica de manejo de líquidosLabcyte−https://www.labcyte.com
CloroquinaSigma-AldrichC6628inhibidor de flujo autofágico
Dimetilsulfóxido (DMSO)Sigma-Aldrich, St. Louis, MOD2650Disolvente
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)Lonza, Basilea, SuizaBE-604FT/C28a2 medio
de crecimiento Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM)ATCC30– 2003HEK 293-T17 medio de crecimiento
FACScitómetro de caliburBecton Dickinson, CA−https://www.bdbiosciences.com/en-eu
Suero fetal bovino (FBS)Sigma-Aldrich, St. Louis, MOF9665HEK 293-T17 suero
Suero fetal para terneros (FCS)Gibco by Life Technologies, CA26010– 074Suero
FuGenePromegaE2691Una mezcla no liposomal de lípidos como método de administración de plásmidos para crear una línea celular autofagia reportada
Pipeta electrónica portátil de 384 canalesIntegra−https://www.integra-biosciences.com/united-states/en/electronic-pipettes/viaflo-96384#downloads
Solución salina equilibrada de Hank (HBSS)Sigma-AldrichH6648Tampón
HEK 293-T17ATCCCRL-11268Línea celular de riñón. Se utilizaron células para facilitar el empaquetamiento retroviral
Sistema de cribado de alto contenidoPerkin Elmer−https://www.perkinelmer.com/es/product/operetta-cls-system-hh16000000
Hoechst 33342Thermo Fisher Scientific62249de análisis de imágenes de tinción de ADN
Perkin Elmer−https://www.perkinelmer.com/es/product/harmony-4-9-office-license-hh17000010
Estación de trabajo para manipuladores de líquidosPerkin Elmer−https://www.perkinelmer.com/es/category/janus-liquid-handler-workstations
robot lavadora de microplacasBiotek−https://go.biotek.com/405tradein
Opti-MEM® (1 vez)Thermo Fisher Scientific11058Medio de transfección
Paraformaldehído (PFA)Sigma-Aldrich158127Fixer
pBABE-puro mCherry-EGFP-LC3BAddgene, Cambridge, MA22418Plásmido
pCL-EcoAddgene, Cambridge, MA12371Plásmido
Penicilina-Estreptomicina (P/S)Sigma-AldrichP0781Antibiótico
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)MP Biomedicals2810305tampón
PuromycinSigma-Aldrich, St. Louis, MOP8833Antibiótico
RapamicinaCalbiochem, Alemania5053210activador de flujo autofágico
Software CellQuestProBecton Dickinson−https://www.bdbiosciences.com/en-eu
Filtros de jeringa 0,45 μ mCorningCLS431220Filtro estéril
T/C28a2−&menos;Línea celular de condrocitos humanos
TripsinaGibco de Life Technologies, CA 15400054Tripsina utilizada con células T/C28a2
TripsinaSigma-Aldrich, St. Louis, MOSM-2002-CTripsina utilizada con células HEK 293-T17
VSV. GAddgene, Cambridge, MA14888plásmido
Software

Referencias

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