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Imágenes tridimensionales de la vasculatura y el drenaje linfáticos vertebrales utilizando iDISCO+ y microscopía de fluorescencia de láminas de luz

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DOI:

10.3791/61099

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22 de mayo de 2020

 ,  , 
1Université Pierre et Marie Curie Paris, Sorbonne Université, Institut du Cerveau et de la Moelle Epinière, 2Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade Federal do Rio de Janeiro, 3Department of Neurology, Yale University School of Medicine

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Se presenta un protocolo que combina la limpieza de tejidos con la microscopía de fluorescencia de láminas de luz (LSFM) para obtener imágenes tridimensionales y de resolución celular de los vasos linfáticos y ganglios linfáticos (LN) que recogen el líquido cefalorraquídeo (LC) y el líquido epidural espinal.

Resumen

El sistema linfático asociado con el sistema nervioso central (SNC) incluye la vasculatura linfática que gira alrededor del cerebro, la médula espinal y sus LN asociados. El sistema linfático asociado al SNC participa en el drenaje de macromoléculas y células inmunes meningeales hacia los LN que drenan del SNC, regulando así el aclaramiento de residuos y la vigilancia inmune dentro de los tejidos del SNC. Presentado es un enfoque novedoso para obtener imágenes tridimensionales (3D) y de resolución celular de linfáticas asociadas al SNC, preservando al mismo tiempo la integridad de sus circuitos dentro de los tejidos circundantes. El protocolo iDISCO+ se utiliza para inmunoetiquetar vasos linfáticos en preparaciones de montaje integral descalcificadas y despejadas de la columna vertebral que posteriormente se visualizan con microscopía de fluorescencia de láminas de luz (LSFM). La técnica revela la estructura 3D de la red linfática que conecta los espacios meningeales y epidurales alrededor de la médula espinal con los vasos linfáticos extravertebrales. Se proporcionan imágenes 3D de los circuitos de drenaje de los trazadores moleculares previamente inyectados en el CSF a través de la cisterna magna o el parénquima espinal toracolumbar. El enfoque iDISCO+/LSFM ofrece oportunidades sin precedentes para explorar la estructura y función del sistema linfático asociado al SNC en biología neurovascular, neuroinmunología, cáncer cerebral y vertebral, o biología ósea y articular vertebral.

Introducción

El SNC está rodeado por el CSF y capas superpuestas de meninges, tejido epidural y huesos. En total, el CSF proporciona protección física al cerebro blando y la médula espinal. Es secretado principalmente por el plexo coroides y las membranas meningeales (es decir, el pia mater, el aracnoideo y el dura mater). El complejo CSF-meningeal también establece una interfaz funcional entre los tejidos del SNC y el resto del cuerpo, contribuyendo así a la homeostasis del SNC. En primer lugar, el CSF penetra en el parénquima del SNC a través de los espacios paraparciales del SNC e interactúa dinámicamente con el líquido intersticial (ISF)1 a través del sistema glimphatic (glia-lymphático), que consiste en los espacios paravasculares y las membranas de los pies finales de astrocito alrededor de los vasos del SNC2,,3,,4. Los residuos metabólicos y el exceso de líquido se eliminan en última instancia por el drenaje perivascular intramuros directamente desde el parénquima cerebral hacia la circulación sistémica3,así como los espacios paravenosos hacia el LÍQUIDO CEF y a través de vasos linfáticos que drenan cerebros, de acuerdo con el modelo gliméptico2,,4. La salida del líquido cefa bolivia se realiza principalmente a través del sistema linfático, a través de la placa cribriforma y de los vasos linfáticos extracraneales asociados5,6,7, así como por los vasos linfáticos meningeales, que convergen en los LNs8,9,10,11,12 (Figura 1)., Un papel importante, aunque secundario, en la salida de CSF es tomado por la vello aracnoides craneal, que penetran en la laguna de los senos venosos meningeales13.

Los circuitos de drenaje CFS han sido ampliamente investigados a través de enfoques experimentales basados en la inyección de trazadores de color/fluorescentes en el SNC o CSF, seguidos de la imagen del patrón de trazadores dentro del SNC y en todos los órganos y tejidos del cuerpo en diferentes puntos de tiempo después de la inyección13. Durante mucho tiempo, la salida de CSF se consideró que se tomaba de forma exclusiva y directa por la circulación sanguínea, a través de líllos arácnoides que se proyectaban en senos venosos durales13. Sin embargo, la salida del líquido cefaculo se realiza predominantemente por la vasculatura linfática, como se ha demostrado recientemente por las imágenes dinámicas de infrarrojo cercano (NIR) del transporte de trazador inyectado en LSF en ratones9,,10. Los vasos linfáticos drenantes del FSB regresan la linfa al torrente sanguíneo a través de la vena subclavia derecha. Los approches complementarios han detectado tanto las salidas extracraniales6,,7,,13 como las intracraneales9,10,11,12 salidas linfáticas de los trazadores inyectados por LCR y sugieren que el LCR se absorbe por dos vías linfáticas, una externa y otra interna al cráneo y la columna vertebral. La parte principal del drenaje del CSF se produce rápidamente a través de vasos linfáticos situados rostralmente, fuera del cráneo en la mucosa nasal, a través de canales de la placa cribriforma del hueso emoide3,6,13 y, a continuación, fuera de los huesos vertebrales lumbosacrales a través de rutas dorsolaterales que aún no se caracterizan completamente7,14. Además, en las meninges del cráneo, los capilares linfáticos de la dura mater directa absorben el FCA y las células inmunitarias meningeales hacia los colectores linfáticos durales que cruzan los huesos del cráneo y se conectan a los LN que drenan del SNC12,,14. Estos vasos linfáticos meningeales desempeñan un papel importante en la fisiopatología del SNC, porque los linfáticos meningeales cerebrales se alteran sobre el envejecimiento y también afectan el resultado de las enfermedades cerebrales neurológicas, incluyendo la neurodegeneración, la neuroinflamación, y el cáncer cerebral15,,16,,17. Por lo tanto, la vasculatura linfática asociada al SNC (es decir, los vasos linfáticos durales y periféricos que drenan el líquido cefalorreo) puede ser un objetivo novedoso prometedor para combatir las enfermedades del SNC en los seres humanos.

Los estudios convergentes realizados con inmunohistología y resonancia magnética de alta resolución demostraron que la vasculatura linfática meningeal también existe en primates, incluidos monos marmoset comunes y humanos7,,11,,13. Además, los vasos linfáticos meningeales no se limitan al cráneo, sino que se extienden dentro de la columna vertebral hasta la superficie de los ganglios espinales yrami 13,,18. Recientemente se realizaron imágenes tridimensionales (3D) de los linfáticos de la columna vertebral que preservan la anatomía general de las muestras vertebrales y espinales etiquetadas, incluyendo huesos, músculos, ligamentos, así como tejidos viscerales vecinos,14. El protocolo iDISCO+ 19,20 se utilizó para inmunoetiquetar preparaciones descalcificadas y despejadas de toda la columna vertebral con anticuerpos linfáticos específicos contra el receptor de membrana LYVE121 o el factor de transcripción PROX122. La adquisición y el análisis de imágenes se llevaron a cabo con la microscopía de fluorescencia de láminas de luz (LSFM) y el software Imaris. LSFM permite imágenes 3D rápidas y mínimamente invasivas de muestras grandes por confinamiento axial de iluminación, lo que resulta en una reducción del fotoblancarte y fototoxicidad23.

El enfoque iDISCO+/LSFM permite caracterizar las distintas capas de vasos linfáticos durales y epidurales, y la conexión de esta vasculatura con los circuitos linfáticos extravertebrales y los LN vecinos de la columna vertebral. El protocolo se aplicó a los tejidos previamente inyectados con trazadores fluorescentes para demostrar el drenaje del canal vertebral. El presente documento proporciona detalles sobre la metodología iDISCO+/LSFM para tomar imágenes de la vasculatura linfática vertebral e ilustra su relevancia para la investigación del líquido cefalico y el drenaje de fluidos epidurales.

Protocolo

Todos los procedimientos in vivo utilizados en este estudio cumplieron con todas las normativas éticas pertinentes para el ensayo animal y la investigación, de acuerdo con las directrices experimentales de uso animal de la Comunidad Europea (L358-86/609EEC). El estudio recibió la aprobación ética por parte del Comité ético del INSERM (n.o 201611011126651) y del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del ICM (Institut du Cerveau et de la Moelle épiniére).

1. Preparación

  1. Prepare las siguientes herramientas de disección para la cirugía: bisturí (1), microaplicaciones (2), fórceps (1), tijeras de disección y clips de sutura Michel. Prepare agujas de 26 G (0,45 mm x 13 mm), jeringa de 1 ml y microjeringa de 10 l.
  2. Tire de las microcapillarias con un protocolo de un solo paso a 67,5 oC con un tirador de micropipeta de vidrio. Preparar dos microcapillarios por inyección.
  3. Preparar reactivos para la toma de imágenes de drenaje linfático (Tabla 1): Ovalbumin Alexa Fluor 555 conjugado (OVA-A555, 2 mg/ml en solución salina tamponada de 1 fosfato [PBS]) y anticuerpo anti-LYVE1 (1 mg/ml en 1x PBS).
  4. Preparar anticuerpos (Tabla 1) para iDISCO+. Para los anticuerpos primarios, utilice anticuerpos policlonales de conejo anti-LYVE1 (1:1,600) y anticuerpos IgG policlonales de cabra anti-PROX1 (1:2.000). Para los anticuerpos secundarios, utilice Alexa Fluor burro anti-conejo-568, burro anti-conejo-647, y burro anti-cabra-647 (1:2,000).

2. Procedimientos de cirugía para inyecciones intra-cisterna magna (ICM) y toracolumbar (ThLb)

  1. Preparación del animal para la cirugía
    1. Utilice ratones adultos C57BL6/J machos, de 8 a 12 semanas de edad.
    2. Inyectar el ratón por vía intraperitoneal (IP) con 0,015 mg/ml de solución de buprenorfina diluida en cloruro sódico al 0,9% a 0,1 mg/kg, 15 min antes de la cirugía.
    3. Anesthetizar el ratón en una caja de inducción con 2-3% de gas isoflurano.
  2. Preparación de animales anestesiados para inyección de trazador
    1. Coloque el ratón anestesiado y su almohadilla calefactora en el aparato estereotaxico. Utilice barras de oído para sostener la cabeza del ratón, y dete el cuerpo en un ángulo de 135o a la cabeza o inmovilice la médula espinal a nivel vertebral de ThLb (Th12-L1) con un adaptador espinal. Pellizca la cola o la pata con el forcep para comprobar la eficiencia de la anestesia.
    2. Inyectar IP 200 l de cloruro sódico al 0,9% para la hidratación del ratón.
    3. Usando una cuchilla de bisturí, haz una incisión cutánea, ya sea en la región occipital hacia la región cervical para la inyección de ICM, o a nivel vertebral de ThLb (Th10-L3) para la inyección en el parénquima espinal de ThLb.
  3. Inyección de trazador
    1. Deseche los músculos paracervicales y paraspinales que cubren el cuello y la columna para visualizar la superficie de la dura mater, la capa más externa de las meninges.
    2. Punta cuidadosamente la zona central de la dura mater y el aracnoide de colocación inferior con una aguja de 26 G.
    3. Implantación microcapilar
      1. Corte 2 mm de la punta capilar de vidrio (ver paso 1.2) y, a continuación, utilice el microcapilar conectado a una cánula conectada a una jeringa de 10 l para aspirar 2 x 8 l del anticuerpo OVA-A555 o LYVE1.
      2. Introducir el microcapilar en la región medial del dura mater en un ángulo de 30o para las inyecciones de ICM o ángulo de 10o para las inyecciones de la columna vertebral thLb, y empujarlo a 1,5 mm por debajo de la dura mater.
        NOTA: El ligamento está perforado, pero no se realiza ninguna laminectomía.
      3. Agregue 10 l de pegamento quirúrgico para cerrar la incisión alrededor del capilar del vidrio y esperar a que se seque.
    4. Inyecte lentamente el trazador fluorescente a 1 l/min. Una vez entregado el volumen de inyección, mantenga el capilar en su lugar durante 1 min. Retirar el microcapilar y añadir pegamento quirúrgico para cerrar el orificio de inyección.
  4. Postinyección, cierre las incisiones de la piel con clips de sutura. Retire el ratón del aparato estereotaxico y colóquelo en una cámara de calentamiento postcirugía a 37 oC hasta que se recupere.

3. Perfusión y disección de tejidos

  1. A 15 minutos o 45 minutos después de la inyección del trazador de CSF, inyecte IP una dosis letal (100 l) de pentobarbital sódico. Pellizca la cola o la pata para verificar que no hay reflejo.
  2. Con tijeras de disección, corta la piel y abre la capa peritoneal desde la región inferior del abdomen hacia la jaula torácica. Abra la jaula torácica con tijeras para tener acceso al corazón.
  3. Inserte la aguja de 26 G en el ventrículo izquierdo del corazón y comience a perfundirse con 20 ml de paraformaldehído frío en frío (PFA) en 1x PBS a 2 ml/min. Utilice tijeras para cortar rápidamente la aurícula derecha y liberar el flujo de líquido de perfusión.
  4. Retira completamente la piel con fórceps y corta las cuatro patas con tijeras. Retire todos los órganos internos, pero tenga cuidado de preservar los LN intactos.
    NOTA: Los LN mandibulares son superficiales, así que tenga cuidado de no eliminarlos al cortar la piel. Los GN de cuello profundo (DCLN) se encuentran a cada lado de la tráquea, en contacto con la superficie lateral de las venas yugulares internas y cerca de los músculos esteremastoideos.
  5. Corte las costillas para extraer la columna vertebral con la médula espinal dentro del cuello uterino a los segmentos lumbares.
  6. Sumergir los tejidos diseccionados en un PFA frío en frío del 4% en 1 PBS en un tubo de 50 ml durante la noche (18 h) a 4 oC. Lavar los tejidos fijos 3x en 50 ml de 1x PBS durante 5 min.

4. Macroscopia de fluorescencia de un segmento vertebral

  1. Coloque la muestra bajo el microscopio estereozoo de fluorescencia con una cámara(Tabla de materiales). Tenga una visión general de la muestra o haga zoom en una región específica.

5. Preparación de muestras para inmunostaining de montaje entero

  1. Usando una cuchilla de microtoma, corte transversalmente la columna de cabeza y columna vertebral a nivel occipital y cervical.
    NOTA: Esta disección permite aislar la cabeza y la región vertebral cervical del resto de la columna vertebral.
  2. Con una hoja de microtomo, corte las regiones cervical, toracolumbar y sacra de la columna vertebral transversalmente en segmentos de 2 a 4 vértebras, de aproximadamente 0,5 cm de tamaño cada una.
  3. Aísle cada segmento en el orden en que se separó del eje vertebral, a lo largo de toda la longitud de las regiones cervical y torácica de la columna vertebral. Conservar cada muestra en un tubo de 2 ml 1x PBS.

6. iDISCO+ inmunosuchación de montaje completo de un segmento vertebral

NOTA: La descripción detallada del protocolo iDISCO+ es accesible en http://www.idisco.info.

  1. Día 1: Deshidratación de tejidos
    1. Deshidratar muestras de tejido vertebral (es decir, un segmento vertebral) por inmersión sucesiva en 20%, 40%, 60%, 80% y 100% metanol en 1x PBS durante 1 h con agitación.
    2. Incubar las muestras durante la noche en una solución de 33% de metanol/66% diclorometano (DCM) a temperatura ambiente (RT) con agitación.
  2. Día 2: Blanqueo de tejidos
    1. Lavar las muestras 2x con 100% de metanol durante 1 h en RT. Incubar las muestras en 5% H2O2 en metanol (30% H2O2 y metanol 1:5 v/v) a 4 oC durante la noche.
  3. Día 3: Paso de descalcificación y permeabilización
    1. Rehidratar las muestras gradualmente en 80%, 60%, 40%, 20% metanol, luego en 1x PBS (1 h en cada solución) en RT con agitación.
    2. Descalcificar las vértebras incubando muestras en la solución de Morse (10% citrato de trisódico y 45% ácido fórmico 1:1 v/v) durante 30 min en RT para preservar la estructura ósea.
    3. Enjuagar las muestras 2x con 1x PBS e incubar 2x durante 1 h en solución PTx2 (0,2% Tritón X-100 en 1x PBS, renovar para la segunda incubación) en RT con agitación. A continuación, incubar las muestras pretratadas en solución de permeabilización (PTx2 con 20% de sulfóxido de dimetil [DMSO] y 2,3% p/v glicina) a 37 oC durante 24 h.
  4. Día 4: Paso de bloqueo
    1. Incubar muestras en solución de bloqueo (PTx2 con 6% de suero de burro y 10% DMSO) a 37oC durante 24 h.
  5. Días 5-16: Inmunoetiquetado de montaje completo
    1. Incubar muestras en anticuerpos primarios diluidos en PTwH (1x PBS que contiene 0,2% de Tween-20 y 0,1% de heparina a 10 mg/ml en 1x PBS) con 5% de SUero de burro DMSO/3% a 37oC durante 6 días. Lavar muestras de 4x5x en PTwH en RT con agitación durante la noche.
    2. Incubar muestras en diluciones de anticuerpos secundarios en PTwH con un 3% de suero de burro a 37oC durante 4 días. Lave las muestras en PTwH 4x5x a RT bajo agitación durante la noche antes de despejar.
  6. Días 17 y 18: iDISCO+ aclaración de tejido
    1. Deshidratar las muestras gradualmente por inmersión sucesiva en 1x PBS, luego 20%, 40%, 60%, 80% y 2x en 100% metanol (1 h en cada solución). Incubar cada muestra durante la noche en una solución de 33% de metanol/66% DCM.
    2. Lavar 2x en 100% DCM durante 15 min para eliminar el metanol. Incubar en éter de dibenzilo (DBE) sin agitar hasta que se despeje (4 h) y luego almacenar en DBE en RT antes de tomar imágenes.

7. Imágenes LSFM

  1. Muestras borradas de imagen en un plano transversal con el LSFM equipado con un objetivo 4x/0.3.
    1. Utilice una configuración de iluminación de tres hojas de un solo lado, posición x fija (sin enfoque dinámico). Utilice láseres LED sintonizados a 561 nm, 100 mW; y 639 nm, 70 mW. Establezca la apertura numérica de la hoja de luz en 30%.
    2. Utilice diferentes filtros de emisión: 595/40 para Alexa Fluor-568 o -555, y -680/30 para Alexa Fluor-647.
  2. Llene la cámara del microscopio con DBE.
  3. Pilas de aqui con pasos de 2,5 m z y un tiempo de exposición de 30 ms por paso con la cámara (Tabla de materiales). Utilice el zoom óptico x2 para obtener un aumento efectivo de (x8), 0,8 m/píxel, y realice las adquisiciones de mosaico con una superposición del 10% en el fotograma completo.
  4. Adquiera imágenes en formato .tif con el software de adquisición y conviértalas en formato 3D con un software de conversión de archivos.
  5. Reconstruir la adquisición de mosaicos con software de puntada (Tabla de materiales). Abra las imágenes y muévase manualmente para reconstituir toda la imagen de mosaico, utilizando la superposición del 10% entre las imágenes como guía.
  6. Utilice el software 3D ( Tabla de materiales ) para generar proyecciones ortogonales de datos, como se muestra en la Figura 1, Figura 2, Figura 3y Figura 4, y agregue un atributodecódigo de color a los vasos linfáticos y las otras estructuras anatómicas que se muestran. Establezca una corrección gamma de 1,47 a los datos sin procesar obtenidos de la LSFM de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Resultados

Imágenes 3D de la vasculatura linfática vertebral
La Figura 1 presenta los pasos del procedimiento iDISCO+/LSFM y una imagen LSFM de circuitos linfáticos dentro del canal vertebral de las vértebras ThLb tratadas con iDISCO+. La combinación de iDISCO+ con LSFM conservó la anatomía vertebral y capturó una visión de la red vascular linfática (es decir, los vasos intravertebrales conectados con los vasos extravertebrales que salen dorsal y lateralmente del cuerpo vertebral) dentro de los huesos circundantes, ligamentos, músculos y ganglios nerviosos.

Imágenes de macroscopia de fluorescencia de drenaje dcLN
Para visualizar el drenaje macromolécula en el sistema linfático asociado al SNC, los marcadores macromoleculares se administraron in vivo mediante inyección en el CSF o en el parénquima espinal. Un trazador macromolecular se puede entregar fácilmente en el CSF en la cisterna magna. La cisterna magna se encuentra entre el cerebelo y la superficie dorsal de la médula oblongata, por encima del foramen magnum. El marcador macromolecular también se puede inyectar en el parénquima espinal mediante cirugía estereotáctica a diferentes niveles a lo largo de la columna vertebral.

Los marcadores macromoleculares utilizados fueron etiquetados directamente con un fluoróforo o detectados postmortem por inmunohistoquímica con anticuerpos específicos. La Figura 2A ilustra el plan experimental para el seguimiento de OVA-A555,un trazador de peso molecular rojo fluorescente y pequeño (alrededor de 45 kDa), que se inyectó en el CSF (Figura 2B) o en la región thlb de la médula espinal (Figura 2C).

A los 45 minutos después de la inyección del trazador macromolecular, los ratones fueron sacrificados, perfundidos con 4% de PFA, y procesados para aislar segmentos diseccionados de la región del tronco cerebral de la cabeza y la columna vertebral que fueron descalcificados y clarificados. El drenaje de la macromolécula se evaluó fácilmente mediante imágenes de macroscopia de fluorescencia de los LN que recogen el líquido cefaturable y los fluidos epidurales. Como se muestra en la Figura 2, la inyección OVA-A555 en la región CSF (Figura 2B) o ThLb (Figura 2C) de la médula espinal dio lugar a la acumulación de OVA-A555 en los dcLN a 45 min después de la inyección. Esta observación indica la captación y el drenaje del trazador fluorescente por el sistema linfático; es un requisito previo antes de continuar con el procedimiento iDISCO+/LSFM para tomar imágenes del drenaje linfático vertebral.

Imágenes 3D del drenaje macromolécula en el sistema linfático vertebral
Sobre la base de la detección del etiquetado OVA-A555 en dcLNs, el procedimiento iDISCO+/LSFM podría aplicarse a muestras vertebrales descalcificadas y preclearadas aisladas de ratones inyectados OVA-A555. Este enfoque permitió la creación de un mapa 3D del drenaje linfático del líquido cefalorraquídeo y el líquido epidural espinal en un momento específico después de la inyección del marcador. Este mapeo 3D podría realizarse mediante imágenes de segmentos sucesivos del SNC, en cada nivel de columna vertebral, desde el punto de inyección.

La Figura 3A muestra el diseño experimental para la inyección OVA-A555 en el parénquima espinal ThLb y el patrón 3D resultante de la distribución OVA-A555 en un segmento cervical y un segmento vertebral torácico, junto con la vasculatura linfática. A 45 min después de la inyección OVA-A555, se detectó la acumulación de OVA-A555 en los tejidos de la médula espinal y dcLN (flechas blancas en la Figura 3B),de acuerdo con las observaciones del microscopio ilustradas en la Figura 2. No se detectó, sin embargo, en la vasculatura linfática cervical y torácica etiquetada con anticuerpos anti-LYVE1. La ausencia de marcador inyectado por LEC en los vasos linfáticos vertebrales puede deberse a un corto tiempo de persistencia del trazador dentro de los vasos linfáticos o a la falta de absorción del marcador por parte de los vasos linfáticos (Figura 3C).

Para probar la primera hipótesis, el anticuerpo anti-LYVE1 del conejo se utilizó como etiqueta de células endoteliales linfáticas para unir los vasos linfáticos asociados al SNC. El anticuerpo anti-LYVE1 de conejo inyectado fue detectado posteriormente por inmunohistoquímica con un anticuerpo secundario anti-conejo, mientras que las células endoteliales linfáticas fueron inmunoeticionadas con anticuerpos anti-PROX1. La Figura 4 representa el diseño experimental de la inyección anti-LYVE1 en el parénquima espinal ThLb (Figura 4A), y el patrón de distribución 3D resultante de los anticuerpos LYVE1 en un segmento de ThLb cerca del lugar de inyección, con respecto a PROX1+ linfáticos (Figura 4B). Tanto los linfáticos vertebrales como sus conexiones linfáticas extravertebales fueron etiquetados por anticuerpos anti-LYVE1 inyectados, que corroboraron la absorción del marcador por los vasos linfáticos vertebrales y el drenaje linfático hacia el sistema linfático extravertebral. Los LN carecían en la región thLb y, por lo tanto, no se podían visualizar en el segmento de imagen. Además, el patrón discontinuo del marcador LYVE1 observado a lo largo de los vasos linfáticos probablemente reflejaba la expresión discontinua de LYVE1 en la vasculatura linfática, como se informó en estudios anteriores14,,21. En conjunto, los resultados del presente estudio demostraron que, a los 45 minutos después de la inyección del trazador, el anticuerpo LYVE1, pero no el OVA-A555,permitió la detección de la absorción linfática vertebral local y era preferible a OVA-A555 como marcador persistente de drenaje linfático vertebral local.

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Figura 1: Vista tridimensional de la vasculatura linfática vertebral. (A) Representación esquemática del protocolo. (B) Proyección plana de una vista 3D de la vasculatura linfática vertebral ThLb desde una perspectiva dorsofrontal. Los vasos linfáticos fueron inmunoetiquetados con el anticuerpo anti-PROX1 (verde) utilizando el protocolo iDISCO+ y luego fueron imagenados por LSFM. Observe el patrón metamérico de la vasculatura dentro del canal vertebral de tres vértebras sucesivas (puntas de flecha blancas). Además de los vasos dorsales semicirculares (puntas de flecha blancas), cada red vertebral incluía ramas ventrales (flechas amarillas), vías bilaterales de salida laterales a lo largo del rami espinal y los ganglios (flechas blancas), así como una ruta de salida dorsal en la línea media (flecha doble blanca). Las redes vertebrales estaban interconectadas con un recipiente longitudinal (flechas púrpuras). Para obtener una descripción completa, véase Jacob L. et al.18 SC - médula espinal; Asterisco - cuerpo vertebral ventral; D - dorsal; L - lateral; V - ventral; Barras de escala a 300 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: dcLNs recogidos OVA-A555-etiquetados líquidos CSF. (A) Esquema del diseño experimental. OVA-A555 se inyectó en el ICM o en el parénquima espinal thLb, luego los ratones fueron sacrificados 45 minutos después de la inyección. Las muestras fueron limpiadas y observadas por imágenes de macoscopio de fluorescencia (B,C). Imágenes del macoscopio de fluorescencia de vértebras cervivales de ratones inyectados ICM- (B) y ThLb- (C). Tenga en cuenta que OVA-A555 acumulado en los dcLN(B,C, puntas de flecha blancas), los espacios pial y paravasculares de la médula espinal cervical (B,C) y después de la inyección de ICM, en rutas de salida ventrolaterales, probablemente a lo largo de los nervios cervicales (B, flechas blancas). SC - médula espinal. Asterisco - cuerpo vertebral ventral; D - dorsal; L - lateral; V - ventral; Escalar barras en B y C a 2 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Detección de fluidos de líquidos de líquidos cefablicos OVA-A555-etiquetados en el sistema linfático vertebral. (A) Esquema del diseño experimental. OVA-A555 se inyectó en el parénquima espinal thlb, luego los ratones fueron sacrificados a 45 minutos después de la inyección. Las muestras fueron tratadas con el protocolo iDISCO+ y se fueron imagen con un LSFM. (B,C) Proyecciones planas de vistas 3D frontales capturadas por LSFM de segmentos cervicales (B) y torácicos (C). Se detectó acumulación OVA-A555 (rojo) en tejidos de la médula espinal y dcLN(B,flecha blanca), como se ilustra en la Figura 2,pero no en la vasculatura vasculatica cervical y torácica inmunoetiqueda aquí con anticuerpos anti-LYVE1 (verde). SC - médula espinal; Asterisco - cuerpo vertebral ventral; D - dorsal; L - lateral; V - ventral; Barras de escala á 1 mm(B),300 m(C). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Detección de drenaje linfático vertebral después de la inyección intraestacional de anticuerpos anti-LYVE1. (A) Esquema del diseño experimental. Se inyectaron anticuerpos anti-LYVE1 en el parénquima espinal de ThLb, luego los ratones fueron sacrificados 45 minutos después de la inyección. Las muestras fueron tratadas con el protocolo iDISCO+ y se fueron imagen con un LSFM. (B). Proyecciones planas de vistas 3D frontales de un segmento de columna vertebral ThLb (B), capturadas con un LSFM. Se detectaron anticuerpos anti-LYVE1 con anticuerpos anti-conejo (púrpura) y la vasculatura linfática con anticuerpos anti-PROX1 (verde). Los vasos blancos son PROX1+ linfáticos colabeled con anticuerpos anti-LYVE1 (B); estos incluyen linfáticas vertebrales (flechas amarillas) y extravertebrales (flechas amarillas dobles). SC - médula espinal; Asterisco - cuerpo vertebral ventral; D - dorsal; L - lateral; V - ventral; Barras de escala a 300 m (B). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

ReactivosObjetivoFiguraPaso de protocoloComentario
OVA-A555 Trazador de CSFFigura 2 y Figura 32. Inyección ICM o ThLb
7. Imágenes LSFM.		Soluble en agua, fácil de inyectar y fluorescencia intensa alta
Anticuerpo anti-Lyve1Marcador de membrana de las células de LVsFigura 36. iDISCO+ montaje completo inmmnunostaining.
7. Imágenes LSFM.		Anticuerpo eficiente para la inminunostaining de montaje completo
Drenaje trazador de los LV dural y epiduralFigura 42. Inyección ICM o ThLb
6. iDISCO+ montaje completo inmmnunostaining
7. Imágenes LSFM
Anticuerpo anti-Prox1Marcador nuclear de células de LVsFigura 1 y Figura 46. iDISCO+ montaje completo inmmnunostaining
7. Imágenes LSFM		Anticuerpo eficiente para la inminunostaining de montaje completo

Tabla 1: Anticuerpos y trazadores utilizados en el estudio.

ProblemaPosible razónSolución
Cirugía para inyección de trazadorLesión de tejido del SNC no deseada1. Falta de control de la inserción capilar de vidrio
2. Profundidad incorrecta de la inserción capilar de vidrio		1. Punctate con cuidado, pero completamente, la dura mater con una aguja de 26 G antes de la inserción capilar de vidrio.
2. Reduzca la profundidad de la inserción capilar de vidrio (<1,5 mm desde la dura mater).
3. Reduzca el diámetro capilar del vidrio.
Profanación no deseada del trazador inyectado en los espacios epidurales o extra vertebralesInyección incorrecta del trazador1. Compruebe si el micro capilar de vidrio se ha insertado bien en el punctado dura mater.
2. Agregue pegamento quirúrgico entre el microcapilar de vidrio y el tejido rodeado antes de inyectar el marcador.
Volumen excesivo de trazador inyectadoReduzca el volumen del trazador inyectado (<2 l).
inmunostaining iDISCO+Ausencia, heterogeneidad o antecedentes excesivos de etiquetado en el tejido1. Problemas con la concentración del anticuerpo primario
2. Permeabilización insuficiente
3. Lavado insuficiente
4. Limpieza insuficiente		Aumentar el número y/o el tiempo de los pasos de incubación: permebilización, silbido, anticuerpo primario y limpieza. Consulte http://www.idisco.info (FAQ Y TROUBLESHOOTING).
Descalcificación insuficienteUtilice un tratamiento de descalcificación más estricto de la muestra con EDTA21 o solución Morse especialmente para los tejidos de la cabeza.
iDISCO+ claroLas muestras son opacas o de color marrónBlanqueo insuficienteUtilice la solución H2O2 fresca, aumente el volumen y/o el tiempo de incubación.
Presencia de oxidaciónLlene el tubo por completo para evitar la presencia de aire.
Limpieza insuficienteAumentar el volumen y/o el tiempo de incubación. Consulte http://www.idisco.info (FAQ Y TROUBLESHOOTING).
Detección de trazadorRastreador indetectableCombinación incorrecta del trazador seleccionadoLos fluorocromos Alexa 555, 594 y 647 son resistentes al protocolo iDISCO+5,6,7,8,9,10. Sin embargo, este no es el caso de los fluorocromos FITC, GFP, RFP.
Sacrificar punto de tiempo después de la inyecciónPrefiere OVA-A555 para análisis de drenaje a corto plazo (15 min) en linfóticos vertebrales locales. Para el análisis de drenaje de los ganglios linfáticos, el anticuerpo OVA-A555 y Lyve1 se puede utilizar para análisis a largo plazo (>45 min).
Imágenes: captura y análisisLas imágenes capturadas del circuito linfático no son satisfactoriasProblema de disección (faltan ganglios linfáticos)Incluya cuidadosamente los tejidos vecinos del cráneo/vertebral en la muestra diseccionada, de acuerdo con el circuito linfático que desea obtener una imagen.
Problema de imagen1. Modificar los parámetros de adquisición de la LSFM: intensidad láser, apertura numérica de la hoja de luz, espesor de la hoja de luz, tiempo de exposición.
2. Coloque la muestra en el soporte para reducir el camino recorrido por la luz a través del tejido hasta el objetivo.
3. Asegúrese de que no haya burbujas dentro de la muestra de tejido durante la adquisición.

Tabla 2: Consejos de solución de problemas para cada paso del protocolo, incluidos los posibles problemas y soluciones.

Discusión

El protocolo iDISCO+/LSFM proporciona vistas 3D sin precedentes de la red linfática asociada al SNC dentro de sus tejidos circundantes a nivel de resolución celular. Este protocolo está bien adaptado a muestras de tamaño medio, sin ejercar 1,5 cm3,debido a las limitaciones del sistema óptico LSFM, la distancia de trabajo reducida, y el gran tamaño de las lentes objetivos comerciales para microscopía de alta resolución23. Esta limitación evita la captura de todo el sistema linfático asociado al cerebro. Es importante señalar que el área de investigación tiene que estar delimitada con cautela y los tejidos que rodean el SNC deben ser cuidadosamente diseccionados para incluir los vasos linfáticos y LN de extracción que contribuyen a todo el circuito linfático (Tabla 2).

Además de las consideraciones de tamaño y anatómicas, la complejidad de los tejidos mesenquimales circundantes varía a lo largo del cráneo y la columna vertebral, lo que requiere la adaptación del tratamiento de descalcificación y preclearización con el fin de obtener una clarificación homogénea de la muestra y permitir la propagación del haz de luz dentro de un tejido biológico isotrópico blando. En ausencia de huesos, la imagen LFSM del cerebro o de los tejidos de la médula espinal no requiere el paso de descalcificación, y la resolución final de las imágenes capturadas es óptima19. El protocolo descrito anteriormente, que incluye un paso de descalcificación leve con la solución de Morse, está bien adaptado para la imagen LSFM de la columna vertebral como se ilustra en la Figura 1 y la Figura 4. Por el contrario, la región del cuello muestra una anatomía ósea particularmente compleja además de múltiples capas de músculos, grasa y tejidos glandulares, que reducen la calidad de las imágenes LSFM capturadas, como se refleja en la Figura 3B. Por lo tanto, las imágenes LSFM del cuello y la zona cervical pueden mejorarse mediante un tratamiento más estricto de los tejidos; por ejemplo, con EDTA, como se había informado anteriormente24. Por lo tanto, el paso de descalcificación es crítico y las condiciones de descalcificación deben probarse previamente para cada anticuerpo utilizado antes de iniciar el protocolo iDISCO+ completo(Tabla 2).

Mientras que el protocolo iDISCO+/LSFM permite la generación de una vista 3D de circuitos de conexión entre los espacios meningeales y epidurales y los LN asociados, el análisis cuantitativo directo de la vasculatura linfática a partir de imágenes capturadas por LSFM no es factible por las siguientes razones: 1) la delineación de los circuitos de los vasos linfáticos no es fiable debido al patrón discontinuo de expresión de marcadores linfáticos, porque membranar LYVE1 se distribuye aquí de forma respetuosa21 y PROX1 tiene un patrón de expresión nuclear22; 2) la penetración heterogénea de anticuerpos, así como la anisotropía que puede persistir en el tejido biológico debido a la descalcificación y preclearing incompletos y heterogéneos. Por lo tanto, las imágenes LSFM deben ser ampliadas por herramientas de realidad virtual que permitan la visualización interactiva y faciliten así la cuantificación de la vasculatura linfática (www.syglass.io). También cabe destacar que la descripción precisa del circuito asociado al CNS requiere respaldar la información LSFM con datos confocales de alta resolución obtenidos por inmunoetiquetado convencional en criostato delgado (5-10 m) o secciones de tejido incrustado en parafina, especialmente para localizar con precisión la posición de los vasos linfáticos con respecto a la dura mater y el CSF, como se informó anteriormente11,14,18.

El protocolo iDISCO+/LSFM permite la visualización tridimensional del drenaje macromolecular en el sistema linfático asociado al SNC, como se ilustra en la Figura 3 y la Figura 4. Sin embargo, la evaluación funcional del drenaje linfático requiere, además de las recomendaciones sobre el protocolo iDISCO+/LSFM detalladas anteriormente, siguiendo un procedimiento riguroso, ya que el resultado final depende de la calidad de la cirugía de inyección, la elección del lugar de entrega, el tipo y el volumen inyectado del marcador de macromolécula utilizado, y el tiempo de sacrificio después de la administración del trazador (Tabla 2). Debido a las variaciones del patrón trazador entre los animales inyectados, la caracterización de los circuitos de drenaje linfático requiere grandes grupos experimentales (>10 por condición de inyección). En el protocolo presentado, 1) la dura mater debe ser perforada antes de la inyección para prevenir lesiones no deseadas y penetración en los tejidos del SNC; 2) el volumen inyectado debe ser inferior a 2 l para limitar la difusión no deseada a través del orificio de inyección, a lo largo del capilar de inyección, en el espacio epidural o tejidos extravertebrales; 3) la profundidad de la inserción capilar de inyección debe limitarse a 2 mm por debajo de la dura mater para evitar lesiones del SNC o colisiones erróneas en ICM e inyecciones intraespinales, respectivamente. Tenga en cuenta también que es necesario realizar un análisis confocal complementario de alta resolución de los segmentos vertebrales vecinos, como se indicó anteriormente, para evaluar la presencia de marcador inyectado dentro de los vasos linfáticos. Este análisis requiere establecer las gráficas de perfil de intensidad para el marcador y el marcador linfático en secciones transversales de los vasos linfáticos etiquetados con marcadores. Este enfoque se ha utilizado previamente para demostrar la absorción de OVA555 por linfática de ThLb a 15 minutos después de la inyección (Figura complementaria 5F en Jacob et al.14). Sin embargo, no se ha ilustrado para el trazador anti-LYVE1 en el presente estudio (Figura 4).

Entre los posibles trazadores CSF, OVA-A555 es una excelente opción, ya que es resistente a los tratamientos de protocolo iDISCO+ y mantiene una alta fluorescencia para la toma de imágenes LSFM. No obstante, tenga en cuenta que el tipo de trazador debe elegirse de acuerdo con el punto de tiempo de análisis (Tabla 1 y Tabla 2). Como se ha indicado anteriormente, el etiquetado OVA-A555 de los vasos linfáticos vertebrales locales se observa a los 15 minutos después de la inyección14. Sin embargo, OVA-A555 ya no se detecta en estos circuitos linfáticos locales a 45 min después de la inyección (Figura 3) en contraste con el anticuerpo anti-LYVE1 (Figura 4).

Para concluir, el protocolo iDISCO+/LSFM está bien adaptado para investigar la estructura 3D y el drenaje del sistema linfático asociado al SNC en condiciones fisiológicas y patológicas como el SNC y los cánceres de columna vertebral, o enfermedades óseas y articulares. Aunque el procedimiento completo es largo y requiere rigor metodológico, proporciona información valiosa y única cuando se utiliza con análisis complementarios utilizando herramientas de realidad virtual e imágenes confocales de alta resolución.

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por el Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale, Agence Nationale Recherche (ANR-17-CE14-0005-03), Federation pour la Recherche sur le Cerveau (FRC 2017), Carnot Maturation (a L.J.), Universidade Federal de Rio de Janiero (UFRJ para J.B.), NIH (R01EB016629-01) y la Escuela Yale de Medicina. Reconocemos las plataformas ICM: ICM-QUANT para imágenes celulares e histomica ICM para inmunohistoquímica. Todo el trabajo animal se llevó a cabo en las instalaciones de PHENO-ICMice. El Núcleo cuenta con el apoyo de 2 "Investissements d'avenir" (ANR-10- IAIHU-06 y ANR-11-INBS-0011-NeurATRIS) y la "Fondation pour la Recherche Médicale". Reconocemos a Nicolas Renier por consejos metodológicos y lectura de manuscritos.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
ConsumiblesTubos de
centrífuga
: 15 mlFalcon352096
Tubos de centrífuga cónicos: 50 mlMicrotomo Falcon352070
hoja 80mmMicrom Microtech FranceF/MM35P
Agujas 26G (0.45x13 mm)TerumoAN*2613R1
Jeringa 1mlTerumoSS+01H1
Microscopios y softwares de imagen
AxioZoom.V16 microscopio estereoscópico con zoom fluorescente, equipado con una cámara digital sCMOS ORCA-Flash 4.0 (Hamamatsu Photonics) o un Cámara OptiMOS sCMOSZeiss
Imspector Software de control de microscopio, Versión v144 (software de adquisición)Abberior instruments
Imaris File Converter x64 9.2.0 (software de conversión de archivos) , Imaris stitcher software 9.2.0 (software de costura), Imaris x64 9.2.0 (software 3D)OXFORD instruments
Láseres LED (OBIS) LVBT Módulo láser 2ª generación COHERENTE
Ultramicroscopio II equipado con una cámara sCMOS (Andor Neo) y un 4  y tiempos;  /0.3 lente de objetivo (LVMI-Fluor WD6)LaVision Biotec
Reagents
Alexa Fluor 568 Burro anti ConejoThermo FisherA10042
Alexa Fluor 647 Burro anti cabraJackson ImmunoResearch705-605-147
Alexa Fluor 647 Burro anti ConejoJackson ImmunoResearch711-605-152
Anticuerpo policlonal Anti-LYVE1Angiobio#11-034
Anticuerpo policlonal IgG anti-PROX1 de cabraR& D systems#AF2727
Ampollas inyectables de buprenorfina (solución de Buprecare, 0,3 mg/ml)AmpollaAnimalcare1ml
Éter dibencilo 100% (DBE)Sigma Aldrich108014
Diclorometano 100% (DCM)Sigma Aldrich270997
Ácido fórmico 99%CARLO ERBA405793
GlicinaSigma AldrichG.7126
Sal sódica de heparina porcinaSigma AldrichH4784
Solución de peróxido de hidrógeno (H2O2 30%)Sigma AldrichH1009
Isoflurano (Iso-Vet 100%)PiramalNDC 66794-013-10
Metanol 100%Sigma Aldrich322415
Ovoalbúmina Alexa Fluor 555 Convitrogen Conjugado11549176
Solución tampón de fosfato PBS (solución madre 10X)EuromedexET330-A
Pentobarbital sódico (Euthasol 400 mg/mL)Dechra08718469445110
Citrato trisódicoVWR6132-04-3
Herramientas y equipos quirúrgicos
Sistema de anestesiaUniventorUniventor 410 Unidad
Extractor de micropipetas de vidrioNarishigePC-10
Almohadilla térmicaCMA Microdiálisis ABCMA 450 Controlador
Microcapilares (Capilares de vidrio)Harvard ApparatusGC120-15
Micropinzas, fórceps, tijeras de disección y pinzas de sutura Michel (7.5  y tiempos;   1,75 mm)Fine Science Tool12040-01
Bisturí (bisturí desechable estéril 23)Swann-Norton0510
Aparato estereotáxicoKOPFModelo 940
Jeringa Hamilton 10µ l 701NHamilton28618-U
Sistema de aire calienteVet-Tech LTDHE011
centrífuga: 0,2 ml Tubos de Eppendorf 30124359: 2 ml Tubos de centrífuga cónicos Eppendorf 30120094de anestesiade temperatura

Referencias

  1. Plog, B. A., Nedergaard, M. The Glymphatic System in Central Nervous System Health and Disease: Past, Present, and Future. Annual Review of Pathology. 13, 379-394 (2018).
  2. Iliff, J. J., Goldman, S. A., Nedergaard, M. Implications of the discovery of brain lymphatic pathways. The Lancet Neurology. 14 (10), 977(2015).
  3. Engelhardt, B., et al. Vascular, glial, and lymphatic immune gateways of the central nervous system. Acta Neuropathologica. 132, 317-338 (2016).
  4. Benveniste, H., et al. The Glymphatic System and Waste Clearance with Brain Aging: A Review. Gerontology. , 1-14 (2018).
  5. Louveau, A., Da Mesquita, S., Kipnis, J. Lymphatics in Neurological Disorders: A Neuro-Lympho-Vascular Component of Multiple Sclerosis and Alzheimer's Disease. Neuron. 91 (5), 957-973 (2016).
  6. Ma, Q., Ineichen, B. V., Detmar, M., Proulx, S. T. Outflow of cerebrospinal fluid is predominantly through lymphatic vessels and is reduced in aged mice. Nature Communications. 8 (1), 1434(2017).
  7. Ma, Q., Decker, Y., Müller, A., Ineichen, B. V., Proulx, S. T. Clearance of cerebrospinal fluid from the sacral spine through lymphatic vessels. The Journal of Experimental Medicine. 216 (11), 2492-2502 (2019).
  8. Louveau, A., et al. Understanding the functions and relationships of the glymphatic system and meningeal lymphatics. The Journal of Clinical Investigation. 127 (9), 3210-3219 (2017).
  9. Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).
  10. Aspelund, A., et al. A dural lymphatic vascular system that drains brain interstitial fluid and macromolecules. The Journal of Experimental Medicine. 212 (7), 991-999 (2015).
  11. Antila, S., et al. Development and plasticity of meningeal lymphatic vessels. The Journal of Experimental Medicine. 214 (12), 3645-3667 (2017).
  12. Ahn, J. H., et al. Meningeal lymphatic vessels at the skull base drain cerebrospinal fluid. Nature. 572 (7767), 62-66 (2019).
  13. Pollay, M. The function and structure of the cerebrospinal fluid outflow system. Cerebrospinal Fluid Research. 7, 9(2010).
  14. Jacob, L., et al. Anatomy and function of the vertebral column lymphatic network in mice. Nature Communications. 10 (1), 1-16 (2019).
  15. Louveau, A., et al. CNS lymphatic drainage and neuroinflammation are regulated by meningeal lymphatic vasculature. Nature Neuroscience. 21 (10), 1380-1391 (2018).
  16. Da Mesquita, S., et al. Functional aspects of meningeal lymphatics in ageing and Alzheimer's disease. Nature. 560 (7717), 185-191 (2018).
  17. Song, E., et al. VEGF-C-driven lymphatic drainage enables immunosurveillance of brain tumours. Nature. 577 (7792), 689-694 (2020).
  18. Absinta, M., et al. Human and nonhuman primate meninges harbor lymphatic vessels that can be visualized noninvasively by MRI. eLife. 6, 29738(2017).
  19. Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
  20. Renier, N., et al. Mapping of Brain Activity by Automated Volume Analysis of Immediate Early Genes. Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).
  21. Jackson, D. G., Prevo, R., Clasper, S., Banerji, S. LYVE-1, the lymphatic system and tumor lymphangiogenesis. Trends in Immunology. 22 (6), 317-321 (2001).
  22. Wigle, J. T., Oliver, G. Prox1 function is required for the development of the murine lymphatic system. Cell. 98 (6), 769-778 (1999).
  23. Olarte, O. E., Andilla, J., Gualda, E. J., Loza-Alvarez, P. Light-sheet microscopy: a tutorial. Advances in Optics and Photonics. 10 (1), 111-179 (2018).
  24. Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method. Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).

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