Aquí se informa un protocolo para la cuantificación de partículas virales infecciosas utilizando el monitoreo en tiempo real de la impedancia eléctrica de las células infectadas. Una aplicación práctica de este método se presenta mediante la cuantificación de la descomposición del virus de la influenza A bajo diferentes parámetros fisicoquímicos que imitan las condiciones ambientales.
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Artículo de método
Monitoreo de la supervivencia del virus de la influenza fuera del huésped mediante análisis celular en tiempo real
En este artículo
Resumen
Resumen
Los métodos para la cuantificación de partículas de virus representan un aspecto crítico de muchos estudios de virología. Aunque existen varias técnicas confiables, consumen mucho tiempo o no pueden detectar pequeñas variaciones. Aquí se presenta un protocolo para la cuantificación precisa del título viral mediante el análisis de las variaciones de impedancia eléctrica de las células infectadas en tiempo real. La impedancia celular se mide a través de biosensores de microelectrodos de oro ubicados debajo de las células en microplacas, en los que la magnitud depende del número de células, así como de su tamaño y forma. Este protocolo permite el análisis en tiempo real de la proliferación, viabilidad, morfología y migración celular con mayor sensibilidad. También se proporciona un ejemplo de una aplicación práctica mediante la cuantificación de la descomposición del virus de la influenza A (IAV) sometido a varios parámetros fisicoquímicos que afectan la infectividad viral a lo largo del tiempo (es decir, temperatura, salinidad y pH). Para tales aplicaciones, el protocolo reduce la carga de trabajo necesaria al tiempo que genera datos precisos de cuantificación de partículas de virus infecciosos. Permite la comparación de pendientes de inactivación entre diferentes IAV, lo que refleja su capacidad de persistir en un entorno determinado. Este protocolo es fácil de realizar, es altamente reproducible y se puede aplicar a cualquier virus que produzca efectos citopáticos en cultivo celular.
Introducción
La transmisión de un virus se basa en la combinación de varios factores. Para un virus secretado en el medio ambiente, su transmisión también depende de la capacidad de persistir en condiciones fuera del huésped. El estudio de la inactivación viral en general es, por lo tanto, un paso crucial para ayudar a las autoridades sanitarias nacionales y a los responsables políticos a implementar medidas de control y bioseguridad.
El conocimiento sobre la persistencia del virus en entornos naturales y de laboratorio ha aumentado considerablemente en la última década. En el caso de los virus de la influenza A (IAV), sus rutas de transmisión someten l....
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Protocolo
Maneje todos los virus de la influenza de acuerdo con los requisitos de nivel de bioseguridad apropiados (BSL-2 o superior, según el subtipo). Use cepas IAV con un historial de paso bajo (menos de 5 veces en células MDCK) para asegurar una baja variación entre experimentos.
1. Preparación de reactivos y materiales de partida
- Preparación de células MDCK y medio de cultivo celular estéril
- Cultivar células de riñón canino Madin-Darby (MDCK) en medio de Eagle modificado (MEM) suplementado con suero de ternero fetal inactivado al 10% de calor (FCS) y antibióticos (100 unidades / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina).....
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Resultados
Los datos brutos obtenidos después de 120 h con diferentes concentraciones de células MDCK, de 15.000 a 120.000 células por pozo, se muestran en la Figura 1. Después de 24 h, las medidas de IC muestran que las células en pozos sembrados con 30,000 células todavía estaban en la fase exponencial de crecimiento, y esta concentración celular se utilizó para experimentos adicionales. La Figura 2 ilustra la correlación lineal entre los valores de CIT50 y la.......
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Discusión
RTCA es una tecnología basada en la impedancia que se utiliza cada vez más para el monitoreo en tiempo real de las propiedades celulares, como la adherencia celular, la proliferación, la migración y la citotoxicidad. En este estudio, la capacidad de esta tecnología para evaluar la supervivencia del IAV fuera del huésped se demuestra midiendo la pendiente de inactivación del virus. Las técnicas fastidiosas como TCID50 y los ensayos de placa se sustituyen por una evaluación objetiva en tiempo real de la viabilid.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 0.25%Tripsina | ThermoFisher | 25200056 | |
| 75 cm2 matraz de cultivo | de tejidos Falcon | 430641U | |
| E-Plate 16 (6 placas) | ACEA Biosciences, Inc | 5469830001 | Las placas E están disponibles en diferentes envases |
| FCS | Life technologies (gibco) | 10270-106 | |
| MEM 1X | Life technologies (gibco) | 31095029 | |
| PBS 1X | Life technologies (gibco) | 14040091 | |
| Penicilina-Estreptomicina | Life technologies (gibco) | 11548876 | |
| TPCK-Tripsina | Worthington | LS003740 | |
| xCELLigence Real-Time Cell Analysis Instrument S16 | ACEA Biosciences, Inc | 380601310 | Los instrumentos xCELLigence RTCA S16 están disponibles en diferentes formatos (16 pocillos, 96 pocillos, placa simple o múltiple) |
Referencias
- Killingley, B., Nguyen-Van-Tam, J. Routes of influenza transmission. Influenza and Other Respiratory Viruses. 7, Suppl 2 42-51 (2013).
- Sooryanarain, H., Elankumaran, S. Environmental Role in Influenza Virus Outbreaks. Annual Review of Animal Biosciences. 3 (....
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Reimpresiones y permisos
