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Monitoreo de la supervivencia del virus de la influenza fuera del huésped mediante análisis celular en tiempo real

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DOI:

10.3791/61133

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20 de febrero de 2021

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1Department of Infection Biology, London School of Hygiene and Tropical Medicine, 2Institut Pasteur, Unité Environnement et Risques Infectieux, Cellule d'Intervention Biologique d'Urgence (CIBU), 3Cellule Pasteur, Université de Paris

En este artículo

Resumen

Aquí se informa un protocolo para la cuantificación de partículas virales infecciosas utilizando el monitoreo en tiempo real de la impedancia eléctrica de las células infectadas. Una aplicación práctica de este método se presenta mediante la cuantificación de la descomposición del virus de la influenza A bajo diferentes parámetros fisicoquímicos que imitan las condiciones ambientales.

Resumen

Los métodos para la cuantificación de partículas de virus representan un aspecto crítico de muchos estudios de virología. Aunque existen varias técnicas confiables, consumen mucho tiempo o no pueden detectar pequeñas variaciones. Aquí se presenta un protocolo para la cuantificación precisa del título viral mediante el análisis de las variaciones de impedancia eléctrica de las células infectadas en tiempo real. La impedancia celular se mide a través de biosensores de microelectrodos de oro ubicados debajo de las células en microplacas, en los que la magnitud depende del número de células, así como de su tamaño y forma. Este protocolo permite el análisis en tiempo real de la proliferación, viabilidad, morfología y migración celular con mayor sensibilidad. También se proporciona un ejemplo de una aplicación práctica mediante la cuantificación de la descomposición del virus de la influenza A (IAV) sometido a varios parámetros fisicoquímicos que afectan la infectividad viral a lo largo del tiempo (es decir, temperatura, salinidad y pH). Para tales aplicaciones, el protocolo reduce la carga de trabajo necesaria al tiempo que genera datos precisos de cuantificación de partículas de virus infecciosos. Permite la comparación de pendientes de inactivación entre diferentes IAV, lo que refleja su capacidad de persistir en un entorno determinado. Este protocolo es fácil de realizar, es altamente reproducible y se puede aplicar a cualquier virus que produzca efectos citopáticos en cultivo celular.

Introducción

La transmisión de un virus se basa en la combinación de varios factores. Para un virus secretado en el medio ambiente, su transmisión también depende de la capacidad de persistir en condiciones fuera del huésped. El estudio de la inactivación viral en general es, por lo tanto, un paso crucial para ayudar a las autoridades sanitarias nacionales y a los responsables políticos a implementar medidas de control y bioseguridad.

El conocimiento sobre la persistencia del virus en entornos naturales y de laboratorio ha aumentado considerablemente en la última década. En el caso de los virus de la influenza A (IAV), sus rutas de transmisión someten las partículas virales a una amplia gama de condiciones ambientales. Específicamente, pueden transmitirse a través de 1) vías fecal-orales a través del agua (es decir, virus aviares), o 2) contacto directo o indirecto por fómites contaminados, así como aerosoles y gotitas respiratorias (es decir, virus de aves de corral y mamíferos)1. En cualquier caso, los IAV se someten a diversos parámetros fisicoquímicos (es decir, pH, salinidad, temperatura y humedad), que afectan más o menos rápidamente a su infectividad2,3,4,5,6,7,8,9. Es de gran importancia, especialmente en lo que respecta a los virus zoonóticos y pandémicos, evaluar el potencial de los factores ambientales para afectar la dinámica del virus y los riesgos de exposición y transmisión entre especies.

Hasta ahora, las técnicas tradicionales de virología (es decir, la determinación del título viral a través de ensayos de placa o la estimación de la dosis infecciosa del cultivo de tejidos al 50%) se han utilizado para evaluar la infectividad de IAV a lo largo del tiempo; pero estas técnicas requieren mucho tiempo y requieren muchos suministros10,11,12. La medición de la impedancia de las células infectadas a lo largo del tiempo con microelectrodos sirve como una herramienta útil para monitorear la supervivencia de IAV en diferentes condiciones ambientales, así como la inactivación viral en general. Este método proporciona datos objetivos en tiempo real que reemplazan la observación humana subjetiva de los efectos citopáticos. Se puede utilizar para determinar la titulación del virus, reemplazando así las mediciones tradicionales con intervalos de confianza más bajos y evitando los ensayos de punto finales que requieren mucha mano de obra.

Existe una correlación lineal entre los resultados de titulación obtenidos mediante la medición de la impedancia celular y mediante el ensayo clásico de placa o los métodos TCID50. Por lo tanto, los datos obtenidos con el método de titulación basado en impedancia se pueden transformar fácilmente en valores TCID50 o pfu mediante la creación de una curva estándar con dilución en serie del virus13,14,15,16,17. La detección, cuantificación y eficacia de los anticuerpos neutralizantes presentes en muestras de suero también se puede lograr utilizando este enfoque experimental18,19. Más recientemente, se han utilizado ensayos celulares basados en impedancia para detectar y evaluar compuestos antivirales contra equid alfaherpesvirus20.

Esta tecnología se ha utilizado para evaluar la persistencia de IAV en agua salina a diferentes temperaturas y para identificar mutaciones en la hemaglutinina de IAV que aumentan o disminuyen la persistencia de IAV en el medio ambiente21. Dicha detección requeriría un trabajo extenso si se utilizan métodos tradicionales de titulación. Sin embargo, esta metodología se puede utilizar para cualquier virus que tenga un impacto en la morfología celular, el número de células y la fuerza de unión de la superficie celular. También se puede utilizar para controlar la persistencia en diversas condiciones ambientales (es decir, en el aire, en el agua o en superficies).

El protocolo descrito aquí aplica la supervivencia de IAV en el agua como ejemplo. Los virus de la influenza humana están expuestos a diferentes parámetros fisicoquímicos durante períodos prolongados. Se eligió el agua salina (35 g/L NaCl) a 35 °C como modelo ambiental basado en resultados anteriores9. La infectividad residual de los virus expuestos se cuantifica en diferentes puntos de tiempo a través de la infección celular. Las células MDCK, el tipo de célula de referencia para la amplificación de IAV, se siembran en placas de microtitulación de 16 pocillos recubiertas con sensores de microelectrodos e infectadas por virus expuestos 24 h después. La impedancia celular se mide cada 15 minutos y se expresa como una unidad arbitraria llamada índice celular (IC). Los efectos citopáticos inducidos por el virus de la gripe, cuya tasa de aparición depende directamente del número de partículas virales infecciosas inoculadas al cultivo celular, conduce a la disminución del IC, que posteriormente se cuantifica como el valor CIT50 . Este valor corresponde al tiempo necesario para medir una reducción del 50% desde el IC inicial (es decir, antes de la adición del virus). Los valores de CIT50 calculados para varios tiempos de exposición ambiental permiten deducir la pendiente de inactivación de un virus después de la regresión lineal de los valores de CIT50 .

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Protocolo

Maneje todos los virus de la influenza de acuerdo con los requisitos de nivel de bioseguridad apropiados (BSL-2 o superior, según el subtipo). Use cepas IAV con un historial de paso bajo (menos de 5 veces en células MDCK) para asegurar una baja variación entre experimentos.

1. Preparación de reactivos y materiales de partida

  1. Preparación de células MDCK y medio de cultivo celular estéril
    1. Cultivar células de riñón canino Madin-Darby (MDCK) en medio de Eagle modificado (MEM) suplementado con suero de ternero fetal inactivado al 10% de calor (FCS) y antibióticos (100 unidades / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina).
    2. Después de la descongelación, pase las células MDCK al menos 2 veces antes de infectarlas para garantizar una recuperación completa (pero menos de 30 pasajes para evitar cualquier deriva en los fenotipos celulares).
    3. Sembrar matraz(s) de cultivo tisular de 75 cm2 que contenga 30 mL de 1x MEM estéril con 7,5 x 106 células MDCK e incubar a 37 °C en incubadora humidificada al 5% de CO2 .
  2. Preparación de equipos de monitoreo de impedancia
    1. Coloque el instrumento en la incubadora a 35 °C y deje que se caliente durante al menos 2 h.
    2. Conéctelo a la unidad de control colocada fuera de la incubadora.
    3. Proceda a los procedimientos de limpieza según lo recomendado por el fabricante antes de comenzar el resto del experimento.
  3. Producción de existencias de IAV en células MDCK
    1. Para propagar y amplificar los virus H1N1, sembra 7,5 x 106 células MDCK en dos matraces de cultivo de tejidos de 75 cm2 e incubar durante 24 h a 37 °C para alcanzar una confluencia del 90%-100%.
    2. Decantar el medio de cultivo celular de la monocapa celular en matraces de 75 cm2 . Lave las células con 5 ml de PBS estéril 1x.
    3. Retire el PBS y agregue 5 ml de 1x PBS para lavar las células nuevamente.
    4. Etiquete un matraz como control y retire PBS antes de agregar 15 ml de medios de propagación del virus (1x MEM con 0% FCS) cuidadosamente en la monocapa. Incubar este matraz en una incubadora mantenida a 35 °C con un 5% de CO2. Úselo para la comparación después de 3 días de propagación.
    5. Descongele un vial de material de IAV en RT. Diluya el virus a la concentración adecuada en un tubo de 1,5 ml que contenga medios de propagación del virus (1x MEM con FCS al 0%).
    6. Retire 1x PBS del matraz de 75 cm2 e infecte las células MDCK a una multiplicidad de infección (MOI) de 1 x 10-3 o 1 x 10-4 unidades formadoras de placa por célula (pfu/célula) agregando 1 mL del virus diluido a la monocapa celular.
    7. Adsorber el virus a las células MDCK durante 45 minutos en RT agitando el matraz regularmente cada 15 minutos.
    8. Retire suavemente el inóculo y agregue 15 ml de medios de propagación del virus por matraz que contenga 1 μg/ml de TPCK-tripsina (tripsina/L-1-tosilamida-2-feniletil clorometil cetona), para escindir la hemaglutinina viral HA0 en subunidades HA1 y HA2 (un evento que se requiere para la fusión de HA con la membrana endosomal y la liberación del genoma viral)22.
    9. Incubar los matraces a 35 °C y 5% de CO2 durante al menos 3 días para replicar el virus.
    10. Observe las células MDCK bajo un microscopio a un aumento de 40x y busque efectos citopáticos (CPE) en las células (comparándolas con el matraz de control celular). Si el CPE no está completo (es decir, alrededor del 80% de las células están separadas del sustrato), vuelva a colocar los matraces en la incubadora durante 24 horas adicionales.
    11. Cuando se complete el CPE, decantar el sobrenadante de cultivo celular y centrifugar a 300 x g durante 10 minutos para granular los desechos celulares.
    12. Transfiera el sobrenadante clarificado a un tubo de 15 ml y los virus de la progenie alícuota a viales criogénicos estériles de un solo uso. Coloque inmediatamente los criotubos a -80 °C para congelar y almacenar virus.

2. Determinación de la cantidad celular adecuada para infectar células

NOTA: Durante todos los experimentos, mantenga las placas en superficies no electrostáticas en todo momento, como las envolturas de papel del embalaje. Siga la sección 2 a continuación para determinar la concentración más apropiada de células que se sembrarán en la placa electrónica de microtitulación (diseñada como placa E).

  1. Preparar células MDCK en matraces de 75 cm2 para obtener células recién divididas (aproximadamente el 80% de confluencia) 24 h antes del experimento.
  2. Lave las células con 5 ml de 1x PBS y despróbelas agregando 3 ml de solución de tripsina-EDTA al 0,25%.
  3. Agregue 7 ml de medio de cultivo celular fresco y cuente las células utilizando un contador celular automatizado con tinción azul tripano.
  4. Ajuste la concentración celular a 400.000 células/ml con medios de cultivo celular. Realizar diluciones en serie dobles en tubos adicionales para obtener densidades celulares de 200.000; 100,000; 50,000; 25,000; 12,500; y 6.250 células/ml. Ajuste el rango de dilución de las células de acuerdo con el tipo de célula y su comportamiento de crecimiento.
  5. Deje la placa E (Tabla de Materiales) en RT durante varios minutos y agregue 100 μL de medios de cultivo celular a cada pozo usando una pipeta multicanal. No toque los electrodos de la placa E.
  6. Desbloquee las bases e inserte el extremo frontal de la placa en el bolsillo de la cuna del instrumento de medición de impedancia (Tabla de materiales). Cierre la puerta de la incubadora.
  7. Abra el software.
    1. En "Configuración predeterminada del patrón de experimento", elija las bases seleccionadas y haga doble clic en la página superior, luego ingrese el nombre del experimento. Haga clic en "Diseño" e ingrese la información de muestra necesaria para cada pozo seleccionado de la placa; luego, haga clic en "Aplicar" cuando haya terminado. Haga clic en "Programar" | | "Pasos" "Añadir un paso". El software agrega automáticamente un paso de 1 s para medir la impedancia de fondo (IC).
    2. Haga clic en "Iniciar / Continuar" en la pestaña "Ejecutar". Haga clic en "Trazar", agregue todas las muestras seleccionando los pozos apropiados y asegúrese de que el IC esté entre -0.1 y 0.1 antes de continuar con el siguiente paso.
  8. Retire la placa de la cuna.
  9. Añadir 100 μL de cada suspensión celular del paso 2.4 por duplicado a los pocillos apropiados y 100 μL de medios celulares en los pocillos utilizados como controles. Deje la placa E en la campana de flujo laminar durante 30 minutos en RT para permitir una distribución uniforme de las celdas en el fondo de los pozos.
  10. Inserte la placa E en el bolsillo de la cuna. Haga clic en "Programar" | "Agregar paso" en el software e ingresar valores para monitorear celdas cada 30 minutos durante 200 repeticiones. Luego, seleccione "Iniciar / Continuar".
  11. Verifique y trace los datos de CI haciendo clic en el botón "Trazar" en el software. Seleccione la concentración de células que se encuentran justo antes de la fase estacionaria 24 h después de la siembra en la placa, para obtener células que aún están en una fase de crecimiento durante la infección viral. La fase estacionaria se alcanza cuando la IC está en su máximo.

3. Correlación entre los valores de CIT50 y la multiplicidad de la infección

  1. Añadir 100 μL de medio de cultivo estéril 1x MEM en cada pocillo de la placa E. Inserte la placa E en el bolsillo de la cuna del instrumento a 35 °C. Mida el fondo como se describe en el paso 2.7.
  2. Retire la placa E de la base.
  3. Sembrar 3 x 104 de células MDCK recién divididas en cada pocillo de la placa electrónica de microtitulación y cultivarlas durante 24 h a 35 °C con 5% de CO2 para que estén en fase replicativa durante la infección por IAV.
  4. Infectar células MDCK con diferentes diluciones de 10 veces de un título conocido de 6 log10 TCID50/mL del virus H1N1, utilizando pipeteo inverso para la reproducibilidad siguiendo los pasos a continuación:
    1. Enjuague las células MDCK 2x con 100 μL de MEM sin FCS (medios de propagación del virus). Tenga en cuenta retirar todos los medios después del segundo lavado para evitar una mayor dilución del inóculo.
    2. Añadir 100 μL de suspensión viral en cada pocillo usando pipeta de un solo canal. Para evitar la contaminación, proceda comenzando de izquierda a derecha y luego de arriba a abajo en la placa, mientras cubre los pozos restantes con la tapa.
    3. Inserte la placa en el bolsillo de la cuna del instrumento a 35 °C. Sea suave para evitar movimientos repentinos que puedan conducir a contaminaciones.
    4. Comience a monitorear la impedancia celular cada 15 minutos durante al menos 100 h como se describe en el paso 2.10.
    5. Después de los dos ciclos de mediciones (es decir, 30 min), detenga el aparato haciendo clic en "Pausa" en la pestaña "Ejecutar" y retire la placa E de la base.
    6. Agregue 1 μg/ml de TPCK-tripsina al medio de propagación del virus para escindir la hemaglutinina viral.
    7. Agregue 100 μL de medios de propagación del virus que contengan TPCK-tripsina en cada pozo e inserte la placa E en el bolsillo de la cuna.
    8. Haga clic en "Iniciar/Continuar" en la pestaña "Ejecutar".
      NOTA: No olvide crear un control negativo correspondiente a las células infectadas simuladamente reemplazando la suspensión viral con medios de propagación del virus.

4. Cinética de supervivencia de IAV

  1. Exponga el IAV al agua destilada salina a 35 °C y pruebe su infectividad a lo largo del tiempo midiendo la disminución de la impedancia celular.
    1. Preparar agua destilada salina añadiendo NaCl a una concentración final de 35 g/L en agua destilada. Agregue 900 μL de agua salina en criotubos de 2 ml.
    2. Agregue 100 μL de material viral en agua salina y coloque los criotubos en una incubadora (35 °C, 5% de CO2) durante 1 h, 24 h o 48 h.
    3. Sembrar 100 μL (que contiene 3 x 104) de células MDCK recién divididas en una placa de microtitulación de 16 pocillos y crecer durante 24 h a 37 °C y 5% de CO2.
    4. Infectar células con 100 μL de virus expuestos (previamente diluidos 10x en medios de cultivo) utilizando el método de pipeteo inverso para la reproducibilidad repitiendo la sección 3.4.
  2. Monitoree la impedancia celular cada 15 minutos durante al menos 100 h.

5. Evaluación de la pérdida de infectividad

  1. Determinación de los valores de CIT50 para cuantificar la disminución del IC debido a los efectos citopáticos inducidos por el virus con el valor de CIT50 .
    1. Haga clic en "Trazar" y agregue todas las muestras haciendo clic en "Agregar todo". Exporte los resultados a una hoja de cálculo haciendo clic en "Exportar información del experimento". Considere el IC inicial como el valor de impedancia celular medido 5 h después de la infección celular por virus expuestos (es decir, 24 h después de la siembra de células MDCK en la placa E del microtitulador).
    2. Calcule el valor de CIT50 correspondiente al tiempo necesario para medir una disminución del 50% con respecto al IC inicial. Para calcular el valor de CIT50 , anote el valor de IC a 5 hpi para cada muestra. Luego, busque el punto de tiempo en el que el valor de CI es igual a la mitad del valor de CI a 5 hpi utilizando las funciones de índice y coincidencia en la hoja de cálculo.
  2. Cálculo de la pendiente media de inactivación
    1. Determinar los valores de CIT50 para cada suspensión viral expuesta, en diferentes momentos de exposición (en días).
    2. Calcule una pendiente de regresión lineal a partir de los valores trazados de CIT50, denominados pendiente de inactivación y expresados en CIT50.day-1.

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Resultados

Los datos brutos obtenidos después de 120 h con diferentes concentraciones de células MDCK, de 15.000 a 120.000 células por pozo, se muestran en la Figura 1. Después de 24 h, las medidas de IC muestran que las células en pozos sembrados con 30,000 células todavía estaban en la fase exponencial de crecimiento, y esta concentración celular se utilizó para experimentos adicionales. La Figura 2 ilustra la correlación lineal entre los valores de CIT50 y la...

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Discusión

RTCA es una tecnología basada en la impedancia que se utiliza cada vez más para el monitoreo en tiempo real de las propiedades celulares, como la adherencia celular, la proliferación, la migración y la citotoxicidad. En este estudio, la capacidad de esta tecnología para evaluar la supervivencia del IAV fuera del huésped se demuestra midiendo la pendiente de inactivación del virus. Las técnicas fastidiosas como TCID50 y los ensayos de placa se sustituyen por una evaluación objetiva en tiempo real de la viabilid...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
0.25%TripsinaThermoFisher25200056
75 cm2 matraz de cultivode tejidos Falcon430641U
E-Plate 16 (6 placas)ACEA Biosciences, Inc5469830001Las placas E están disponibles en diferentes envases
FCSLife technologies (gibco)10270-106
MEM 1XLife technologies (gibco)31095029
PBS 1XLife technologies (gibco)14040091
Penicilina-EstreptomicinaLife technologies (gibco)11548876
TPCK-TripsinaWorthingtonLS003740
xCELLigence Real-Time Cell Analysis Instrument S16ACEA Biosciences, Inc380601310Los instrumentos xCELLigence RTCA S16 están disponibles en diferentes formatos (16 pocillos, 96 pocillos, placa simple o múltiple)

Referencias

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