Bloqueo del flujo linfático mediante la sutura de los vasos linfáticos aferentes en ratones

La organización espacial del sistema linfático proporciona soporte estructural y funcional para eliminar eficientemente el líquido extracelular y transportar antígenos y células que presentan antígenos (APC) a los LN drenantes. Los vasos linfáticos iniciales (también llamados capilares linfáticos) son altamente permeables debido a sus uniones intercelulares discontinuas, que facilitan la recolección efectiva de líquidos, células y otros materiales de los espacios extracelulares circundantes¹. Los vasos linfáticos iniciales se funden en vasos linfáticos recolectan, que tienen uniones intercelulares estrechas, una membrana sótano continua y cobertura muscular linfática. La recolección de los vasos linfáticos son responsables de transportar la linfa recogida a los LN drenantes y eventualmente devolver la linfa a la circulación^2,3. Los vasos linfáticos recolectantes que introducen la linfa en el LN drenante son los vasos linfáticos aferentes^4,5,6,7. La obstrucción de los vasos linfáticos aferentes puede bloquear el flujo linfático hacia los LN, que es una técnica útil al estudiar la función del flujo linfático.

Estudios anteriores han demostrado que el flujo linfático juega un papel importante en el transporte de antígenos y APC, así como el mantenimiento de la homeostasis LN. Se entiende bien que los APC derivados del tejido, típicamente activados células dendríticas migratorias (DC), viajan a través de los vasos linfáticos aferentes a la LN para activar las células T^8. La idea de que los antígenos de forma libre, como microbios o antígenos solubles, fluyen pasivamente con linfa a la LN para activar los APC residentes en LN ha ido ganando aceptación en la última década^9,10,11,12. Los antígenos de forma libre que viajan con la linfa tardan minutos después de la infección para viajar al LN, y la activación de la célula residente en LN puede ocurrir dentro de los 20 minutos después de la estimulación. Esto es mucho más rápido que la activación de controladores de dominio de migración, que tarda más de 8 h en entrar en el LN⁹de drenaje. Además de transportar antígenos para iniciar la protección inmunitaria, la linfa también lleva citoquinas y DC a la LN para mantener su microambiente, y para apoyar la homeostasis de células inmunitarias^13,14. Anteriormente, el bloqueo del flujo linfático suturando los vasos linfáticos aferentes demostró que la linfa es necesaria para mantener el fenotipo HEV necesario para apoyar la célula T homeostática y la localización de células B a la LN^15,16,17. CCL21 es una quimiocina crítica que dirige el posicionamiento de células DC y T en el LN^8,18. El bloqueo del flujo linfático interrumpe la expresión CCL21 en el LN y puede interrumpir el posicionamiento y/o la interacción de los células DC y T en el LN^19. Por lo tanto, el bloqueo del flujo linfático puede abrogar directa o indirectamente el acceso de antígeno/CC al LN drenante interrumpiendo el microambiente LN que regula las respuestas inmunitarias en el LN. Para investigar mejor la función del flujo linfático, se presenta un protocolo experimental (Figura 1) para bloquear el flujo linfático en ratones suturando los vasos linfáticos aferentes desde la almohadilla hasta el pLN. Este método puede ser una técnica importante para futuros estudios sobre la función linfática en condiciones saludables y enfermas.

Todo el trabajo animal debe ser aprobado por el comité institucional y gubernamental de ética y manejo de animales.  Esta es una cirugía de no supervivencia.

1. Preparación de materiales

1. Preparar 100 ml de etanol al 70% mezclando 70 ml de etanol 100% con 30 ml de agua estéril. Autoclave todas las herramientas quirúrgicas antes de la cirugía y mantener las herramientas en 70% etanol antes y durante la cirugía para mantener la esterilización.
2. Prepare un aparato de inyección.
   1. Corte de 30 cm de tubo de polietileno (0,28 mm de diámetro). Conecte la punta de una aguja de 30 G x 1/2 (aguja A) a un extremo del tubo de polietileno. Desaloje cuidadosamente otra aguja de 30 G x 1/2 (aguja B) y conecte el lado roto al otro extremo del tubo de polietileno.
   2. Coloque la aguja A en una jeringa de tuberculina de 1 ml.
      NOTA: Para este tubo de polietileno, 1,6 cm de líquido en el tubo corresponde a 1 l²⁰.
3. Preparar una mezcla de 10:1 ketamina/xiazina (10 mg/ml de ketamina y 1 mg/ml de xilazina) en solución salina (cloruro de sodio bacteriostático 0,9% [p/v]). Prepare la solución recién antes de su uso.

2. Preparación del animal para la cirugía

NOTA: Utilice ratones de 6 a 10 semanas. Se pueden utilizar ratones hembra y macho. En este estudio, se utilizaron ratones hembra de 6 a 10 semanas de edad, C57BL/6. Este método se puede adaptar para otras cepas de ratones.

1. Anestesiar el ratón inyectando 250 l de la mezcla de ketamina/xylazina intraperitonealmente. Espere hasta que el ratón esté completamente dormido. Asegúrese de que el ratón no reacciona a un pellizco del dedo del dedo para detectar la anestesia completa.
2. Afeitar el pelaje alrededor de las piernas con cortapelos.
3. Aplicar la crema depilatoria alrededor de la pierna y esperar 5 min. Limpie el pelaje residual y la crema depilatoria usando un tejido húmedo y limpie la pierna con agua estéril. Rocíe 70% de etanol alrededor de la pierna para esterilizar el área de operación. El etanol está restringido al sitio de la incisión.

3. Sutura quirúrgica de vasos linfáticos aferentes

NOTA: La pierna derecha se sutura, y la pierna izquierda se utiliza como el control falso. El protocolo de sutura linfática (pasos 3.1-3.8) toma 20-30 min.

1. Mantenga el ratón en una posición propensa y fíjelo con cinta quirúrgica para exponer el área de operación en la pierna derecha.
2. Inyecte por vía intradérgica 5 ml de 1% de tinte azul Evans o 9 cm del líquido del tubo del aparato de inyección en la almohadilla. Masajea suavemente el reposapiés para ayudar a Evans a entrar en el azul de los vasos linfáticos.
   NOTA: La jeringa de insulina no es fácil de controlar para la inyección de pequeño volumen. El volumen se puede controlar con mayor precisión utilizando el aparato de inyección. Los vasos linfáticos se visualizan con tinte azul debajo de la piel. Con un entrenamiento extenso, ambos vasos linfáticos aferentes se pueden ver a simple vista como vasos transparentes en el tejido adiposo, paralelos a la arteria safenosa. Con un entrenamiento extenso, es posible suturar los vasos sin inyectar tinte Evans Blue en los casos en que hay preocupaciones de posibles alteraciones del tinte.
3. Bajo un microscopio diseccionado, elija un sitio de incisión a 5 mm del borde inferior de la fosa popliteal. Haga una pequeña incisión (5 mm) en la piel con tijeras. Usando fórceps de operación fina, estire la incisión y exponga los vasos linfáticos recolectan (Figura 1A).
   NOTA: Si es necesario, se puede extraer un pequeño fragmento de piel para exponer los vasos linfáticos.
4. Identificar ambos vasos linfáticos aferentes que conducen a los pLN bajo el microscopio diseccionante (Figura 1B).
   NOTA: Hay dos vasos linfáticos aferentes desde la almohadilla hasta el pLN. Ambos necesitan ser suturados para bloquear completamente el flujo linfático.
5. Con un soporte para agujas, inserte con precaución la aguja de sutura (0,7 métrica o menor) entre el vaso linfático aferente y la arteria Safenous y tire de la aguja suavemente alrededor del vaso linfático aferente. Tire suavemente de la cuerda de sutura y deje unos 2 cm de la cuerda de sutura detrás. Utilice el soporte de la aguja para ayudar a atar la cuerda firmemente para suturar un vaso linfático con un nudo del cirujano (Figura 1C).
   NOTA: El tejido debajo de la incisión puede secarse con una exposición prolongada al aire. Hacer la incisión lo más pequeña posible y realizar la sutura rápidamente (es decir, dentro de 5 min) evitará que el tejido se seque. Mantener la humedad del tejido mediante la aplicación de un pequeño volumen de solución salina con un hisopo de algodón.
6. Masajee suavemente la almohadilla para asegurarse de que ningún tinte Evans Blue pase el sitio de la sutura y luego corte el exceso de cuerda con tijeras.
7. Realice los mismos pasos de sutura (es decir, los pasos 3.5 y 3.6) en el otro vaso linfático aferente (Figura 1D). Cierre la incisión cutánea con la misma sutura que se utilizó para suturar los vasos en el paso 3.5 (Figura 1E).
8. Para el control falso, inyectar indérgicamente 5 l de 1% de colorante azul Evans en el teclado izquierdo y masajear el reposapiés para visualizar los vasos linfáticos. Abra la piel con una escisión y luego cierre la herida sin suturar el vaso (Figura 1F).
9. Opcionalmente, monitoree los ratones operados durante 2 x 4 h. El lado de la sutura de la pierna debe mostrar edema con Evans Blue extendido al muslo, mientras que la pierna de control mostrará un tinte azul Evans restringido en el reposapiés. Si los ratones despiertan, se inyectará una mezcla adicional de ketamina/xiazina para mantenerse anestesia hasta la eutanasia.

4. Seguimiento del flujo linfático

1. Inmediatamente después de la cirugía, inyectar indesablemente 10 ml de isotiocianato de fluoresceína al 2% (FITC) en el reposapiés tanto del control como de la pierna suturida linfática.
2. Eutanasiar a los ratones con 400 l de mezcla de ketamina/xilazina y realizar la luxación cervical cuando los ratones están completamente anestesiados.
3. Recoger los pNS de la fosa popliteal y retirar cuidadosamente el tejido adiposo perinodal alrededor de los pLN bajo el microscopio de disección a las 2, 6 y 12 h después de la inyección de FITC.
4. Incrustar los pLN con el área medular del seno mirando hacia el lado del criomold en el compuesto de temperatura de corte óptima (OCT) (Figura 1G,H).
5. Preparar secciones congeladas de 20 m con un criotomo.
6. Imagen de las criocciones bajo un microscopio confocal para determinar la distribución de FITC.

La sutura de vasos linfáticos se ha utilizado en estudios anteriores15,16,17,19, donde sirvió como una herramienta importante para estudiar la función del flujo linfático antes de que se entendiera mejor la biología molecular de los vasos linfáticos. El bloqueo del flujo linfático interrumpe la homeostasis LN, lo que lleva a que los HEVs pierdan la expresión génica crítica necesaria para la localización óptima de linfocitos a la LN15,16,17. Desde entonces, se necesitaron otras dos décadas para demostrar que los DC que viajan con la linfa son cruciales para mantener el perfil de expresión del gen HEV y los linfocitos que se dedican a la LN13. El estrés de cizallamiento proporcionado por el flujo linfático es crítico para estimular la expresión de quimiocina en el LN. El bloqueo del flujo linfático interrumpe la expresión de chemokina CCL21 en el LN19,que es fundamental para dirigir el posicionamiento de células DC y T en el LN. Por lo tanto, el flujo interrumpido puede comprometer el posicionamiento de los DC y de las células T en el LN8,18.

Inmediatamente después de la cirugía, se utilizó un pequeño marcador fluorescente de peso molecular, FITC, para rastrear el flujo linfático. FitC (10 l de 2% FITC) se inyectó por vía intradértica en la almohadilla del control falso y en la pierna suturada linfática. Los pNN drenantes se recogieron 2, 6 y 12 h más tarde. Los pLN drenantes se incrustaron en oct, y se prepararon secciones congeladas de 20 m. Las imágenes confocales mostraron una acumulación de FITC sustancialmente reducida en los pLN después de la sutura. El FITC residual en los pLN se acumuló preferentemente en los senos paranasales LN (Figura 2).

La forma en que la linfa fluye a través del tejido adiposo que rodea el LN se investigó utilizando sutura linfática. Los vasos linfáticos aferentes que conducen a los pLN fueron suturados para bloquear el flujo linfático, y se determinó que el tejido adiposo perinodal podía soportar una pequeña cantidad de flujo linfático cuando los vasos linfáticos estaban bloqueados21. Se cartografió el flujo linfático a través del tejido adiposo a la cápsula del LN; parecía alimentarse en los senos paranasales del LN. Pequeñas cantidades de linfa pueden haber fluyedo hacia los senos paranasales LN con el tiempo (Figura 3).

Figura 1: Pasos de la sutura de vasos linfáticos aferentes LN popliteal LN (pLN). Brevemente, después de que los ratones fueron anestesiados con una mezcla de ketamina y xilazina, sus piernas fueron afeitadas, y el pelaje residual fue eliminado por una crema depilatoria. La pierna derecha se utilizó para sutura y la pierna izquierda era el control falso. El lado derecho de la almohadilla se inyectó por vía intradérgica con 5 l de 1% de colorante azul Evans preparado en PBS. (A) Al masajear suavemente la almohadilla, el tinte Evans Blue llenó los vasos linfáticos aferentes. (B) Se realizó un pequeño corte cut a 5 mm de distancia del pLN para exponer los vasos linfáticos, que están indicados por las dos flechas blancas. (C,D) Ambos vasos linfáticos aferentes fueron suturados. (E) La escisión cutánea se cerró con suturas. (F) La pierna de control recibió inyección azul Evans, escisión cutánea y cierre de sutura sin suturar los vasos linfáticos. (G) El éxito de la obstrucción del flujo linfático fue indicado por el tinte azul Evans, que entró en el pLN de la pierna de control, pero no la pierna suturada. (H,I) Los pLN recogidos se incrustaron en el compuesto OCT con seno subcapsular (SCS) y seno medular (MS) frente al lado de la lloldada antes de congelarse en nitrógeno líquido. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Distribución FITC en los pNN de drenaje de la pata falsa o suturada. Las imágenes confocales de pLNs recogidos 2, 6 y 12 h después de la inyección de FITC mostraron una acumulación de FITC sustancialmente reducida en los pLN después de la sutura. El FITC residual en los pLN se encontró preferentemente en los senos paranasales LN. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Distribución fitC en el tejido adiposo perinodal (PAT), alrededor de los pLN drenantes de la pata falsa o suturada. Las imágenes confocales de la PAT y la LN mostraron que fitC entra en la PAT y los senos paranasales del LN, pero no se distribuyó efectivamente por todo el LN cuando los vasos linfáticos fueron bloqueados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.