Ensayo fluorométrico basado en química de clics para la apolipoproteína N-aciltransferasa desde la caracterización enzimática hasta el cribado de alto rendimiento

Summary

Aquí se presenta un ensayo de fluorescencia sensible para monitorear la actividad de la apolipoproteína N-aciltransferasa utilizando péptido diacilglicerilo y alquino-fosfolípidos como sustratos con química de clic.

Abstract

Las lipoproteínas de proteobacterias son modificadas postraduccionalmente por ácidos grasos derivados de fosfolípidos de membrana por la acción de tres enzimas integrales de membrana, lo que resulta en proteínas triaciladas. El primer paso en la vía de modificación de la lipoproteína implica la transferencia de un grupo diacilglicerilo del fosfatidilglicerol a la prolipoproteína, lo que resulta en la prolipoproteína diacilglicerilo. En el segundo paso, el péptido señal de la prolipoproteína se escinde, formando una apolipoproteína, que a su vez es modificada por un tercer ácido graso derivado de un fosfolípido. Este último paso es catalizado por la apolipoproteína N-aciltransferasa (Lnt). La vía de modificación de lipoproteínas es esencial en la mayoría de las γ-proteobacterias, por lo que es un objetivo potencial para el desarrollo de nuevos agentes antibacterianos. Aquí se describe un ensayo sensible para Lnt que es compatible con el cribado de alto rendimiento de pequeñas moléculas inhibidoras. La enzima y los sustratos son moléculas incrustadas en la membrana; Por lo tanto, el desarrollo de una prueba in vitro no es sencillo. Esto incluye la purificación de la enzima activa en presencia de detergente, la disponibilidad de sustratos de péptidos alquinos-fosfolípidos y diacilglicerilo, y las condiciones de reacción en micelas mixtas. Además, para utilizar la prueba de actividad en una configuración de cribado de alto rendimiento (HTS), se prefiere la lectura directa del producto de reacción sobre las reacciones enzimáticas acopladas. En este ensayo enzimático fluorométrico, el producto peptídico alquino-triacilado se vuelve fluorescente a través de una reacción de química de clic y se detecta en un formato de placa de múltiples pocillos. Este método es aplicable a otras aciltransferasas que utilizan sustratos que contienen ácidos grasos, incluidos los fosfolípidos y el acil-CoA.

Introduction

Las lipoproteínas bacterianas se caracterizan por ácidos grasos unidos covalentemente en sus aminoácidos a través de los cuales se anclan en membranas ^1,2. La parte madura de la proteína es muy diversa en estructura y función, lo que explica el papel de las lipoproteínas en diversos procesos biológicos en la envoltura celular bacteriana.

Las lipoproteínas son modificadas por ácidos grasos derivados de fosfolípidos después de la inserción en la membrana citoplasmática. Las prolipoproteínas contienen un motivo característico, el lipobox, que contiene un residuo de cisteína invariante ....

Protocol

1. Preparación de enzimas y sustratos

1. Purificación de la enzima
   1. Producir y purificar la enzima Lnt a partir de membranas solubilizadas detergentes como se describió anteriormente ^4,8. Brevemente, inducir la expresión del gen lnt-estreptococo, codificando Lnt con una etiqueta de estreptococo C-terminal, en OD 600 de 0,6 con tetraciclina anhidra (₂₀₀ ng/mL) a 37 °C durante 16 h.
   2. Recolectar células por centrifugación a 4.000 x g durante 10 min y desechar el sobrenadante.
   3. Resuspender el pellet celular en tampón WA (20 mM Tris-HC....

Results

En la reacción Lnt, el ácido graso sn-1 de los fosfolípidos se transfiere a un péptido diacilglicerilo, lo que resulta en un péptido triacilado maduro⁸. El ensayo Lnt in vitro descrito aquí está diseñado para utilizar fosfolípidos que contienen un ácido graso alquino (alquino-POPE) y FSL-1-biotina como sustratos, lo que resulta en la formación de alquino-FSL-1-biotina. Tras una reacción química de clic con azido-FAM, este producto debe marcarse fluorescentemente y detectarse mediante espe.......

Discussion

El protocolo para el ensayo Lnt descrito aquí, basado en la detección de fluorescencia del producto triacilado, es sensible y reproducible. La unión específica y eficiente de la biotina a la estreptavidina es un elemento clave en el ensayo. El sustrato de alquino-papa que queda después de completar la reacción Lnt también se marca fluorescentemente con FAM, pero se elimina de manera eficiente después de unirse a las placas de estreptavidina mediante múltiples pasos de lavado. Además, la adición de DMSO no afecta la activ.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ä Sistema de purificación KTA FPLC	GE Healthcare	NA	Pureza: NA Lnt purificación
alkyne-POPE	Avanti Lípidos Polares	900414P	Pureza: >99% Lnt sustrato
Azido-FAM	Lumiprobe	A4130	Pureza: 100% (puro) Reactivo
de clic BioPhotometer Plus	Eppendorf	N/A	Pureza: NA OD 600 nm
BioTek ELX 405 Seleccionar lavadora de placas	BioTek	N° serie 115800, n° material 405 Seleccionar	Pureza: NA Pasos
lavado biotina-fluoresceína	Sigma	53608	Pureza: ≥ 90% Control de fluorescencia
Sulfato de cobre (II) pentahidratado	Sigma	C3036	Pureza: ≥ 98% Reactivo
de clic DDM	Anatrace	D310A	Pureza: ≥ 99% β+α; < 15% α Detergente para la purificación de Lnt
Dimetilsulfóxido (DMSO)	Invitrogen	D12435	Pureza: anhidro Solbilización Reactivo de clic
Pipeta electrónica Voyager 8 canales 0,5-12,5 uL	INTEGRA	4721	Pureza: NA Reactivos
de manipulación Célula de presión francesa	N/A	N/A	Pureza: NA Disrupción celular
FSL-1-biotina	Microcolecciones EMC	L7030	Pureza: NA Sustrato Lnt
Greiner Bio-One Microplaca de poliestireno CELLSTAR estándar de 384 pocillos	Greiner	781091	Pureza: NA Negro con fondo transparente (lectura hacia arriba o hacia abajo)
Placa de poliestireno estéril Greiner Bio-One de 96 pocillos, alta unión	Greiner	655097	Pureza: NA Negro con fondo transparente (lectura hacia arriba o hacia abajo)
Lector de microplacas Infinite M1000 pro	Tecan	N/A Pureza	: NA Detección de fluorescencia
MTSES ((2-sulfonatoetil)metanetiosulfonato de sodio)	Anatrace	S110MT	Pureza: ~100% Inhibidor específico de tiol
Láminas de sellado adhesivo ópticamente transparentes	Thermo Scientific	AB-1170	Pureza: NA Lámina para sellar placa de pocillos
múltiples Sephacryl S400 HR 16/60 gel columna de filtración	GE Healthcare	GE28-9356-04	Pureza: NA Purificación de Lnt
StrepTactin Sepharose 50 %	IBA Biotechnology	2-1201-010	Pureza: NA Purificación de Lnt
estreptavidina	Sigma	S4762-1MG	Pureza: ≥ 13 unidades/mg proteína Unión a biotina
TBTA (tris[(1-bencil-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil]amina	Sigma	678937	Pureza: 97% Reactivo
de clic TCEP (clorhidrato de tris(2-carboxietil)fosfina	Sigma	75259	Pureza: ≥ 98% Reactivo
de clic TECAN Infinite F500	Tecan	N/A	Pureza: NA Detección de fluorescencia
TECAN Infinite M1000 pro	Tecan	N/A	Pureza: NA Detección de fluorescencia
Thermomixer C	Eppendorf	5382000015	Pureza: NA Tapa calefactada
Triton X-100	Sigma	93443	Pureza: 10% en H2O Tampón de reacción Lnt
Ultra centrífuga	Beckman LC	N/A	Pureza: NA Fraccionamiento de células