Aquí, introducimos y describimos un método noradioactivo y no invasivo para evaluar la síntesis de proteínas de novo in vivo, utilizando el nematodo Caenorhabditis elegans y la recuperación de fluorescencia después del fotoblanqueo (FRAP). Este método se puede combinar con pantallas genéticas y/o farmacológicas para identificar nuevos moduladores de la síntesis de proteínas.
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Artículo de método
Evaluación de las tasas de síntesis de proteínas de novo en Caenorhabditis elegans
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Resumen
Resumen
Mantener un proteomo saludable es esencial para la homeostasis celular y del organismo. La perturbación del equilibrio entre el control traslacional de proteínas y la degradación instiga una multitud de enfermedades relacionadas con la edad. La disminución de los mecanismos de control de calidad de la proteostasis es un sello distintivo del envejecimiento. Los métodos bioquímicos para detectar la síntesis de proteínas de novo siguen siendo limitados, tienen varias desventajas y no se pueden realizar en células vivas o animales. Caenorhabditis elegans, siendo transparente y fácilmente modificado genéticamente, es un excelente modelo para monitorear las tasas de síntesis de proteínas mediante el uso de técnicas de imagen. Aquí, introducimos y describimos un método para medir la síntesis de proteínas de novo in vivo utilizando la recuperación de fluorescencia después del fotoblancarte (FRAP). Los animales transgénicos que expresan proteínas fluorescentes en células o tejidos específicos son irradiados por una poderosa fuente de luz que resulta en fotoblancarse de fluorescencia. A su vez, la evaluación de la recuperación de la fluorescencia significa una nueva síntesis de proteínas en células y/o tejidos de interés. Por lo tanto, la combinación de nematodos transgénicos, intervenciones genéticas y/o farmacológicas junto con imágenes vivas de las tasas de síntesis de proteínas puede arrojar luz sobre los mecanismos que median el colapso de la proteostasis dependiente de la edad.
Introducción
La síntesis y degradación de proteínas es esencial para la homeostasis organismal. Una multitud de enfermedades relacionadas con la edad son instigadas por la producción de proteínasdefectuosas 1,2. Con el fin de medir las tasas globales de traducción de proteínas, existen técnicas bioquímicas como el perfil ribosomal, que implica la secuenciación profunda de fragmentos de ARNm protegidos contra ribosomas para monitorear la expresión, así como la nueva síntesis de proteínas3. Este método, además de ser una lectura indirecta de las tasas de traslación, ya que el aumento de la asociación de ARN a los ribosomas no significa necesariamente un aumento de la traducción, tiene desventajas técnicas, como un alto costo y un requisito de una gran cantidad de material de partida. Por otro lado, los métodos basados en proteómica permiten la cuantificación directa de proteínas mediante perfiles metabólicos de pulso seguidos de análisis de espectrometría de masas4,,5. Sin embargo, se trata de un enfoque semicuantitativo con resolución temporal limitada que no se puede utilizar fácilmente in vivo. Además, el etiquetado de la proteína puede distribuirse de manera desigual en el animal/tejido de interés. Es importante destacar que ambos métodos pueden ocultar variaciones específicas de los tejidos o de las células en las tasas de traducción de proteínas en animales o tejidos enteros, respectivamente.
Caenorhabditis elegans es un organismo modelo fácil de usar que se puede cultivar en grandes cantidades6. Además, su sostenibilidad genética y transparencia permiten obtener imágenes en vivo in vivo. Este protocolo describe la metodología para detectar las tasas de síntesis de proteínas utilizando la recuperación de fluorescencia después del fotoblancarte (FRAP). Aprovechamos la expresión transgénica de proteínas fluorescentes, ya sea en todo el organismo o en tejidos/células específicos. Los animales transgénicos pueden expresar la GFP utilizando el promotor de un gen, que se expresa ampliamente/globalmente o un promotor específico del tejido para atacar tipos celulares específicos. Esta técnica se puede extender a un promotor específico para examinar las tasas de síntesis de proteínas de una proteína específica.
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Protocolo
NOTA: Tanto las fusiones transcripcionales como las traslacionales a fluoróforos se pueden utilizar para evaluar la traducción de proteínas de novo en varios tejidos. Las tasas de síntesis de proteínas se pueden evaluar para múltiples familias de proteínas que se localizan en diferentes compartimentos celulares, incluyendo citoplasma, mitocondrias y núcleo7. Las siguientes cepas se utilizan para monitorear las tasas de síntesis de proteínas globales y neuronales, N2; Ex[pife-2GFP, pRF4], ife-2(ok306); Ex[pife-2GFP, pRF4], N2; Ex[punc-119GFP, pRF4], edc-3(ok1427); Ex[punc-119GFP, pRF4], N2; Ex[psod-3GFP; pRF4]
1. Mantenimiento, sincronización y preparación de nematodos transgénicos para el seguimiento de la síntesis de proteínas de novo
- Utilice un estereomicroscopio diseccionado para evaluar las etapas del desarrollo y el crecimiento de los nematodos transgénicos de tipo salvaje (wt) y mutantes.
- Día 1: Utilice una selección de gusano para seleccionar y transferir 10 larvas L4 de animales transgénicos wt y mutantes que llevan al reportero fluorescente deseado a placas de crecimiento de nematodos (NGM) sembradas con Escherichia coli (OP50) (Tabla 1).
- Haga una elección de gusano colocando un alambre de platino en el extremo cónico de una pipeta Pasteur de vidrio fundiendo el vidrio en el sitio de contacto en un quemador Bunsen. A continuación, aplanar el extremo del alambre de platino en forma de espátula utilizando cualquier herramienta (por ejemplo, pinza o martillo ligero).
- Inocular una sola colonia de bacterias E. coli (OP50) en un matraz que contenga 50 ml de medio líquido luria-Bertani (LB) y crecer durante 10 horas a 37 oC en una incubadora de temblores (200 rpm; Tabla 1). A continuación, sembrar placas NGM con 200 l de cultivo bacteriano. Incubar las placas de semillas a temperatura ambiente durante la noche para permitir el crecimiento del césped bacteriano.
- Incubar y cultivar los nematodos a la temperatura estándar de 20 oC.
- Día 5: Las placas contienen una población mixta de gusanos transgénicos. Seleccione y transfiera 15 larvas L4 de cada cepa en placas OP50-NGM recién sembradas.
- Día 6: Realice el ensayo FRAP y monitoree la tasa de síntesis de proteínas el día 1 de la edad adulta.
- Preparar y utilizar cicloheximida que contenga placas NGM como control positivo:
NOTA: Preparar una solución en stock de cicloheximida diluyendo en agua a una concentración de 10 mg/ml. Mantener la solución de stock a 4oC.- Matar las bacterias exponiendo las placas NGM descongeladas durante 15 minutos con luz UV (222 s/cm de intensidad2).
- Añadir cicloheximida encima de placas de semillas bacterianas a 500 g/ml de concentración final en el volumen de agar.
- Deje que las placas se sequen a temperatura ambiente durante 30 minutos.
- Transfiera los nematodos transgénicos que expresen psod-3GFP en el vehículo y las placas que contienen cicloheximida.
- Incubar animales durante 2 h a una temperatura estándar de 20oC.
2. Ensayo FRAP utilizando animales transgénicos que expresan reporteros de tejido somático pife-2GFP y psod-3GFP
NOTA: Monitoree la tasa global de síntesis de proteínas en todo el cuerpo animal. Estos reporteros transcripcionales presentan diferentes niveles de expresión y se expresan omnipresentemente en múltiples tejidos somáticos, incluyendo los músculos del intestino, la faringe y la pared corporal.
- Escoja y transfiera animales transgénicos adultos de 1 día a placas NGM individuales sembradas con una caída de 20 l de OP50 en el centro.
- Retire la tapa y coloque cada placa debajo de una lente objetivo 20x de un microscopio de epifluorescencia.
- Enfoque y capture una imagen de referencia antes de fotoblanchar (pre-blanqueo).
- Fotoblecir cada muestra durante 10 minutos.
NOTA: Detenga el fotoblanqueo cuando la señal fluorescente se apague a una intensidad de 30 – 50% en relación con la imagen de pre-blanqueo. La intensidad de la luz y la duración del período de blanqueo deben ajustarse en consecuencia para el fluoróforo específico, la etapa animal y la célula o tejido que se está examinando. Debe determinarse experimentalmente la duración adecuada de la irradiación para alcanzar una extensión adecuada de la fotoblancada, ya que para los distintos especímenes debe determinarse experimentalmente. - Capturar una imagen después de fotoblanco (blanqueador).
- Mantenga a los animales en placas NGM individuales y déjelos recuperarse.
- Imagen y registro de la recuperación de cada reportero fluorescente cada 1 hora durante al menos 6 horas a un estereomicroscopio de fluorescencia.
- Alternativamente, realice una evaluación de recuperación fluorescente utilizando un microscopio de epifluorescencia (por ejemplo, AxioImager Z2).
- Evaluar cuidadosamente la salud animal por animal mediante el seguimiento de su locomoción, sensibilidad al tacto, capacidad reproductiva y supervivencia durante los próximos 3 días. Los nematodos que mostraban signos de daño después de la fotoblancada fueron excluidos de un análisis posterior.
3. Montaje de las muestras y realizar el ensayo FRAP utilizando nematodos transgénicos que expresen GFP citoplasmático pan neuronal, punc-119GFP
NOTA: Monitoree la síntesis de proteínas pan-neuronales mediante fotoblancarido dirigido en la región de la cabeza, donde se encuentra el anillo nervioso.
- Prepare almohadillas de agarosa del 2%.
- Agregue una gota de 10 l de tampón M9 al centro de la almohadilla de agarosa.
- Transfiera 5 nematodos transgénicos que expresen GFP citoplasmático pan-neuronalmente en una gota de tampón M9.
- Use una pestaña para esparcir el líquido.
NOTA: Los animales muestran movimientos reducidos en 2 minutos debido a la absorción de M9 en el agar. - Cambie la posición del nematodo para evitar la superposición mediante el uso de un pico de "pestaña".
- Coloque la muestra bajo una lente objetivo 40x de un microscopio de epifluorescencia.
NOTA: No utilice un cubreobjetos. - Enfoque y capture una imagen de referencia (pre-blanqueo).
- Fotoblecar el área de interés objetivo durante 90 segundos.
NOTA: Detenga el fotoblanqueo cuando la señal fluorescente se apague a una intensidad de 30 – 50% en relación con la imagen de pre-blanqueo. La intensidad de la luz y la duración del período de blanqueo deben ajustarse en consecuencia para el fluoróforo específico, la etapa animal y la célula o tejido que se está examinando. Debe determinarse experimentalmente la duración adecuada de la irradiación para alcanzar una extensión adecuada de la fotoblancada, ya que para los distintos especímenes debe determinarse experimentalmente. - Capturar una imagen después de fotoblanco (blanqueador).
- Agregue una gota de 10 l de tampón M9 en nematodos fotoblanes.
- Dejar que los animales se recuperen durante 5 minutos.
- Utilice el pico "eyelash" o una pipeta para transferir los nematodos a placas NGM individuales sembradas con 20 l de OP50 en el centro.
- Capture una imagen de cada muestra cada 1 hora bajo un estereofonoscopio de epifluorescencia.
NOTA: Cuente t-0 para el tiempo de recuperación después de la fotoblancada.
4. Análisis de datos de la captura de imágenes durante el ensayo FRAP
- Analizar las imágenes adquiridas utilizando software (por ejemplo, Fiji).
- Abra imágenes con el software.
- Seleccione el comando Dividir canales a través del menú desplegable Imagen y color.
NOTA: Mantenga la imagen del canal verde. - Utilice la herramienta Selección a mano alzada para establecer manualmente la región fluorescente de interés (por ejemplo, todo el cuerpo, cabeza, intestino).
- Seleccione el comando Medición a través del menú desplegable Analizar para medir la intensidad media de píxeles del área de interés para cada punto de tiempo.
NOTA: El porcentaje de recuperación de fluorescencia se calcula utilizando las imágenes de referencia capturadas después de la fotoblancada.
5. Informe de análisis estadístico
- Utilice al menos 20 – 25 nematodos de cada cepa y/o condición.
NOTA: Se deben realizar tres réplicas biológicas. - Realice la prueba t delestudiante (comparación entre dos grupos) o ANOVA (comparación entre varios grupos) para el análisis estadístico con P < 0.05 como significativo utilizando software de análisis estadístico.
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Resultados
Utilizando el procedimiento presentado aquí, se utilizaron nematodos transgénicos de tipo salvaje y mutante que expresan los siguientes reporteros somáticos, pife-2GFP, psod-3GFP y punc-119GFP, para evaluar las tasas de síntesis de proteínas de acuerdo con los protocolos respectivos. Particularmente, los gusanos mutantes de tipo salvaje y ife-2 que expresan la GFP citoplasmática a través de sus tejidos somáticos m...
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Discusión
La modulación de síntesis de proteínas es esencial para la homeostasis organismal. Durante el envejecimiento, se perturba la síntesis de proteínas globales y específicas. Estudios recientes revelan el hecho de que el equilibrio de traducción de proteínas controla directamente la senescencia y el envejecimiento no es simplemente un subproducto del proceso de envejecimiento. En particular, los componentes básicos de la maquinaria de traducción, como el factor de iniciación eucariota 4E (eIF4E), que facilita el taponamiento...
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Divulgaciones
Los autores no declaran intereses en competencia.
Agradecimientos
Agradecemos a Chaniotakis M. y Kounakis K. por la grabación y edición de vídeo. K.P. está financiado por una subvención de la Fundación Helénica para la Investigación y la Innovación (HFRI) y la Secretaría General de Investigación y Tecnología (GSRT). N.T. está financiado por subvenciones del Consejo Europeo de Investigación (ERC – GA695190 – MANNA), los Programas Marco de la Comisión Europea y el Ministerio de Educación de Grecia.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Agar | Sigma-Aldrich | 5040 | |
| Agarosa | Biozym | 8,40,004 | |
| Almohadillas de agarosa 2% | |||
| Cloruro de calcio deshidratado (CaCl2?2H2O) | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| Colesterol | SERVA Electroforesis | 17101.01 | |
| cicloheximida | Sigma-Aldrich | C-7698 | |
| Microscopio estereoscópico de disección | Nikon Corporation | SMZ645 | |
| edc-3(ok1427); Ej[punc-119GFP, pRF4] | Tavernarakis | Mantener animales a 20 ° C | |
| Microscopio de epifluorescencia | Zeiss | Axio Imager Z2 | |
| Escherichia coli OP50 cepa | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Microscopio estereoscópico de disección de fluorescencia | Zeiss | SteREO Lumar V12 | |
| Greiner Placas de Petri (60 x 15 mm) | Sigma-Aldrich | P5237 | |
| IFE-2(OK306); Ex[pife-2GFP, pRF4] | Tavernarakis | Mantener a los animales a 20 &° | |
| C software de análisis de imágenes | Fiji | https://fiji.sc | |
| KH2PO4 | EMD Millipore | 1,37,010 | |
| K2HPO4 | EMD Millipore | 1,04,873 | |
| LB medio | |||
| Tampón | |||
| M9Sulfato de magnesio (MgSO4) | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Portaobjetos de microscopio (75 x 25 x 1 mm) | Marienfeld, Lauda-Koenigshofen | 10 006 12 | |
| Microsoft Office 2011 Paquete de software Excel | Microsoft Corporation, Redmond, EE. UU | ||
| em>N2; Ex[pife-2GFP; pRF4] | Tavernarakis | Mantener animales a 20 &° C | |
| N2; Ej[psod-3GFP; pRF4] | Tavernarakis | Mantener a los animales a 20 &° C | |
| N2; Ex[punc-119GFP; pRF4] | Tavernarakis | Mantener animales a 20 ° C | |
| Na2HPO4 | EMD Millipore | 1.06.586 | |
| Placas | |||
| nistatina | Sigma-Aldrich | N3503 | |
| Peptona | BD, Bacto | ||
| EMD Millipore | 1,06,40,41,000 | ||
| Equipo estándar para la preparación de placas de agar (autoclave, placas de Petri, etc.) | |||
| Equipo estándar para el mantenimiento de lombrices (pico de alambre de platino, incubadoras, etc.). | |||
| software de análisis estadístico | GraphPad Software Inc., San Diego, EE. UU. | Paquete de software GraphPad Prism | |
| Estreptomicina | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| Reticulante UV | Vilber Lourmat BIO-LINK BLX 254 | ||
| Pico |
Referencias
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- Li, G. W., Burkhardt, D., Gross, C., Weissman, J. S. Quantifying absolute protein synthesis rates reveals principles underlying allocation of cellular resources. Cell. 157 (3), 624-635 (2014).
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