Seguimiento de partículas 3D para el análisis in vivo no invasivo de la dinámica sináptica de los microtúbulos en dendritas y uniones neuromusculares de Drosophila

Summary

Este estudio presenta una estrategia de imagen neuronal intravital no invasiva combinada con una nueva estrategia de software para lograr un seguimiento y análisis automatizados e imparciales de la dinámica de los microtúbulos (MT) en vivo en el extremo positivo de las dendritas sensoriales y las uniones neuromusculares de Drosophila.

Abstract

Los microtúbulos (MT) desempeñan un papel fundamental en el desarrollo neuronal, pero aún quedan muchas preguntas sobre los mecanismos moleculares de su regulación y función. Además, a pesar de los avances en la comprensión de las MT postsinápticas, se sabe mucho menos sobre las contribuciones de las MT presinápticas a la morfogénesis neuronal. En particular, los estudios de la dinámica de la MT in vivo en dendritas sensoriales de Drosophila proporcionaron información significativa sobre el comportamiento a nivel de polímero. Sin embargo, los desafíos técnicos y analíticos asociados con la obtención de imágenes en vivo de la unión neuromuscular de la mosca (NMJ) han limitado estudios comparables de la dinámica presináptica de la MT. Además, si bien existen muchas estrategias de software altamente efectivas para el análisis automatizado de la dinámica de la TA in vitro y ex vivo, los datos in vivo a menudo requieren una participación significativa del operador o un análisis completamente manual debido a la relación señal-ruido inherentemente inferior en las imágenes y la compleja morfología celular.  Para abordar esto, este estudio optimizó una nueva plataforma de software para la detección automatizada e imparcial de partículas in vivo. Se realizó un análisis multiparamétrico de imágenes confocales de lapso de tiempo en vivo de MT marcadas con EB1-GFP tanto en dendritas como en NMJ de larvas de Drosophila y encontró diferencias sorprendentes en el comportamiento de MT. Además, se analizó la dinámica de la MT tras la eliminación de la proteína asociada a la MT (MAP) dTACC, un regulador clave del desarrollo de la sinapsis de Drosophila, y se identificaron cambios estadísticamente significativos en la dinámica de la MT en comparación con el tipo salvaje. Estos resultados demuestran que esta nueva estrategia para el análisis multiparamétrico automatizado de la dinámica de la MT pre y postsináptica a nivel de polímero reduce significativamente los criterios de human-in-the-loop. Además, el estudio muestra la utilidad de este método en la detección de distintos comportamientos de la MT tras el knockdown de dTACC, lo que indica una posible aplicación futura para pantallas funcionales de factores que regulan la dinámica de la MT in vivo. Las aplicaciones futuras de este método también pueden centrarse en dilucidar el tipo de célula y/o los comportamientos de MT específicos del compartimento, y la obtención de imágenes correlativas multicolor de EB1-GFP con otros marcadores celulares y subcelulares de interés.

Introduction

Las células se organizan para formar estructuras funcionales a través de la coordinación de cambios intra e intercelulares a través de la morfogénesis. Un ejemplo notable de morfogénesis es el desarrollo de la estructura neuronal altamente especializada. Las neuronas muestran una polarización notable, en la que extienden dos tipos de procesos estructural y funcionalmente distintos, dendritas y axones¹, que pueden alcanzar longitudes inmensas. La complejidad del desarrollo neuronal surge no solo del gran tamaño de las dendritas y axones, sino también de la dificultad para formar sus geometrías intrincadamente ramificadas ^2,3. La morfogénesis neuronal y sus consecuencias en el aprendizaje y la memoria⁴ motivan la investigación continua tanto de su control genético como de los mecanismos biológicos celulares subyacentes. Tales mecanismos incluyen, pero no se limitan a, el transporte de la membrana intracelular y los muchos reordenamientos del esqueleto necesarios para los cambios en la morfología neuronal ^1,2,3.

Los estudios de la morfogénesis neuronal han producido una variedad de técnicas de visualización avanzadas. Los métodos estáticos, como la microscopía electrónica o la microscopía de fluorescencia de sondas fijas, se utilizan ampliamente para realizar análisis morfológicos y estructurales de alta resolución. Sin embargo, además de los artefactos que son inevitables para cualquier método de preservación, la visualización estática no puede capturar los cambios dinámicos que sustentan la morfogénesis. Por lo tanto, muchos conocimientos fundamentales se originaron a partir de la microscopía de fluorescencia de lapso de tiempo de tejidos vivos. Los primeros trabajos de Lichtman y sus colegas ^5,6,7 utilizaron imágenes in vivo del sistema nervioso de los mamíferos para investigar la regeneración/degeneración de los axones, la organización de los componentes sinápticos y el transporte axonal de largo alcance. Además, los estudios seminales en explantes neuronales primarios fueron críticos para establecer la importancia de la dinámica de los microtúbulos (MT) para la elongación y motilidad axonal ^8,9. De manera crucial, los primeros estudios de explantes neuronales establecieron el uso de proteínas de la familia de unión a extremos (EB) marcadas con fluorescencia para obtener información invaluable sobre la dinámica de extremos positivos de MT en neuronas en desarrollo a nivel de polímeros MT individuales¹⁰. Estos estudios surgieron a partir de la observación de que el miembro de la familia EB EB1 se localiza preferentemente en MT más extremos¹¹ en S. cerevisiae¹² y en células cultivadas¹³. Desde entonces, EB1 y otras proteínas de seguimiento de punta plus (+TIPs)^14,15 han sido ampliamente utilizadas en estudios in vivo de la inestabilidad dinámica de la MT¹⁶, incluso en el contexto del desarrollo neuronal¹⁷.

Drosophila es un potente modelo para los estudios de imagen in vivo de la dinámica de la MT durante el desarrollo neuronal debido a las vastas herramientas genéticas y de imagen disponibles para los estudios con moscas^18,19, así como a las similitudes en la estructura y función entre Drosophila y las neuronas de vertebrados¹. Un estudio temprano clave de la unión neuromuscular (NMJ) de las larvas de Drosophila realizó imágenes repetidas y no invasivas de un marcador de membrana fluorescente a través de la cutícula translúcida de animales intactos para documentar la morfogénesis terminal presináptica²⁰. Utilizando un método similar para obtener imágenes de larvas de Drosophila vivas y enteras, se proporcionó una demostración inicial de análisis subcelular, a nivel de partículas, del movimiento procesal de las cargas motoras en los axones²¹. Más recientemente, los meticulosos estudios realizados por Rolls y sus colegas en las dendritas sensoriales de las larvas intactas de Drosophila 22,23,24,25,26,27 caracterizaron la dinámica postsináptica de la MT en el extremo positivo mediante la realización de un seguimiento de partículas y el análisis de EB1 marcado con proteína verde fluorescente (GFP). Tales estudios en Drosophila 22,23,24,25,26,27 y otros sistemas 28,29,30,31,32 han avanzado significativamente en la comprensión del comportamiento de un solo polímero de los extremos más de MT en las dendritas de las neuronas en desarrollo ³³.

A pesar de los impresionantes estudios in vivo de la dinámica de la MT postsináptica 22,23,24,25,26,27,28,29,30,31, ha habido muchos menos estudios comparables de la dinámica de la MT presináptica en el terminal axónico en desarrollo. La dinámica de la MT en la NMJ larvaria de Drosophila se ha estudiado mediante microscopía de moteado fluorescente (FSM) y recuperación de fluorescencia después del fotoblanqueo (FRAP)³⁴. Estas técnicas evalúan la cinética general de la tubulina, pero no el comportamiento de los extremos positivos de MT individuales. En el momento de escribir este artículo, ha habido una única investigación de los extremos positivos individuales de la MT en el NMJ de Drosophila: este estudio combinó imágenes de lapso de tiempo en vivo con el análisis manual de quimógrafos para caracterizar una población de MT dinámicos, EB1-GFP etiquetados como "MT pioneros" que parecían distintos de una población más amplia de MT estabilizados³⁵. Esta falta de investigación sobre la dinámica presináptica de la TA puede deberse, al menos en parte, a la anatomía: si bien es relativamente sencillo obtener imágenes de las dendritas debido a su proximidad a la cutícula de la larva, los NMJ están obstruidos por otros tejidos, lo que dificulta la adquisición de imágenes con una relación señal-ruido suficiente para el análisis a nivel de partículas. No obstante, dada la importancia bien establecida de las MT presinápticas para la morfogénesis y la estabilización sináptica³⁶, así como sus vínculos con los trastornos neurodegenerativos y del neurodesarrollo³⁷, es probable que cerrar esta brecha entre la comprensión de las MT presinápticas y postsinápticas proporcione información invaluable.

Un desafío adicional para el análisis de la dinámica de la MT in vivo en general, en contraste con el análisis in vitro o ex vivo, son las limitadas herramientas de software automatizadas que pueden extraer parámetros de dinámica de datos in vivo. En la actualidad, una de las técnicas más populares y potentes para el análisis de los extremos positivos de la TA marcados con +TIP es plusTipTracker^38,39, un software basado en MATLAB que permite el seguimiento y el análisis automatizados de múltiples parámetros dinámicos. En particular, plusTipTracker mide no solo el crecimiento de la TA sino también la contracción y los rescates: mientras que las etiquetas +TIP como EB1-GFP solo se asocian con extremos positivos crecientes, plusTipTracker puede inferir algorítmicamente las tasas de contracción y los eventos de rescate. Sin embargo, mientras que plusTripTracker se ha aplicado con mucho éxito en muchos contextos, incluido el análisis multiparamétrico previo de la dinámica de MT ex vivo en células S2 de Drosophila⁴⁰, plusTipTracker no es óptimo para el análisis de datos in vivo dada su menor relación señal-ruido. Como resultado, los estudios in vivo de la dinámica del extremo positivo en las dendritas 22,23,24,25,26,27 y en el NMJ³⁵ de Drosophila se han basado en la generación manual y el análisis de kymographs utilizando software como ImageJ 41, o en estrategias semiautomatizadas que involucran numerosos componentes humanos.

Este estudio presenta un flujo de trabajo experimental y analítico que reduce la sobrecarga experimental y analítica necesaria para realizar análisis no invasivos a nivel de polímero de la dinámica presináptica de la MT tanto en las dendritas sensoriales como en el terminal del axón motor de las larvas de tercer estadio de Drosophila. El protocolo utiliza larvas inmovilizadas e intactas y, por lo tanto, evita lesiones que se sabe que desencadenan respuestas al estrés, así como otras condiciones no fisiológicas que podrían perturbar la dinámica de la MT in vivo. Para etiquetar los extremos positivos de la MT dinámica, EB1-GFP se expresa panneuronalmente utilizando el sistema Gal4/UAS ⁴², lo que permite la visualización de las MT tanto en las dendritas como en la NMJ con un solo controlador. Si bien algunos pasos iniciales están inevitablemente sujetos a la toma de decisiones humanas, como la selección de especímenes de animales y la identificación de regiones para obtener imágenes, los pasos posteriores a la adquisición de datos están en gran medida automatizados. Fundamentalmente, la optimización de un nuevo software permitió un análisis automatizado e imparcial que requiere una intervención humana mínima. Si bien existen otros métodos de seguimiento de partículas 43,44,45, este estudio utiliza un software patentado porque era algorítmicamente adecuado para abordar los desafíos particulares de este conjunto de datos en particular. El software ahora está disponible para los usuarios para una variedad de aplicaciones. Específicamente, el uso del filtrado de difusión que mejora la coherencia⁴⁶ es integral para la segmentación automatizada y la eliminación de fondo, y se implementan algoritmos personalizados específicamente para automatizar la detección y el seguimiento de partículas. Esta estrategia podría manejar de manera efectiva la baja relación señal-ruido inherente a los datos de este estudio, así como otros desafíos, como el movimiento de los cometas EB1-GFP a través de diferentes planos focales. Si bien no es factible probar exhaustivamente el rendimiento de este software en comparación con todos los demás software de análisis de partículas, el rendimiento de la presente estrategia igualó o se acercó al rendimiento humano estándar. Además, hasta donde saben los autores, no ha habido ningún otro software entrenado específicamente con datos in vivo de dendritas sensoriales y el terminal presináptico. Dado que el rendimiento de los algoritmos de análisis de imágenes es a menudo muy específico de los datos para los que fueron diseñados y que la visión generalizada por computadora aún no es posible, se espera que el entrenamiento del software descrito para los datos in vivo específicos de interés sea el enfoque más racionalmente sólido.

Dado el extenso trabajo sobre las MT dendríticas 22,23,24,25,26,27, así como la calidad constante de los datos que se pueden adquirir de este sistema, la estrategia de adquisición de imágenes y análisis de software se validó por primera vez en dendritas sensoriales de Drosophila. Es importante destacar que se encontró en las dendritas que el uso de diferentes controladores neuronales de Gal4, incluso en fondos de tipo salvaje idénticos, da como resultado diferencias significativas en la dinámica de EB1-GFP debido a las diferencias en el fondo genético, lo que enfatiza la importancia de usar un solo controlador de Gal4 para obtener resultados consistentes. Esta estrategia se utilizó posteriormente para el análisis multiparamétrico de la dinámica de EB1-GFP en el terminal presináptico de la NMJ. Para ilustrar aún más el valor investigativo de este método, se utilizó esta estrategia de imagen y software para evaluar la dinámica pre y postsináptica de EB1-GFP después de la eliminación de dTACC, el homólogo de Drosophila de la familia TACC (bobina en espiral ácida transformante) altamente conservada^47,48. El trabajo previo en las células^{S2 de} Drosophila 40, así como el trabajo de Lowery y sus colegas en el cono de crecimiento de Xenopus 49,50,51, han demostrado que los miembros de la familia TACC regulan la dinámica del extremo positivo de la MT. Además, la evidencia reportada recientemente de imágenes de inmunofluorescencia confocal y de súper resolución mostró que dTACC es un regulador clave de las MT presinápticas durante la morfogénesis neuronal⁵², lo que plantea la pregunta de si dTACC regula la dinámica de la MT en vivo. Este informe demuestra un método que puede detectar diferencias en los comportamientos de MT en vivo tras el derribo de dTACC. Por lo tanto, este estudio presenta un método in vivo que puede identificar y caracterizar de manera efectiva los reguladores clave de la dinámica de MT dentro de la neurona en desarrollo, particularmente en el compartimento presináptico.

Protocol

1. Generación de ejemplares de Drosophila

1. Seleccione un marcador de extremo superior MT adecuado. En este estudio se utilizó EB1 marcado con GFP, un marcador de extremo positivo bien caracterizado con una señal fuerte y clara ^11,12. Las alternativas incluyen otros +TIPs como EB3^10,13, CLASP/Orbit⁵³ y CLIP-170⁵⁴.
2. Obtener o generar moscas con el marcador MT bajo el control de un promotor UAS (por ejemplo, UAS-EB1-GFP).
3. Elija el controlador Gal4 específico para tejidos adecuado. Este estudio utilizó el controlador panneuronal elaV-Gal4^58,59 para impulsar la expresión tanto en las dendritas sensoriales como en el NMJ y 221-Gal4^60,61 para la expresión específica de la dendrita.
4. Cría moscas utilizando técnicas estándar de cría de moscas^55,56. Se recomienda mantener las moscas en incubadoras humidificadas a 25 °C para una expresión óptima de Gal4/UAS.
5. Utilizando técnicas genéticas estándar de moscas^55,56, se realizan cruzamientos para generar moscas que expresen el marcador MT plus-end en las células/tejidos deseados.
   NOTA: Para cualquier combinación de controlador Gal4 y transgén, el diseño experimental debe incluir experimentos de prueba de concepto y validación para caracterizar el sistema y evitar artefactos de sobreexpresión.

2. Configuración del equipo

1. Instale una estación de trabajo, que incluya las moscas, los reactivos anestésicos, los materiales de construcción de portaobjetos, el microscopio estereoscópico y la fuente de iluminación, cerca del microscopio confocal (es decir, en la misma habitación) para minimizar el tiempo que transcurre entre la preparación de la muestra y la obtención de imágenes para prolongar la salud y la viabilidad de las larvas.
2. Prepare el anestésico mezclando una mezcla de cloroformo al 9% (0,1 mL de cloroformo y 1,0 mL de aceite de halocarbono) en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Para evitar la separación, mezcle bien invirtiendo el tubo antes de preparar cada nuevo portaobjetos.
3. Prepare la diapositiva de vidrio: Corte cuatro tiras de cinta adhesiva de doble cara (~15 mm de ancho). Alinee dos de las piezas en el portaobjetos de vidrio, dejando un espacio de ~5 mm entre las tiras. Coloque las dos piezas restantes encima de las dos primeras para duplicar el grosor de la cinta (Figura 1C).
4. Agregue una gota grande (~ 100 μL) de la mezcla de cloroformo / aceite en el portaobjetos de vidrio en el espacio de 5 mm entre las piezas de cinta (Figura 1C).

3. Preparación de muestras de larvas para la obtención de imágenes

1. Llene un recipiente (por ejemplo, una placa de 6 pocillos) con 1x PBS.
2. Recoja las larvas del^3er estadio del frasco de mosca con pinzas o un instrumento similar. Identifique las larvas en la etapa adecuada por su comportamiento de rastreo y por la presencia de 9 a 12 ganchos bucales prominentes y dentados. Utilice un microscopio estereoscópico para ayudar a estadificar las larvas (Figura 1D).
3. Coloque una larva en el PBS y muévala suavemente para lavar cualquier resto de comida u otros desechos. Seque la larva suavemente sobre un pañuelo delicado.
4. Anestesiar la larva colocándola en una gota de cloroformo/aceite en el portaobjetos de la sección 2 (Figura 1C).
   NOTA: La orientación dorsal/ventral de la larva no es crítica porque tanto las neuronas sensoriales como las motoras se pueden detectar a través de la cutícula translúcida ajustando la platina del microscopio al plano focal adecuado, independientemente de la orientación del espécimen.
5. Coloque un cubreobjetos # 1.5 en la parte superior. Adherir el cubreobjetos a la cinta aplicando una presión suave, inmovilizando así la larva sin dañarla (Figura 1C).
6. Sella la cámara con vaselina o esmalte de uñas.

4. Imágenes confocales de lapso de tiempo de muestras vivas

1. Prepare el microscopio confocal y la lente del objetivo de 60x con inmersión en aceite. Coloque la muestra en la plataforma (Figura 1A,B).
2. Utilice el software de adquisición para configurar experimentos.
   NOTA: Para este estudio, cada serie de imágenes se adquirió en un solo plano focal en lugar de una pila z.
   1. Establezca la duración del lapso de tiempo en 30 s en un intervalo de 2 s, para un total de 16 fotogramas.
   2. Ajuste la exposición y la intensidad del láser para garantizar una señal suficiente y evitar la saturación y el fotoblanqueo.
   3. Para las imágenes EB1-GFP, el láser de 488 nm se ajustó a un tiempo de exposición de 100 ms y una intensidad del 30%. Estos valores pueden variar para diferentes usos de este protocolo y deben modificarse empíricamente.
3. Utilice los oculares del microscopio para encontrar la larva con una iluminación verde de campo amplio. Encuentre las dendritas o NMJ ajustando la etapa lentamente. No exponga la larva a la iluminación (de campo amplio o confocal) durante más tiempo del necesario.
   1. Las dendritas aparecen como delgadas redes de nervios de color verde brillante que se distinguen fácilmente de los gruesos y largos haces de axones (Figura 1E).
   2. Las NMJ aparecen como grupos de botones individuales de color verde brillante, de aproximadamente 5 μm de diámetro, en los extremos de haces de axones largos y gruesos que divergen del cordón nervioso (Figura 1F).
4. Con la transmisión de la cámara en vivo, concéntrese rápidamente en la región de interés con la iluminación de 488 nm. Detenga inmediatamente la iluminación una vez que se encuentre el enfoque adecuado para evitar la fototoxicidad.
5. Iniciar la adquisición de imágenes. Los cometas EB1 son reconocibles como brillantes y móviles punctae.
6. Consulte los protocolos publicados anteriormente para obtener detalles adicionales y directrices sobre las imágenes de fluorescencia en vivo⁵⁷.

5. Procesamiento y análisis de imágenes basado en software

1. Analice cada archivo de video individualmente. Dentro del software (interfaz de usuario que se muestra en la Figura 2), seleccione Archivo | Importación | Secuencia de imágenes y arrastre los archivos TIF en el cuadro que aparece. Vista previa del video.
2. En el menú Parámetros de detección , ajuste los parámetros del software para garantizar la detección solo de puntos claramente visibles y evitar la detección de objetos espurios. Por ejemplo, la reducción de la intensidad de las partículas da como resultado una mayor sensibilidad del software a los puntos, pero aumenta los posibles falsos positivos. Los valores precisos de los parámetros variarán empíricamente. Las descripciones de los parámetros de detección y seguimiento están disponibles a petición de los autores.
3. Aplique la receta de seguimiento de partículas neuronales para analizar la imagen con el botón Desde el principio (flecha azul, Figura 2B). El software enviará los resultados de los parámetros de seguimiento enumerados en la Tabla 1 a la hoja de cálculo de resultados (cuadro verde, Figura 2B). Para facilitar el análisis y la interpretación posteriores, los resultados se pueden almacenar en un software de hoja de cálculo utilizando la función Exportar que se encuentra en la sección Hoja de cálculo de resultados .
4. Desplácese con el cursor hasta los puntos detectados en el paso anterior y haga clic con el botón izquierdo para seleccionar o anular la selección. Se pueden seleccionar varios puntos simultáneamente usando Ctrl + clic izquierdo.
   NOTA: Dependiendo de los objetivos y aplicaciones del proyecto, se pueden utilizar heurísticas adicionales para filtrar los puntos. Por ejemplo, los puntos con una vida útil de menos de 8-10 s (4-5 fotogramas) pueden omitirse porque no presentan suficiente información sobre todo el evento de crecimiento. La necesidad de tales heurísticas variará empíricamente. Los autores pueden solicitar detalles adicionales sobre la funcionalidad del software.

Results

Las moscas se criaron a partir de stocks estables que expresan constitutivamente el transgén UAS-EB1-GFP ya sea panneuronalmente (elaV-Gal4; UAS-EB1-GFP)^58,59 o en neuronas sensoriales (221-Gal4; UAS-EB1-GFP)^60,61. Se eligió EB1 para este estudio porque se localiza específicamente en los extremos en crecimiento y se disocia inmediatamente después de la pausa y la contracción

Discussion

En este artículo se discute un protocolo para realizar imágenes intravitales no invasivas de la dinámica de la MT en las dendritas y en la NMJ durante el desarrollo. Se requiere la participación humana durante las etapas experimentales, como en la selección de animales para obtener imágenes, y puede introducir sesgos en el proceso de recopilación de datos que no se pueden eliminar razonablemente. Por lo tanto, un objetivo clave del protocolo es minimizar el sesgo siempre que sea posible ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tubo de microcentrífuga de 1,5 mL	Eppendorf	21008-959 Preparación de	muestras
1000 µ L TipOne puntas de pipeta	USA Scientific	1111-2721 Preparación de	muestras
200 µ L TipOne puntas de pipeta	USA Scientific	1120-8710 Preparación de	muestras
221-Gal4 moscas	Bloomington Drosophila Stock Center (US)	26259	Drosophila genética/cruces
60x Objetivo Lente	Nikon	Plan Apo 60x Óleo	Adquisición de imágenes
Placa de 6 pocillos	BD Falcon	353224	Preparación de muestras
Agar	MoorAgar	41084	Alimento para Drosophila
Aivia	DRVision LLC		Optimizado como parte de este estudio
Cloroformo (estabilizado con amilenos)	Sigma-Aldrich	C2432	Preparación de muestras
Pistola de CO2 (para la selección de moscas para los cruces)	Genesee	54-104	Genética/cruces de Drosophila
Burbujeador de CO2 (para la selección de moscas para los cruces)	Genesee	59-180	Genética/cruces de Drosophila
Cámara CCD refrigerada	Hamamatsu	ORCA-R2	Adquisición de imágenes
Harina de maíz	Genesee	62-101	Alimento para Drosophila
Agua			Alimento para Drosophila
Cinta adhesiva de doble cara	Whisky Preparación		muestras
Viales de Drosophila	Genesee	32-109	Alimento para Drosophila
Tapones Droso-tapones (tapones de espuma para viales)	Genesee	59-200	Drosophila food
Dumont #5 Biologie Inox Fillps	Fine Science Tools	11252-20	Preparación de muestras
elaV-Gal4; UAS-EB1-GFP; Moscas UAS-Dcr2	Regalo de Melissa Rolls (Universidad Estatal de Pensilvania)	N/A	Genética/cruces de Drosophila
Etanol (95%)	VWR	75811-022	Alimento para Drosophila
Iluminador de fibra óptica/fuente de luz para microscopio estereoscópico	Nikon	NI-150 Preparación de	muestras
Flypad (para selección de moscas para cruces)	Genesee	59-172	Genética/cruces de Drosophila
Forma Cámara/incubadora ambiental	ThermoFisher	3940	Drosophila genética/cruces Aceite de
halocarbono 700	Sigma-Aldrich	H8898	Preparación de muestras
Aceite de inmersión	Nikon	MXA22168	Adquisición
de imágenes Toallitas delicadas Kimwipe Fisher	Scientific	34120	Preparación de muestras
Módulo de fusión láser	Spectral Investigación Aplicada	LMM-5	Adquisición de imágenes
Fuente de luz para Confocal	Lumencor	SOLA 54-10021	Adquisición de imágenes
Microscopía MetaMorph Automatización & Software de análisis de imágenes	Molecular Devices Adquisición		imágenes
Micro Cubreobjetos, Cuadrados, Nº 1 1/2 (#1.5)	VWR	48366-205 Preparación de	muestras
Microscopio invertido motorizado con sistema de enfoque perfecto	Nikon	TI-ND6-PFS-S	Adquisición de imágenes
Platina y obturadores motorizados	Prior	Proscan III	Adquisición
de imágenesTijeras multiusos	Scotch	MMM1428	Preparación de muestras
Esmalte de uñas	Sally Hansen	784179032016 074170382839	Preparación de muestras
Filtro óptico	Chroma	ET480/40m	Adquisición de imágenes
P1000 Pipetman	Gilson	F123602	Preparación de muestras
P200 Pipetman	Gilson	F123601	Preparación de muestras
PBS (10X) ph 7.4	ThermoFisher	70011044	Preparación de muestras
Ácido propiónico	Fisher	A258-500	Drosophila
food Unidad de escáner confocal de disco giratorio	Yokagawa	CSU-X1	Adquisición de imágenes
Microscopio estereoscópico	Nikon SMZ800N		Preparación de muestras
Azúcar (sacarosa)	Genesee	62-112	Alimento para Drosophila
Superfrost Slide	VWR	48311-600 Preparación de	muestras
Tegosept	Genesee	20-258	Alimento para Drosophila
Moscas UAS-dtacc-RNAi	Viena Centro de Recursos de Drosophila (Viena, Austria)	VDRC-101439	Genética/cruces de Drosophila
Vaselina vaselina	DVOCB311003 WB Mason		Preparación
de la muestraWinsor & Pincel Newton Regency Gold 520, tamaño 0	grapas	5012000	Genética/cruces de Drosophila
Levadura	VWR	Torula Levadura IC90308580	Drosophila alimento
Yokogawa dichroico divisor de haz	Semrock	Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5	Adquisición de imágenes