Clarificación primaria del fluido de cultivo celular cosechado con CHO utilizando un separador acústico

Un paso crítico en un proceso de biofabricación que involucra proteínas terapéuticas secretadas es la eliminación de biomasa del fluido de cultivo celular cosechado (HCCF). Tradicionalmente, los biofabricantes han adoptado la centrifugación seguida de la filtración en profundidad como sus principales métodos de clarificación en la producción de anticuerpos monoclonales¹. Sin embargo, la centrifugación puede conducir a un alto estrés cortante en las células, lo que resulta en un aumento de los desechos celulares en el HCCF. Esto puede conducir potencialmente a ensuciamiento del filtro durante la filtración y dar lugar a contaminantes adicionales después de la filtración que posteriormente pueden reducir la eficiencia de la cromatografía aguas^{abajo 1,2,3}. Además, la personalización de las centrifugadoras para un determinado proceso puede ser costosa y puede requerir conexiones adicionales a sistemas de limpieza in situ y esterilización in situ que también pueden ser un factor limitante para la escalabilidad. El uso de filtros de profundidad puede compensar las limitaciones de la centrifugación y también aprovechar la tecnología de un solo uso⁴. Sin embargo, los filtros de profundidad se utilizan principalmente como clarificación secundaria porque no pueden soportar altas densidades de cultivo celular⁵. Alternativamente, se han empleado dispositivos de retención celular de filtración de flujo tangencial (TFF) para mitigar el estrés cortante, pero pueden experimentar desafíos como la polarización de la membrana y los bajos rendimientos de cosecha⁶. Los problemas anteriores que surgen del uso de la centrifugación más la filtración de profundidad o TFF crean una oportunidad para la mejora del proceso de clarificación primaria de HCCF.

La separación acústica se introdujo como una tecnología que se puede utilizar para cosechar proteínas secretadas de cultivos celulares con productos proteicos de alta calidad^7,8. La separación acústica se logra a través de la propagación y reflexión de ondas estacionarias multidimensionales que interactúan con fluidos suspendidos y partículas retenidas^9,10. Estas partículas experimentan tres fuerzas: arrastre de fluidos, gravedad y radiación acústica. Cuando cada una de las fuerzas se oponen por igual entre sí, alcanzando el equilibrio, las partículas quedan suspendidas y atrapadas dentro de la onda estacionaria ultrasónica¹⁰. En una suspensión de cultivo celular, las células se mantienen dentro de este plano de nodo de presión de ondas estacionarias, el nodo crece a medida que las células se fusionan y, finalmente, estos grupos de nodos celulares caen de la fuerza gravitacional⁹. Estas células sedimentadas se eliminan de los medios, lo que permite que los medios clarificados se bombeen para su posterior procesamiento aguas abajo. La utilización de ondas ultrasónicas como método de separación ha comenzado a traducirse en aplicaciones biológicas que van desde la separación de partículas lipídicas y glóbulos rojos¹¹ hasta el cultivo celular de perfusión de mamíferos¹². Con sus capacidades relativas para reducir los costos, la mano de obra y el estrés celular al evitar la centrifugación, la filtración en profundidad o TFF, los biofabricantes están explorando las aplicaciones potenciales del uso de la separación acústica.

Este estudio proporciona un protocolo general para operar un separador de ondas acústicas (AWS) de sobremesa para la clarificación del cultivo celular CHO, presenta datos representativos y demuestra cómo lograr una clarificación celular efectiva y la recuperación del producto.

1. Preparación de AWS

NOTA: Este protocolo fue desarrollado utilizando una cámara acustoforética. Sin embargo, el AWS a escala de banco tiene cinco sondas de turbidez que pueden operar 4 cámaras acustoforéticas en serie si es necesario.

1. Conecte los cables de turbidez en sus respectivos puertos etiquetados como F, 1, 2, 3, 4 (por ejemplo, la sonda de turbidez 1 en la Figura 1c y el puerto 1 en la Figura 2a)y los cables BNC de alimentación de la cámara a la parte posterior del sistema AWS etiquetados como 1, 2, 3, 4(Figura 2b).
   NOTA: No conecte el otro extremo del cable BNC de alimentación de la cámara (Figura 3c) a la parte posterior de la cámara acustoforética (Figura 3d) hasta el paso 2.6 cuando la cámara esté llena de líquido. Si la alimentación de la cámara se enciende sin líquido en la cámara, dañará el transductor piezoeléctrico de la cámara y dejará de funcionar.
2. Inserte las sondas de turbidez en el medidor de turbidez y la carcasa del termómetro y apriete los tornillos(Figura 1c y Figura 3).
3. Conecte el tubo de alimentación a la entrada del puerto de turbidez de alimentación (Figura 4a) a través de la bomba de alimentación (Figura 1b a 1c).
4. Conecte el tubo en Y desde la salida del puerto de turbidez de alimentación(Figura 4b)a los puertos de entrada de la cámara acustoforética(Figura 4c).
5. Conecte el tubo de la etapa 1 desde el puerto de desechos de la cámara acustoforética (Figura 4d) a través de la bomba de la etapa 1 a un recipiente de recolección de celdas (Figura 1d a través de 1e a 1f).
6. Conecte el tubo desde el puerto de permeado de la cámara acustoforética (Figura 4e) a la entrada del puerto de turbidez de la sonda1 (Figura 4f).
7. Conecte el tubo de cosecha desde fuera del puerto de turbidez de la sonda1 (Figura 4g) a un recipiente de recolección de productos (Figura 1c a 1g).

2. Prepara el sistema con HCCF

NOTA: Este protocolo se desarrolló utilizando células CHO-K1 cultivadas en un medio definido químicamente (ActiCHO P con 6 mM L-glutamina) produciendo el modelo de anticuerpo monoclonal IgG1 VRC01¹³ y puede necesitar ser ajustado para otras líneas celulares y productos. El HCCF utilizado en este protocolo se obtuvo al final de 7-8 días de cultivos CHO-K1 a partir de un matraz agitador o un proceso de biorreactor.

1. Encienda el AWS activando los interruptores de encendido en la parte posterior y delantera del AWS.
2. Encienda la computadora y haga doble clic en el icono del escritorio para el software asociado (consulte tabla de materiales). Desde el panel "Lecturas", pulse el botón "Iniciar prueba" para iniciar la grabación de datos(Figura 5). Una vez que se inicia el registro de datos, todos los datos recopilados se registrarán en una hoja de cálculo exportable hasta que se detenga la prueba.
3. Conecte el extremo del tubo de alimentación en el recipiente HCCF que se está agitando.
4. Inicie la bomba de alimentación introduciendo la velocidad de la bomba en la pantalla "Controles" dentro de la " Imagen de labomba de alimentación" y pulse "Intro" en el teclado. Asegúrese de que el "Icono de flecha de direcciónde la bomba " (en el sentido de las agujas del reloj o en el sentido contrario a las agujas del reloj) esté correctamente seleccionado en el cuadro gris a la derecha de la imagen de la bomba de alimentación para bombear HCCF desde el recipiente a la cámara acustoforética. Haga clic en el "Icono detriángulo " junto a las palabras "Encender" dentro del cuadro gris debajo de la imagen de la bomba de alimentación para "Iniciar" la bomba (Figura 6a).
   NOTA: La velocidad máxima de la bomba es de 10 L/h (167 mL/min), pero se recomienda que el caudal nominal, 60 mL/min, se utilice para este paso para llenar rápidamente la tubería y la cámara sin correr el riesgo de llenar en exceso la cámara antes de comenzar la separación.
5. Monitoree las mediciones de turbidez de alimentación observando el "Panel de Reducción porcentual" ( Figura5c) durante el llenado de la cámara acustoforética. Los valores de turbidez se mantendrán constantes durante la carga de la cámara si el HCCF se mezcla lo suficiente en el recipiente HCCF.
6. Una vez que el líquido esté por encima del transductor piezoeléctrico en la parte posterior de la cámara acustoforética, presione "Apagar" dentro de la caja gris debajo de la imagen de la bomba de alimentación para detener la bomba. Conecte el cable de alimentación BNC (Figura 3c) a la cámara acustoforética (Figura 3d).
   NOTA: El volumen de retención de cada cámara acustoforética es de alrededor de 190 ml.

3. Funcionamiento de AWS

1. Una vez que la cámara acustoforética esté llena y el cable de alimentación BNC esté conectado a la parte posterior de la cámara acustoforética, cambie la velocidad de la bomba de alimentación a la velocidad de funcionamiento deseada(Figura 6a y Tabla 1). Se deben probar varias velocidades de bomba de alimentación para identificar los parámetros de funcionamiento ideales para un proceso determinado.
2. Encienda la potencia piezoeléctrica del escenario1 deslizando la barra del módulo de alimentación a 10 W(Figura 6d)y presionando el icono "Encender "en el lado derecho del cuadro del Escenario 1(Figura 6c). Según lo sugerido por el fabricante, use 10 W, la configuración de potencia recomendada para las celdas CHO. Esto generará una frecuencia fija de 2 MHz para su operación. Después de varios segundos, las células comenzarán a agruparse visiblemente en los nodos de onda en la cámara acustoforética(Figura 7a).
3. Una vez que las células comienzan a asentarse en el fondo de la cámara acustoforética(Figura 7b),inicie la bomba de etapa 1 con una velocidad adecuada basada en la densidad de la celda y la velocidad de la bomba de alimentación(Figura 6b). Sobre la base de la hoja de cálculo de optimización y operación de estado estacionario del fabricante, la velocidad de la bomba de la etapa 1 se puede calcular en función de la masa de la celda empaquetada y la tasa de flujo de alimentación utilizando la siguiente ecuación
   
   1. Para calcular la masa celular empaquetada, tara una escala con un tubo vacío de 15 ml (u otro tubo compatible con centrifugación). Llene el tubo con material de alimentación y registre el peso total del tubo con alimentación. Centrifugar el tubo durante 10 min a 3.700 x g. Decanta el sobrenadante en un recipiente separado. Mida el peso del tubo con el pellet celular. El porcentaje de masa celular empaquetada de la materia prima de alimentación = (peso del tubo decantado/peso del tubo lleno) x 100%.
4. Monitorizar el perfil de turbidez de la turbidez en estadio1 a medida que el desbordamiento de la cámara acustoforética entra en la sonda de turbidez1 (Figura 8).
5. A medida que la separación celular continúe, la eficiencia de la eliminación celular aumentará.
6. Además, controle la diferencia de temperatura entre la alimentación y la etapa1, ya que aumentará a medida que continúe la separación celular(Figura 9). La temperatura puede aumentar cuando se utiliza una alimentación de mayor densidad celular, pero generalmente se puede reducir alterando la tasa de flujo de alimentación.
   NOTA: Cuando se utilizan múltiples cámaras acustoforéticas, se puede conectar secuencialmente el tubo de la cámara acustoforética anterior a través de sondas de turbidez a la entrada de la cámara acustoforética actual. Además, se puede conectar el tubo de etapa desde el fondo de las cámaras acustoforéticas a través de bombas de etapa a los recipientes de recolección de células. Un total de cuatro cámaras acustoforéticas se pueden conectar en serie para una eficiencia óptima de eliminación celular si es necesario.

4. Finalización de AWS

1. Cuando termine la carrera, detenga la alimentación y la bomba de la etapa 1 presionando Apagar dentro de la caja gris debajo de la bomba de alimentación y las imágenes de la bomba de la etapa 1, respectivamente, para detener las bombas.
2. Apague la alimentación de la cámara presionando Apagar en el lado derecho de la caja de la Etapa 1 y desconecte el cable de alimentación BNC.
3. Tome el material de cosecha del producto recolectado para procedimientos de clarificación y purificación adicionales, como métodos de filtración en profundidad y cromatografía. Deseche el material de cosecha celular.
4. Drene el líquido restante en la cámara acustoforética colocando el tubo de desechos en un recipiente vacío, desconectando el tubo de la entrada de la cámara acustoforética y los puertos de permeo y liberando el tubo de desecho del cabezal de la bomba.
5. Vuelva a conectar el tubo, vuelva a colocar el tubo de desecho en el cabezal de la bomba y fluya a través del agua DI desde el extremo del tubo de alimentación utilizando una velocidad de bomba de alimentación de 60 ml / min y una velocidad de bomba de etapa 1 de 60 ml / min. Continúe durante 15-20 minutos. Descarta el flujo a través.
6. Bombee alcohol isopropílico (IPA) al 70% a través del tubo y la cámara utilizando la bomba de alimentación durante 15-20 min. Descarta el flujo a través.
7. Repita el procedimiento de limpieza con agua DI para limpiar los tubos y la cámara utilizando la bomba de alimentación durante 15-20 min. Descarta el flujo a través.
8. Desmonte el tubo de las sondas de turbidez y cámaras acustoforéticas y limpie el área con 70% de IPA.
9. Desmonta las sondas de turbidez y limpia el interior de las sondas de turbidez con un 70% de IPA. Deje que todas las piezas se sequen al aire y luego vuelva a ensamblarlas para el siguiente uso.
   NOTA: Las cámaras acustoforéticas se fabrican para un solo uso, pero se pueden reutilizar si se manipulan y limpian adecuadamente como se describe en este protocolo.

Como se describe en el protocolo, el AWS se utilizó para aclarar HCCF a una densidad de 12,4 x 106 celdas/ml, como se muestra en la Figura 1. La bomba de alimentación se ajustó a 3,5 ml / min (5 L / día), lo que representa una tasa de sangrado celular dentro del rango adecuado presumible para un cultivo de 10-20 L. A medida que el HCCF entró en la cámara AWS, las mediciones de turbidez de la sonda de turbidez de alimentación se mantuvieron consistentes, alrededor de 1.000-1.100 NTU, y las mediciones de la sonda de turbidez de la sonda de sonda1 se mantuvieron alrededor de 40-50 NTU(Figura 8). Usando las dos mediciones, la eficiencia de eliminación de células

se calculó y promedió el 95%. Se encontró que una medición de turbidez de 40-50 NTU era el nivel mínimo de turbidez alcanzable y, por lo tanto, no era factible una mayor separación de una cámara DE AWS adicional en serie.

Si bien el AWS podría separarse con alta eficiencia a tasas de flujo más bajas, mantener el HCCF durante más tiempo dentro de la cámara causó aumentos de temperatura, lo que debe ser una consideración al seleccionar tasas de flujo más bajas. La Figura 9 es un ejemplo de la diferencia de temperatura del HCCF antes de entrar en la cámara acustoforética y después de la separación acústica a un caudal de alimentación de 3,5 mL/min, que mostró un aumento de temperatura de >6 °C debido al tiempo prolongado dentro de la cámara acústica.

Otra consideración importante al ejecutar cosechas de alta densidad celular (es decir, >20 x 106 células / ml) es la saturación de las sondas de turbidez. Las mediciones de turbidez para la sonda de turbidez de alimentación se saturaron en más de 4.400 NTU(Figura 10),lo que puede resultar en una subestimación en el cálculo de la eficiencia de eliminación celular.

Para probar el efecto de las diferentes velocidades de alimentación en la clarificación celular, se midió la eficiencia de eliminación de células a diferentes velocidades de alimentación. Como se muestra en la Figura 11,la eficiencia de eliminación de celdas disminuyó significativamente de ~ 100% a 57% a medida que aumentaba la velocidad de la bomba de alimentación. En general, cuanto más lenta sea la velocidad de la bomba de alimentación, mejor será la clarificación de la celda. Sin embargo, se recomienda la optimización de la velocidad de alimentación para cada aplicación.

Figura 1: Configuración de AWS. Una vez que las bombas se encendieron con el software(a ), el HCCF se canalizó a través de una bomba de alimentación (b) a través de la sonda de turbidez de alimentación (c) y luego a la cámara AWS (d). Dentro de la cámara, las fuerzas acústicas atraparon las células del flujo en los nodos de las ondas y causaron aglomeraciones. La disminución de la flotabilidad hizo que las células cayeran a través de la fuerza gravitacional, y las células se eliminaron del puerto de desechos de la cámara acustoforética a través de la bomba de etapa 1 (e) a una botella de cosecha celular (f) mientras que el material clarificado salió a la sonda de turbidez de la sonda(c)a través del puerto de permeado de la cámara a una botella de cosecha de producto (g). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Parte posterior del sistema AWS. Las sondas de turbidez y las cámaras están conectadas a sus respectivospuertos en la parte posterior del sistema AWS a través de cables Ethernet (a) y BNC(b)de alimentación de cámara. Además, la computadora está conectada a través del cable ethernet de la PC (c). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Sondas de turbidez y carcasa. Cada sonda de turbidez(a ) debe insertarse correctamente en el medidor de turbidez y la carcasa del termómetro respectivos (b) y apretarse con los tornillos. El cable BNC de alimentación de la cámara (c) debe conectarse a la parte posterior de la cámara acustoforética (d) solo después de que el transductor piezoeléctrico de la cámara se llene de líquido. Las sondas se indican de la siguiente manera: F = turbidez de alimentación, 1 = turbidez de la sonda 1, y 2, 3 y 4 son sondas no utilizadas (o se pueden usar para serializar el procedimiento). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Conexión entre la carcasa de turbidez y la cámara acustoforética. El tubo de alimentación está conectado a la entrada del puerto de turbidez dealimentación( a ) a través de la bomba de alimentación. La salida del puerto de turbidez de alimentación (b) se conecta a los puertos de entrada de la cámara acustoforética (c) a través de tubos en y. El tubo de la etapa 1 se conecta desde el puerto de desechos de la cámara acustoforética (d) a través de la bomba de la etapa 1 a un recipiente de recolección de celdas. El puerto de permeado de la cámara acustoforética (e) está conectado a la entrada del puerto de turbidez de la sonda1 (f). El tubo de cosecha está conectado desde fuera del puerto de turbidez de la sonda1 (g) a un recipiente de recolección de productos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Panel de lecturas en el software Del separador acústico. El programa cuenta con dos paneles, "Lecturas" y "Controles". Dentro del panel "Lecturas", se monitorean la turbidez(a ), la temperatura (b) y el porcentaje de reducción (c). Para iniciar la grabación de datos, se debe hacer clic en el botón "Iniciar prueba"(d),que cambiará el color del botón a verde. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Panel de controles en el programa. Dentro del panel "Controles", las bombas se pueden encender o apagar, y la velocidad de bombeo se puede cambiar para la alimentación (a) y otras etapas (b). Además, la alimentación de la cámara en el transductor piezoeléctrico se puede encender o apagar(c)y cambiarse con una barra deslizante(d). Los experimentos utilizaron 10 W, porque es el ajuste de potencia recomendado para las células CHO según lo recomendado por el fabricante. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: Cámara de AWS. Una vez que las células estaban dentro de la cámara, las fuerzas acústicas atrapaban las células en nodos de ondas y hacían que las células se agruparan (a). Estos grupos celulares aumentaron de tamaño hasta que perdieron su flotabilidad y finalmente se asentaron por la fuerza gravitacional (b). A continuación, las células asentadas se retiraron del puerto de desechos de la cámara acustoforética a través de la bomba de etapa 1 a una botella de cosecha de células (c). El producto salió de la cámara a través del puerto de permeado (d), mientras que HCCF llenó continuamente la cámara a través de los puertos de entrada (e). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 8: Mediciones de turbidez para un cultivo celular CHO de 12 x10 6 celdas/ml con una velocidad de bomba de alimentación de 3,5 ml/min. La turbidez de alimentación (azul) fue de aproximadamente 1,000 NTU y el permeado que salió del medidor de turbidez de etapa 1 (naranja) fue de 40 a 60 NTU. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 9: Mediciones de temperatura para un cultivo de células CHO de 12 x10 6 celdas/ml con una velocidad de bomba de alimentación de 3,5 ml/min. La temperatura de alimentación (azul) fue de aproximadamente 21 ° C y el permeado que salió del medidor de turbidez de la etapa 1 (naranja) fue de aproximadamente 27 ° C. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 10: Ejemplo de medición de turbidez para una muestra de alta densidad celular. Cuando la densidad celular fue de >20 x 106 células/ml, la medición de la turbidez de alimentación se saturó al valor máximo de 4.400 NTU, lo que resultó en una subestimación de la eficiencia de eliminación celular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 11: Comparación de la eficiencia de eliminación de células. A medida que aumentaba la velocidad de alimentación, la separación celular disminuía. Por lo tanto, a medida que aumentaba la velocidad de alimentación, la eficiencia de clarificación celular disminuía. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Condiciones de funcionamiento. Las condiciones de funcionamiento recomendadas por el fabricante de AWS para el caudal, el rango de presión, el fluido de alimentación y la temperatura de funcionamiento.

Los autores no tienen intereses financieros en los productos descritos en este manuscrito y no tienen nada más que revelar.