Este artículo presenta dos protocolos optimizados para examinar las células inmunitarias residentes y derivadas periféricas dentro del sistema nervioso central, incluyendo el cerebro, la médula espinal y las meninges. Cada uno de estos protocolos ayuda a determinar la función y composición de las células que ocupan estos compartimentos en estado estacionario y en condiciones inflamatorias.
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Artículo de método
Aislamiento de tejidos del sistema nervioso central y meninges asociadas para el análisis posterior de las células inmunitarias
En este artículo
Resumen
Resumen
El sistema nervioso central (SNC) está compuesto por el cerebro y la médula espinal y está envuelto por las meninges, capas membranosas que sirven como barrera entre la periferia y el SNC. El SNC es un sitio inmunológicamente especializado y, en condiciones de estado estacionario, el privilegio inmunitario es más evidente en el parénquima del SNC. Por el contrario, las meninges albergan una amplia gama de células residentes, incluidas las células inmunitarias innatas y adaptativas. Durante las afecciones inflamatorias desencadenadas por una lesión del SNC, la autoinmunidad, la infección o incluso la neurodegeneración, las células inmunitarias de origen periférico pueden entrar en el parénquima y residir dentro de las meninges. Se cree que estas células realizan acciones beneficiosas y perjudiciales durante la patogénesis de la enfermedad del SNC. A pesar de este conocimiento, las meninges a menudo se pasan por alto cuando se analiza el compartimento del SNC, porque los métodos convencionales de extracción de tejido del SNC omiten las capas meníngeas. Este protocolo presenta dos métodos distintos para el aislamiento rápido de tejidos murinos del SNC (es decir, cerebro, médula espinal y meninges) que son adecuados para el análisis posterior mediante técnicas unicelulares, inmunohistoquímica y métodos de hibridación in situ. Los métodos descritos proporcionan un análisis exhaustivo de los tejidos del SNC, ideal para evaluar el fenotipo, la función y la localización de las células que ocupan el compartimento del SNC en condiciones homeostáticas y durante la patogénesis de la enfermedad.
Introducción
El sistema nervioso central (SNC) es un sitio inmunológicamente especializado. El parénquima del SNC, excluyendo el espacio LCR, las meninges y la vasculatura, es considerado clásicamente como un sitio inmunoprivilegiado 1,2,3,4,5 y está relativamente desprovisto de células inmunitarias durante las condiciones homeostáticas 2,6,7. Por el contrario, las meninges, compuestas por las capas duramadre, aracnoidea y pia....
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Protocolo
Todo el trabajo con animales utiliza protocolos revisados y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Facultad de Medicina Geisel en Dartmouth.
1. Procesamiento de muestras de cerebro y médula espinal para la descalcificación
- Aislamiento de muestras de cerebro y médula espinal
- Sacrificar al ratón mediante inhalación de CO2 . Asegúrese de que el caudal deCO2 desplace entre el 10 % y el 30 % del volumen de la jaula por minuto.
- Con fórceps, levante la apófisis xifoides y corte la pared abdominal lateralmente justo debajo de la caja torác....
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Resultados
Este experimento representativo tuvo como objetivo cuantificar las células B y T y describir la localización de las células B y T en los compartimentos meníngeo y parenquimatoso del SNC en condiciones homeostáticas, así como en un modelo de EM progresiva murina (es decir, TMEV-IDD). La TMEV-IDD fue inducida en ratones hembra SJL de 5 semanas de edad mediante infección intracraneal con 5 x 106 unidades formadoras de placa (UFP) de TMEV BeAn como se describió anteriormente29.
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Discusión
Los métodos para evaluar la composición celular en el compartimento del SNC durante la homeostasis y la enfermedad son esenciales para comprender los estados fisiológicos y patológicos del SNC. Sin embargo, a pesar de servir como una barrera importante en el SNC y albergar una amplia gama de células inmunitarias, las meninges a menudo se omiten del análisis porque muchos métodos convencionales de extracción de tejidos para el cerebro y la médula espinal no permiten la recolección de estas membranas. Esta omisión es una l.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores agradecen al personal del Centro de Medicina e Investigación Comparativa (CCMR) de Dartmouth por su atención experta a los ratones utilizados para estos estudios. El Fondo de Investigación Bornstein financió esta investigación.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Papel de aluminio | cualquiera | N/A | |
| ThermoFisher Scientific | 37002D | ||
| Centrífuga | Beckman Coulter | Allegra X-12R | |
| Colagenasa I | Worthington | LS004196 | |
| Tubo cónico, 15 mL | VWR | 525-1069 | |
| Tubo cónico, 50 mL | VWR | 89039-658 | |
| Cubreobjetos | Hauser Scientific | 5000 | |
| Cryomold | VWR | 18000-128 | |
| Pinzas curvas | Fine Science Tools | 11003-14 | |
| Tubo de poliestireno desechable, 14 mL | Fisher Scientific | 14-959-1B | |
| Bisturí desechable | Fisher Scientific | NC0595256 | |
| DNAse I | Worthington | LS002139 | |
| Hielo seco | Airgas | N/A | |
| Durmont #7Forceps | Fine Science Tools | 11271-30 | |
| EDTA sal disódica dihidratado | Amresco | 0105-500g | |
| Etanol, 100% | any | N/A | |
| Suero fetal bovino (FBS) | Hyclone | SH30910.03 | |
| Tubo superior filtrante, 5 mL | VWR | 352235 | |
| Mancha de viabilidad reparable 780 | Becton Dickinson | 565388 | |
| Citómetro de flujo | Beckman Coulter | Gallios | |
| Glucosa | Fisher Chemical | D16-500 | |
| IgG anti-ratón para cabras (488 conjugados) | Jackson immunoresearch | 115-546-146 | |
| IgG antiratón para cabras (594 conjugado) | Jackson inmunoinvestigación | 115-586-146 | |
| cabra anti-conejo 488 | Jackson inmunoinvestigación | 111-545-144 | |
| cabra anti-rata 594 | Jackson inmunoinvestigación | 112-585-167 | |
| cabra anti-rata 650 | Jackson inmunoinvestigación | 112-605-167 | |
| Hank's Balnced Salt Solution (HBSS) | Corning | 21-020-CV | |
| Hemacitómetro | Andwin Scientific | 02-671-51B | |
| Hemostático | Fine Science Tools | 13004-14 | |
| HEPES (ácido sulfónico N-2-hidroxietilpiperazina-N-2-etano) | ThermoFisher Scientific | 15630080 | |
| KCl | Fisher químico | BP366-500 | |
| KH2PO4 (anhidro) | Sigma Aldrich | P5655-100G | |
| Nitrógeno Líquido | Airgas | N/A | |
| Ratón FC block (CD16/32) | Becton Dickinson | 553141 | |
| Na2HP04 (anhidro) | Fisher Chemical | S374-500 | |
| NaCl | Fisher chemical | S671-500 | |
| Aguja, calibre 25 | Becton Dickinson | 305122 | |
| Suero normal para ratones | ThermoFisher Scientific | 31881 | |
| Colador de malla de nailon | VWR | 352350 | |
| OCT | Sakura | 4583 | |
| Paraformaldehído, 20 % | Microscopía electrónica Sciences | 15713-S | Diluido al 4 % con 1 pipeta |
| PBS Pasteur, 9 pulgadas, desenchufada | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
| PBS (1x) | Corning | 21-040-CV | |
| PE Rata Anti-Ratón CD4 | Becton Dickinson | 553730 | |
| PE-CF594 Rata Anti-Ratón CD19 | Becton Dickinson | 562329 | |
| Percoll Medios de gradiente de densidad | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| PerCP-Cy5.5 Rata Anti-Ratón CD45 | Becton Dickinson | 550994 | |
| Placa de Petri, 100 mm | VWR | 353003 | |
| medidor de pH | Fisher Scientific | 13-636-AB150 | |
| Pipet-Aid | Drummond Scientific Corporation | 4-000-101 | |
| Pipeta 200 µ l | Gilson | FA10005M | |
| Puntas de pipeta, 1 mL | USA Scientific | 1111-2831 | |
| Puntas de pipeta, 200 µ l | Pipeta USA Scientific | 1111-1816 | |
| , 1 mL | Gilson | FA10006M | |
| Prolong Diamond mountant con DAPI | ThermoFisher Scientific | P36962 | |
| Rata purificada anti-ratón CD16/CD32 | Becton Dickinson | 553141 | |
| Conejo anti-ratón CD3 (clon SP7) | Abcam | ab16669 | |
| Conejo anti-ratón laminina | Abcam | ab11575 | |
| Ratón antiratas ERT-R7 | Abcam | ab51824 | |
| RPMI 1640 Corning | 10-040-CV | ||
| Pipeta serológica, 1 mL | VWR | 357521 | |
| Pipeta serológica, 10 mL | VWR | 357551 | |
| Pipeta serológica, 5 mL | VWR | 357543 | |
| Hidróxido de | sodioFisher Scientific | S318-100 | |
| Sacarosa | Fisher chemical | S5-500 | |
| Tijeras quirúrgicas | Fine Science Tools | 14001-16 | |
| Tijeras quirúrgicas, extrafinas | Roboz | RS-5882 | |
| Jeringa, 10 mL | Becton Dickinson | ||
| , 5 mL | Becton Dickinson | 309646 | |
| Trypan azul | Gibco | 15250-061 | |
| Sistema de filtrado al vacío | Millipore | 20207749 | |
| Matraz de vacío | Thomas Scientific | 5340-2L | |
| Filtro en línea al vacío | Pall Corporation | 4402 | |
| Línea de vacío | Cole Palmer | EW-06414-20 | |
| Baño de agua | ThermoFisher Scientific | Versa baño |
Referencias
- Mastorakos, P., McGavern, D. The anatomy and immunology of vasculature in the central nervous system. Science Immunology. 4 (37), 0492(2019).
- Carson, M. J., Doose, J. M., Melchior, B., Schmid, C. D., Ploix, C. C. CNS immune privilege: hiding in plain sight. Immunological Review....
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Reimpresiones y permisos
