Artículo de método

Un sistema gnotobiótico para el estudio del ensamblaje del microbioma en la filosfera y en la fermentación vegetal

DOI:

10.3791/61149

⸱

3 de junio de 2020

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Tufts University

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Se ha desarrollado un método para cultivar coles Napa libres de gérmenes que permite a los investigadores evaluar cómo interactúan las especies microbianas individuales o las comunidades microbianas multiespecie en las superficies de las hojas de repollo. También se presenta un extracto vegetal estéril que se puede utilizar para medir los cambios en la composición de la comunidad durante la fermentación vegetal.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La filosfera, la parte sobre el suelo de la planta que puede ser colonizada por microbios, es un sistema modelo útil para identificar procesos de ensamblaje comunitario microbiano. Este protocolo describe un sistema para estudiar la dinámica de la comunidad microbiana en la filosfera de las plantas de repollo de Napa. Describe cómo cultivar plantas libres de gérmenes en tubos de ensayo con un sustrato de arcilla calcinada y caldo de nutrientes. La inoculación de plantas libres de gérmenes con cultivos microbianos específicos ofrece oportunidades para medir el crecimiento microbiano y la dinámica comunitaria en la filosfera. A través del uso de extracto vegetal estéril producido a partir de coles cambios en las comunidades microbianas que se producen durante la fermentación también se puede evaluar. Este sistema es relativamente simple y barato de configurar en el laboratorio y se puede utilizar para abordar cuestiones ecológicas clave en el ensamblaje de la comunidad microbiana. También ofrece oportunidades para entender cómo la composición de la comunidad filosfera puede afectar la diversidad microbiana y la calidad de las fermentaciones vegetales. Este enfoque para el desarrollo de comunidades filosfera de repollo gnotobiótico podría aplicarse a otras especies de plantas silvestres y agrícolas.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La diversidad microbiana de la filosfera juega un papel importante en el mantenimiento de la salud de la planta y también puede influir en la capacidad de las plantas para soportar el estrés ambiental1,2,3,4,5. A su vez, la salud de los cultivos afecta directamente a la inocuidad y calidad de los alimentos6,,7. Las plantas desempeñan un papel en el funcionamiento del ecosistema y sus microbiomas asociados afectan a la capacidad de las plantas para llevar a cabo estas actividades, así como influyen directamente en el entorno en sí8. Mientras que los científicos han comenzado a descifrar la función y composición de la filosfera, los procesos ecológicos que influyen en la asamblea comunitaria microbiana filosfera no se entienden completamente9,,10. El microbioma filosfera es un excelente sistema experimental para estudiar la ecología de los microbiomas11. Estas comunidades son relativamente simples y muchos de los miembros de la comunidad se pueden cultivar en los medios de laboratorio estándar10,,12,,13.

Las hortalizas fermentadas son un sistema en el que la estructura comunitaria de la filosfera tiene importantes consecuencias. Tanto en el chucrut como en el kimchi, los microbios que se producen naturalmente en las hojas vegetales (la filosfera de las especies de Brassica) sirve como el inóculo para la fermentación14,15. Las bacterias del ácido láctico (LAB) se consideran miembros ubicuos de los microbiomas vegetales, sin embargo pueden estar en baja abundancia en la filosfera16. Una fuerte selección abiótica durante la fermentación impulsa un cambio en la composición de la comunidad microbiana que permite que las bacterias del ácido láctico aumenten en abundancia. A medida que LAB crece, producen ácido láctico que crea el ambiente ácido de los productos vegetales fermentados17. El vínculo entre la filosfera y el fermento proporciona la oportunidad de utilizar las verduras como modelo para entender cómo se estructuran los microbiomas.

Hemos desarrollado métodos para cultivar coles Napa libres de gérmenes y para inocularlas con comunidades microbianas específicas utilizando botellas de aerosol. Este es un método barato y confiable de inocular uniformemente el repollo con microbios individuales o comunidades mixtas. También se ha desarrollado un extracto vegetal estéril (SVE) a partir de tres tipos/variedades diferentes de col: repollo rojo y verde (Brassica oleracea) y repollo Napa (B. rapa). La adición de sal a estas SVEs replica el entorno de fermentación y permite estudios experimentales a pequeña escala y relativamente de alto rendimiento del ensamblaje del microbioma de fermentación. Estos métodos se pueden utilizar para estudiar el ensamblaje de la comunidad microbiana en la filosfera y cómo la dinámica de la comunidad microbiana en la filosfera puede estar relacionada con el éxito de la fermentación vegetal.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Cultivo de coles libres de gérmenes

  1. Equipos de preparación para el cultivo de coles libres de gérmenes
    1. Limpieza de la arcilla calcinada para eliminar las partículas de polvo fino
      1. Enjuagar arcilla calcinada (Tabla de Materiales) al menos 3x con agua del grifo; drenar el agua.
        ADVERTENCIA: La arcilla calcinada produce polvo muy fino y se recomienda llevar una máscara protectora(Tabla de materiales)al lavar.
      2. Esparce la arcilla calcinada como una capa delgada (4 cm) en una bandeja de autoclave y autoclave en un ciclo seco (121 oC de calentamiento durante 20 minutos y 20 minutos de tiempo de secado) para esterilizar.
      3. Deje que la arcilla calcinada se seque completamente antes de su uso esparciendo en bandejas y colocándola en una incubadora caliente (30-37 oC) durante al menos una semana. Revuelve para mezclar cada 3 días para secar completamente la arcilla calcinada para que absorba una cantidad uniforme de caldo de nutrientes Murashige y Skoog (MS) (sección 1.2).
        NOTA: El secado también ayuda a mantener el volumen de arcilla calcinada incluso cuando se pesa en tubos. El secado por otros medios, como un horno de secado, también sería adecuado.
    2. Limpieza de la cristalería para el cultivo de coles libres de gérmenes
      1. Limpie y esterilice a fondo los tubos de vidrio(Tabla de materiales)entre cada uso. Remoje los tubos durante 30 minutos en solución de lejía al 30% y enjuague bien con agua del grifo antes de limpiarlos en un lavado ácido en un entorno bacteriológico. Tapas de tubo de ensayo bidireccionales de lavado ácido (Tabla de materiales) entre usos.
    3. Semillas de repollo esterilizantes de superficie
      1. Coloque hasta 100 semillas de repollo Napa (B. rapa var pekinensis) en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
        NOTA: La adición de más de 100 semillas a un tubo de microcentrífuga o el cambio del tamaño del tubo puede afectar las tasas de germinación de las semillas debido a la falta de eliminación de la capa de semillas.
      2. Añadir 1 ml de etanol al 70% a las semillas y vórtice durante 5 min. Deseche el etanol con una pipeta.
      3. Añadir 1 ml de lejía y vórtice al 50% durante 5 min. Deseche la solución de lejía con una pipeta.
      4. Añadir 1 ml de agua desionizada autoclavizada y vórtice durante 5 min. Deseche el agua desionizada con una pipeta.
      5. Repita el paso 1.1.3.4 3x para enjuagar toda la lejía. Remoje las semillas en agua estéril desionizada durante 2-8 h antes de la siembra para suavizar la capa de semillas.
  2. Crecimiento de coles libres de gérmenes
    NOTA: Las coles Napa (B. rapa var pekinensis) se cultivan en tubos de vidrio (15 cm x 2,5 cm) que contienen arcilla calcinada empapada en caldo de nutrientes Murashige y Skoog (MS) (Figura 1).
    1. Pesar 10 g de arcilla calcinada limpia en un tubo de vidrio limpio (15 cm x 2,5 cm).
    2. Preparar el caldo de nutrientes MS disolviendo 4,4 g de medio de LA MS en 1 L de agua desionizada. Agregue el caldo de nutrientes MS (9 ml) a cada tubo de vidrio para cubrir la arcilla calcinada utilizando una pipeta.
      NOTA: El líquido de pie en el tubo evitará que la semilla germine por lo que podría ser necesario añadir un poco menos de caldo de MS a algunos tubos.
    3. Tapar con holgura los tubos de vidrio con tapas de tubo de ensayo bidireccionales de 22 mm y autoclave (121oC durante 60 min). Cuando los retire del autoclave, empuje las tapas sobre los tubos de vidrio para sellarlos. Enfríe los tubos a temperatura ambiente antes de su uso.
    4. Coloque suavemente una semilla de repollo estéril en el centro de cada tubo utilizando fórceps estériles y extralargos (25,4 cm). Coloque los tubos en una bandeja de 7 vías y colóquelos debajo de los bastidores de luz (bombillas fluorescentes T5 de espectro completo u otra configuración de iluminación para el crecimiento de la planta) con un ciclo de luz de 16 horas a 24 oC.
      NOTA: Las semillas germinan durante la noche y desarrollan su primera hoja verdadera después de 5 días. Una verdadera hoja es la primera hoja vascular después de que se hayan formado los cotiledones. Tiene un borde más arrugado y en Brassica rapa está cubierto de tricomas.
  3. Pruebas de esterilidad de coles libres de gérmenes
    NOTA: Para comprobar si las coles no tienen germen, seleccione algunas coles (5-10) de cada lote y placa para determinar si hay colonias culturables.
    1. Retire suavemente el repollo de los tubos de vidrio agarrando la base de la planta con fórceps esterilizados y sacándolo. Antes de retirar el repollo completamente del tubo, cortar cuidadosamente las raíces utilizando tijeras de disección esterilizadas. Compactar las hojas de repollo en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
      NOTA: Las coles más grandes pueden requerir la extracción de una o dos de las hojas más grandes mientras el repollo todavía está en el tubo para facilitar la obtención del repollo en el tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Estas hojas más grandes se pueden añadir al tubo de 1,5 ml después de que el resto del repollo se ha colocado en el tubo si se requiere todo el repollo.
    2. Añadir 400 l de 1x solución salina tampón de fosfato (PBS) a cada tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Usando una micropesta estéril, homogeneizar el repollo en plagas 30x.
    3. Placa 100 l de la col homogeneiza en las placas de agar para determinar si hay algún contaminante presente en la muestra. La mayoría de las bacterias que se encuentran en la filosfera crecerán en placas de agar de soja tríptica (TS). Utilice puntas anchas de pipeta de orificio al enchapar homogeneizar repollo, ya que el homogeneario de repollo es grueso y puede obstruir las puntas regulares de las pipetas.

2. Inoculación de la filosfera con soluciones microbianas

  1. Hacer reservas de glicerol de cepas de inoculación
    NOTA: La Tabla 1 enumera los aislados microbianos que se pueden utilizar en este paso. Otros aislados de filosfera también podrían ser utilizados aquí.
    1. Densamente rayar colonias individuales de una nueva racha, en dos/tres nuevas placas de los mismos medios para obtener muchas colonias.
    2. Deje que las rayas crezcan durante 2 a 5 días y luego raspe las colonias de todas las placas en un tubo cónico de 15 ml que contenga 15 ml de 15% de glicerol, y vórtice para mezclar a fondo.
    3. Transfiera una alícuota de 1 ml del caldo de glicerol bien mezclado a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y almacene las existencias de glicerol a -80 oC hasta su uso. Ahorre los 14 ml restantes de stock de glicerol a -80 oC, ya que se requieren volúmenes relativamente grandes de solución de inoculación al inocular coles.
    4. Una semana antes de usar, descongelar el tubo de 1,5 ml que contiene 1 ml de población de glicerol (del paso 2.1.3) sobre hielo, diluir y placa en varias diluciones diferentes (por ejemplo, 10-4, 10-5y 10-6) para determinar la concentración (unidad formadora de colonias [CFU] por L) de los 14 ml de solución de inoculación.
  2. Botellas de inoculación esterilizantes
    1. Desmontar las botellas redondas de ámbar de la bomba Boston (59 ml) y remojar todos los componentes (bomba, tubo, tapa y botella) en una solución de lejía al 30% durante 30 minutos en un recipiente de plástico grande con una tapa herméticamente ajustada.
    2. Después de remojar, vierta cuidadosamente toda la lejía del recipiente levantando sólo una esquina de la tapa del recipiente.
    3. Enjuague las botellas llenando el recipiente de plástico con agua desionizada autoclave (1 L dependiendo del tamaño del recipiente) y vierta cuidadosamente el agua desionizada, levantando de nuevo la tapa en una esquina.
    4. Esterilice un gabinete de bioseguridad rociando con una solución de etanol al 70% y encendiendo la luz UV durante 30 minutos.
      NOTA: Continúe este trabajo en el gabinete de bioseguridad para que no haya riesgo de contaminación microbiana de las botellas mientras se secan al aire.
    5. Retire las botellas del recipiente de plástico grande y llene cada botella con agua desionizada autoclavizada con una pipeta. Vuelva a montar las bombas y coloque una en cada botella. Bombee el agua desionizada a través de cada botella (10 pulverizaciones por botella) para eliminar la lejía del componente de la bomba de la botella.
    6. Repita el paso 2.2.5 para asegurarse de que se retira toda la lejía de las botellas de vidrio.
    7. Pruebe si las botellas son estériles colocando un número en cada botella (pegando cinta de laboratorio al lado de la botella cuando está completamente seca) luego agregue 10 ml de 1x PBS a cada una de las botellas y bombee 3 aerosoles en una placa de agar TS. Después de la pulverización, incubar las placas durante una semana a temperatura ambiente. Si alguna colonia crece en un plato indica que la botella respectiva no era estéril y no debe utilizarse para experimentos.
    8. Antes de almacenar las botellas estériles, retire todo el PBS restante y deje que las botellas se sequen a fondo en el gabinete de bioseguridad. Almacene las botellas estériles en un recipiente de plástico estéril (normalmente el recipiente utilizado para blanquear las botellas) hasta su uso.
  3. Preparación del inóculo microbiano y pulverización de coles libres de gérmenes
    ADVERTENCIA: Todos los pasos deben realizarse en un gabinete de bioseguridad, ya que la pulverización se pulveriza las soluciones microbianas que podrían contaminar las superficies de trabajo o suponer un riesgo para la salud si se llevan a cabo en un banco de laboratorio.
    NOTA: Los repollos formarán hojas verdaderas después de 5 días, por lo que es aconsejable esperar una semana después de plantar el repollo antes de inocular con cualquier solución microbiana. Como los tubos están sellados, no hay necesidad de regar las coles. Los experimentos se realizan mejor dentro de un mes de la plantación, ya que los pequeños tubos restringen el crecimiento del repollo.
    1. Descongelar las existencias de glicerol sobre hielo y diluir en 1x PBS a la concentración de inoculación deseada (concentración determinada por descongelación y enchapado de una alícuota de 1 ml en el paso 2.1.4).
      NOTA: Se puede utilizar una variedad de diferentes niveles de inoculación, pero los aislados de filosfera pueden crecer de 104 a 108 UFC/ml de lodos de repollo en 10 días.
    2. Agregue 10 ml de caldo de glicerol diluido a la botella de bomba estéril y bombee 5 aspersiones en un vaso de precipitados de recolección de residuos grande para eliminar cualquier PBS residual del componente de la bomba de botella.
    3. Retire la tapa del tubo de repollo, incline el repollo hacia la botella de pulverización y rocíe cada repollo con 3 bombas de la solución de inoculación, que proporciona 600 ml de inóculo.
    4. Después de la inoculación, cosechar un subconjunto de las coles para evaluar la concentración real de inoculación de insumos. Retire el repollo de un tubo con fórceps esterilizados. Corte las raíces con tijeras de disección estériles y luego coloque cuidadosamente el repollo en un tubo de microcentrífuga estéril prepesado de 1,5 ml. Registre el peso del repollo para los cálculos futuros si se requiereN UFC/g de repollo para los cálculos.
    5. Añadir 400 l de 1x PBS a cada tubo de microcentrífuga de 1,5 ml que contenga repollo y utilizar una micropesta estéril para homogeneizar el repollo en el 1x PBS moliéndolo 30x.
    6. Diluir el homogeneizado de repollo (si es necesario) y la placa fuera de la mezcla de repollo plagado. Utilice puntas de orificio anchas para pipetear la lodo de repollo, ya que será gruesa y llena de trozos de tejido vegetal.

3. Preparación de extracto vegetal estéril

NOTA: Este método es una versión modificada de la producción de medios estériles de repollo18,19.

  1. Compra un repollo en un supermercado. En el laboratorio, retire y deseche las hojas más externas del repollo. Cortar todo el repollo restante para encajar en una licuadora y homogeneizar el repollo a una pulpa fina, es decir, el repollo no conseguirá más fino con la mezcla adicional.
    NOTA: Cualquier licuadora que pueda cortar el repollo a una pulpa homogénea lisa debe ser adecuada para este método.
  2. Pesar el homogeneario de repollo mezclado y añadir 2 ml de agua destilada por gramo de repollo. Filtrar la suspensión de repollo mezclado a través de 2 capas de filtros de café de cesta (papel sin blanquear).
  3. Dispensar la loda de repollo en tubos centrífugos (el tamaño depende de la centrífuga). Centrifugar la lechada de repollo filtrada a 20.000 x g durante 20 min hasta que las partículas grandes se asienten fuera de la solución.
    NOTA: Es esencial centrifugar la lechada de repollo durante un largo período de tiempo, ya que las partículas de repollo obstruyen rápidamente el esterilizador del filtro.
  4. Con una pipeta serológica, retire el sobrenadante de los restos de repollo peletados teniendo cuidado de no perturbar el repollo peletista. Si tiene como objetivo recrear las condiciones de fermentación en las que se utilizan concentraciones de sal estándar, añada un 2% de NaCl en este paso (es decir, antes de la esterilización del filtro).
  5. Filtrar el extracto vegetal utilizando un filtro de 0,2 m (500 ml o 1 L) unido a un vacío. Dispensar en tubos estériles (ya sea tubos centrífugos de 50 ml o tubos centrífugos de 15 ml) y congelar a -80 oC hasta su uso.

4. Inoculación de extracto vegetal estéril

  1. Descongelar SVE y dispensar 490 l en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml. Utilice tubos suficientes para tener al menos cinco réplicas por tratamiento por punto de tiempo, ya que cada medición del punto de tiempo es destructiva.
  2. Descongelar las reservas de glicerol de aislados microbianos en hielo y diluir con 1x PBS a la concentración deseada. La concentración de bacterias del ácido láctico puede ser tan baja como 5.000 UFC por ml de SVE. Para lograr esta concentración, diluir las poblaciones a 250 UFC/L, ya que se utilizarán 10 l para la inoculación de un volumen total de 500 l.
  3. Inocular SVE con 10 ml de aislado microbiano diluido. Pipetear hacia arriba y hacia abajo un par de veces para mezclar a fondo. Incubar a la temperatura deseada (14oC para la temperatura de producción de kimchi o 24oC para fermentación más cálida del chucrut).
  4. Mida la tasa de crecimiento del aislado microbiano en el SVE mediante la cosecha de tubos replicados en el día 1, día 2, día 4, día 7 y día 14.
    NOTA: La fermentación se realiza rápidamente desde el principio y se ralentiza con el tiempo. Por lo tanto, tener más puntos de tiempo iniciales da una mayor resolución a la dinámica de cómo procede la fermentación.
  5. En cada punto de tiempo, mezcle el pozo SVE inoculado pipeteando hacia arriba y hacia abajo unas cuantas veces. Diluir en serie el SVE inoculado en 1x PBS y la placa en placas de agar. Incubar las placas de agar durante 4-7 días antes de contar las colonias.
    NOTA: El agar hombre, rogosa y Sharpe (MRS) debe utilizarse para enumerar todas las bacterias del ácido láctico, la dextrosa de la peptona de levadura (YPD) debe utilizarse para la levadura y el agar TS para la mayoría de los aislados de bacterias de la filosfera.
  6. Registre el pH de las muestras en cada punto de tiempo utilizando una sonda de micro pH.
    NOTA: Este paso debe llevarse a cabo después del chapado porque la sonda de pH transferirá las células entre tubos/tratamientos.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tasas de crecimiento de las coles Napa
El método de esterilización de semillas fue probado con varias coles Napa diferentes (B. rapa var pekinese; Figura suplementaria 1) de un número de diferentes proveedores y todos crecieron consistentemente con tasas de crecimiento similares. Sin embargo, probando los métodos con diferentes especies de Brassica (B. rapa: Turnip Purple Top; B. oleracea: Cairo Hybrid, Tropic Giant ...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las plantas de repollo Napa libres de gérmenes se han utilizado para estudiar la limitación de dispersión de las bacterias del ácido láctico en la filosfera de repollo Napa17. Las coles Napa libres de gérmenes también se pueden utilizar para probar el crecimiento individual o par en la filosfera (Figura 1). Los métodos para la elaboración de extracto vegetal estéril han sido probados para tres variedades diferentes de repollo: rojo, verde y Napa. Cada una de estas EV ...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo fue apoyado por la subvención USDA-NIFA: 2017-67013-26520. Tracy Debenport y Claire Fogan proporcionaron soporte técnico y Ruby Ye y Casey Cosetta proporcionan comentarios útiles sobre las primeras versiones de este manuscrito.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Tubos de microcentrífuga de 1,5 mLVWR20170-650
Tubos cónicos de 15 mL Falcon352096
bandeja de 7 víasSigma MagentaT8654
vidrio Boston redonda ámbarGPS 712OZSPPK12BRPedido en Amazon.com de varios proveedores
Filtros de café de cestaSi te importa(papel sin blanquear) Comprado en Wholefoods
Bleach (sin mercurio)Austin's50-010-45
Borosilicato Tubos de vidrioVWR47729-586
Arcilla calcinadaTurfaceMVPPedido en Amazon.com de Root Naturally 6 Quart Bags. Tamaño de partícula aproximado 3-5 mm
Batidora CuisinartCuisinartProcesador de alimentos Cuisinart Mini-Prep Plus,
tijeras de disección7-389-AProductos educativos americanospedidos en etanol Amazon.com
VWR89125-172
PinzasAven18434Pedido en Amazon.com
GlycerolFisher Scientific56-81-5
KleenGuard M10Kimberley-Clark64240
Contenedor de plástico grandeRubbermaidPedido en
Amazon.com Estantes de luzGardner's Supply39-357Bombillas fluorescentes T5 de espectro completo
Magenta tm Tapas de 2 víasMillipore SigmaC1934
Man, Rogosa y SharpeFisher ScientificDF0881-17-5Este medio es para caldo y se añaden 15 g de agar para hacer placas Micro
sonda de pHThermo Scientific8220BNWP
MicromortleCarolina215828También llamado Pellet Mortle
MS caldo de nutrientesMillipore SigmaM5519Murashige and Skoog Basal Medium
NaClSigma AldrichS9888
Semillas de col NapaJohnny's Select Seeds2814GB. rapa var pekinensis (Bilko)
Placa de Petri 100 mm x 15 mmFisherFB0875712Se utiliza para hacer placas de agar
Tampón de fosfato salinoFisher Scientific50-842-941Teknova
Caja de cultivo de tejidos vegetalesSigmaMagenta GA-7
Pipetas serológicasVWR89130-900
Clavija estérilPuritan10805-018Autoclave antes de usar para esterilizar
Esterilización 0.2 y micro; m filtroNalgene974103
Agar de soja trípticoFisher ScientificDF0370-17-3Este medio es para caldo y se añaden 15 g de agar para hacer platos
Puntas de pipeta de orificio anchoRainin17007102
Levadura, peptona y dextrosaFisher ScientificDF0428-17-5Este medio es adecuado, pero también se puede hacer con levadura, peptona y dextrosa, agregue 15 g de agar al hacer platos
Botella de de 3 tazas

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Grady, K. L., Sorensen, J. W., Stopnisek, N., Guittar, J., Shade, A. Assembly and seasonality of core phyllosphere microbiota on perennial biofuel crops. Nature Communications. 10 (1), 4135(2019).
  2. Pii, Y., et al. Microbial interactions in the rhizosphere: beneficial influences of plant growth-promoting rhizobacteria on nutrient acquisition process. A review. Biology and Fertility of Soils. 51 (4), 403-415 (2015).
  3. Berendsen, R. L., Pieterse, C. M. J., Bakker, P. A. H. M. The rhizosphere microbiome and plant health. Trends in Plant Science. 17 (8), 478-486 (2012).
  4. Bai, Y., et al. Functional overlap of the Arabidopsis leaf and root microbiota. Nature. 528 (7582), 364-369 (2015).
  5. Bulgarelli, D., Schlaeppi, K., Spaepen, S., Ver Loren van Themaat, E., Schulze-Lefert, P. Structure and functions of the bacterial microbiota of plants. Annual Review of Plant Biology. 64, 807-838 (2013).
  6. Dinu, L. D., Bach, S. Induction of viable but nonculturable Escherichia coli O157:H7 in the phyllosphere of lettuce: a food safety risk factor. Applied and Environmental Microbiology. 77 (23), 8295-8302 (2011).
  7. Heaton, J. C., Jones, K. Microbial contamination of fruit and vegetables and the behaviour of enteropathogens in the phyllosphere: a review. Journal of Applied Microbiology. 104 (3), 613-626 (2008).
  8. Bringel, F., Couée, I. Pivotal roles of phyllosphere microorganisms at the interface between plant functioning and atmospheric trace gas dynamics. Frontiers in Microbiology. 6, 486(2015).
  9. Maignien, L., DeForce, E. A., Chafee, M. E., Eren, A. M., Simmons, S. L. Ecological succession and stochastic variation in the assembly of Arabidopsis thaliana phyllosphere communities. mBio. 5 (1), e00682(2014).
  10. Carlström, C. I., et al. Synthetic microbiota reveal priority effects and keystone strains in the Arabidopsis phyllosphere. Nature Ecology & Evolution. 3 (10), 1445-1454 (2019).
  11. Meyer, K. M., Leveau, J. H. J. Microbiology of the phyllosphere: a playground for testing ecological concepts. Oecologia. 168 (3), 621-629 (2012).
  12. Humphrey, P. T., Nguyen, T. T., Villalobos, M. M., Whiteman, N. K. Diversity and abundance of phyllosphere bacteria are linked to insect herbivory. Molecular Ecology. 23 (6), 1497-1515 (2014).
  13. Williams, T. R., Marco, M. L. Phyllosphere microbiota composition and microbial community transplantation on lettuce plants grown indoors. mBio. 5 (4), e01564(2014).
  14. Di Cagno, R., Coda, R., De Angelis, M., Gobbetti, M. Exploitation of vegetables and fruits through lactic acid fermentation. Food Microbiology. 33 (1), 1-10 (2013).
  15. Köberl, M., et al. Deciphering the microbiome shift during fermentation of medicinal plants. Scientific Reports. 9 (1), 13461(2019).
  16. Yu, A. O., Leveau, J. H. J., Marco, M. L. Abundance, diversity and plant-specific adaptations of plant-associated lactic acid bacteria. Environmental Microbiology Reports. 12 (1), 16-29 (2020).
  17. Miller, E. R., et al. Establishment limitation constrains the abundance of lactic acid bacteria in the Napa cabbage phyllosphere. Applied and Environmental Microbiology. 85 (13), e00269(2019).
  18. Stamer, J. R., Stoyla, B. O., Dunckel, B. A. Growth rates and fermentation patterns of lactic acid bacteria associated with sauerkraut fermentation. Journal of Milk and Food Technology. 34 (11), 521-525 (1971).
  19. Yildiz, F., Westhoff, D. Associative growth of lactic acid bacteria in cabbage juice. Journal of Food Science. 46 (3), 962-963 (1981).
  20. Zabat, M. A., Sano, W. H., Wurster, J. I., Cabral, D. J., Belenky, P. Microbial community analysis of sauerkraut fermentation reveals a stable and rapidly established community. Foods. 7 (5), Basel, Switzerland. 77(2018).
  21. Lee, S. H., Jung, J. Y., Jeon, C. O. Source tracking and succession of kimchi lactic acid bacteria during fermentation. Journal of Food Science. 80 (8), M1871(2015).
  22. Trivedi, P., Schenk, P. M., Wallenstein, M. D., Singh, B. K. Tiny Microbes, Big Yields: enhancing food crop production with biological solutions. Microbial Biotechnology. 10 (5), 999-1003 (2017).
  23. Knief, C., et al. Metaproteogenomic analysis of microbial communities in the phyllosphere and rhizosphere of rice. The ISME Journal. 6 (7), 1378-1390 (2012).
  24. Wuyts, S., et al. Carrot Juice Fermentations as Man-Made Microbial Ecosystems Dominated by Lactic Acid Bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 84 (12), AEM.00134(2018).
  25. Niu, B., Paulson, J. N., Zheng, X., Kolter, R. Simplified and representative bacterial community of maize roots. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (12), E2450-E2459 (2017).
  26. Steinkraus, K. H. Lactic acid fermentation in the production of foods from vegetables, cereals and legumes. Antonie van Leeuwenhoek. 49 (3), 337-348 (1983).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este artículo de JoVE

Solicitar permiso

Etiquetas

Microbioma de la filosferaensamblaje de la comunidad microbianaplantas libres de g rmenesextracto vegetal est rilesterilizaci n de semillassustrato de arcilla c lcicamedio de caldo MSprotocolo de inoculaci nan lisis de fermentaci n

Artículos relacionados