Aquí, establecimos un método de bajo costo y fácil de operar que dirige la diferenciación rápida y eficiente de las células madre embrionarias a las neuronas. Este método es adecuado para la popularización entre laboratorios y puede ser una herramienta útil para la investigación neurológica.
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Artículo de método
Diferenciación neuronal de las células madre embrionarias del ratón in vitro
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
La diferenciación neuronal de las células madre embrionarias del ratón (MESC) es una herramienta potencial para dilucidar los mecanismos clave implicados en la neurogénesis y potencialmente ayudar en la medicina regenerativa. Aquí, establecimos un método eficiente y de bajo costo para la diferenciación neuronal de los MESC invitro, utilizando la estrategia de cribado combinatorio. En las condiciones definidas aquí, la formación de cuerpos embrionados de 2 días + protocolo de inducción de ácido retinoico de 6 días permite una diferenciación rápida y eficiente de los mESC en células precursoras neuronales (NPC), como lo ve la formación de A2lox bien apilado y similar a un neurite y 129 derivados que son nestin positivos. El estado saludable de los cuerpos embrionarios y el punto de tiempo en el que se aplica el ácido retinoico (AR), así como las concentraciones de AR, son críticos en el proceso. En la diferenciación posterior de los PNJ en las neuronas, N2B27 medio II (complementado por medio neurobasal) podría apoyar mejor el mantenimiento a largo plazo y la maduración de las células neuronales. El método presentado es altamente eficiente, de bajo costo y fácil de operar, y puede ser una poderosa herramienta para la neurobiología y la investigación en biología del desarrollo.
Introducción
Las células madre embrionarias (ESC) son pluripotentes y pueden diferenciarse en células precursoras neuronales (NPC) y posteriormente en neuronas bajo ciertas condiciones1. La neurogénesis basada en ESC proporciona la mejor plataforma para imitar la neurogénesis, sirviendo así como una herramienta útil para estudios de biología del desarrollo y potencialmente ayuda en medicina regenerativa2,3. En las últimas décadas, muchas estrategias se han divulgado para inducir neurogénesis embrionaria, como el método transgénico4,utilizando moléculas pequeñas
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Protocolo
1. Cultivo de células madre embrionarias del ratón
- Prepare platos o platos de cultivo celular recubiertos de gelatina al 0,1%.
- Añadir 2 ml de gelatina esterilizada del 0,1% (0,1% w/v en agua) a platos de cultivo celular de 60 mm. Rockear suavemente para asegurar incluso el recubrimiento de los platos de cultivo celular.
- Coloque los platos en una incubadora de CO2 al 5% a 37 °C y deje el recubrimiento durante 1 h.
- Retire la solución de gelatina del 0,1% antes de sembrar las células.
NOTA: Después de retirar la gelatina, no es necesario secar o lavar los platos recubiertos.
- Cultivo de células m....
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Resultados
La formación de cuerpos embrionados de 2 días + la inducción por AR de 6 días funciona mejor en la dirección de la diferenciación de los MESC en PNJ (Fase I). Para determinar el protocolo óptimo que mejor promueve la diferenciación de los MESC en PNJ (Fase I), se probaron 7 protocolos tanto en A2lox como en 129 mESCs(Cuadro 1)y se monitorizó el estado de diferenciación de cada grupo utilizando microscopio ligero. Como se muestra en la Figura 3A, la mayoría de los derivados A.......
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Discusión
En el presente estudio, establecimos un método simple y eficaz para la diferenciación neuronal de los mESC, con materiales de bajo costo y fácil obtención. En este método, 2 días de formación de cuerpos embrionados seguidos de 6 días de inducción por AR pueden promover eficazmente la diferenciación de los MESC en LOSP (Fase I-protocolo 3). Para la diferenciación de fase II, N2B27 medio II (Fase II-protocolo 3) más eficazmente inducen la diferenciación de los NPC en las neuronas. Para garantizar el éxito, se debe prestar .......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 31501099) y el Departamento de Educación Media y Joven de la Provincia de Hubei, China (No. Q20191104). Además, agradecemos al profesor Wensheng Deng de la Universidad de Ciencia y Tecnología de Wuhan por proporcionar las líneas de células madre embrionarias del ratón A2lox.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Anticuerpo anti-Nestina [Rat-401] | Abcam | Ab11306 | almacenado a -80 ° C, evite la congelación y descongelación repetidas |
| anticuerpo anti-β-Tubulina III producido en conejo | Sigma Aldrich | T2200 | almacenado a -80 ° C, evite la congelación y descongelación repetidas |
| Alexa Fluor 488-Label Goat Anti-Mouse IgG | Beyotime | A0428 | almacenado a -20 & grados; C y proteger de la luz |
| B-27 Suplemento (50X), sin suero | Gibco | 17504044 | almacenado a -20 & grados; C, y proteger de la luz |
| CHIR-99021 (CT99021) | Selleck | S1263 | almacenado a -20 ° C |
| Cubreobjetos | NEST 801007 | ||
| Cy3-Label Cabra Anti-Conejo IgG | Beyotime | A0516 | almacenado a -20 ° C y proteger de la luz |
| DME/F-12 1:1 (1x) | HyClone | SH30023.01B | almacenado a 4 & grados; C |
| Suero fetal bovino | HyClone | SH30084.03 | almacenado a -20 ° C, evite la congelación y descongelación repetidas |
| Microscopía de fluorescencia | Olympus | CKX53 | |
| Gelatina | Gibco | CM0635B | almacena a temperatura ambiente |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | almacena a 4 & grados; C |
| Immunol Staining Tampón de dilución de anticuerpos primarios | Beyotime | P0103 | almacenado a 4 & grados; C |
| KnockOut DMEM/F-12 | Gibco | 12660012 | almacena a 4 & grados; C |
| KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828028 | almacenado a -20 ° C, evite la congelación y descongelación repetidas |
| Factor inhibidor de la leucemia humano | Sigma | L5283 | almacenado a -20 ° C |
| Medio de montaje con DAPI - Acuoso, Fluoroshield | Abcam | ab104139 | almacenado a 4 & grados; C y proteger de la luz |
| MEM Solución de aminoácidos no esenciales | Gibco | 11140076 | almacena a 4 & grados; C |
| N-2 Suplemento (100X) | Gibco | 17502048 | almacenado a -20 ° C y proteger de la luz |
| Suero de cabra normal | Jackson | 005-000-121 | almacenado a -20 ° C |
| Medio Neurobasal | Gibco | 21103049 | almacena a 4 &°; C |
| Plato bacteriano no adhesivo | Corning | 3262 | |
| Solución salina tamponada con fosfato (1X) | HyClone | SH30256.01B | almacenado a 4 & grados; C |
| Penicilina/Estreptomicina Solución | HyClone | SV30010 | almacena a 4 & grados; C |
| PD0325901(Mirdametinib) | Selleck | S1036 | almacenado a -20 ° C |
| Ácido retinoico | Sigma | R2625 | almacenado a -80 ° C y proteger de la luz |
| Cepa 129 Células madre embrionarias de ratón | Cyagen | MUAES-01001 | Mantenidas en un sistema de cultivo sin alimentador |
| Stem-Cellbanker (libre de DMSO) | ZENOAQ | cell cellbanker DMSO free | almacenado a -20 ° C, evite la congelación y descongelación repetidas |
| de tripsina 0.25% (1X) Solución | HyClone | SH30042.01 | almacenada a 4 & grados; C |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | almacenado a 4 & grados; C y proteger de la luz |
| 4% de paraformaldehído | Beyotime | P0098 | almacenado a -20 ° C |
| 6 - placa de pocillos | Corning | 3516 | |
| placa de cultivo celular de 60 mm | Corning | 430166 | |
| tubo de centrífuga de 15 ml | NUNC | 339650 |
Referencias
- Vieira, M. S., et al. Neural stem cell differentiation into mature neurons: mechanisms of regulation and biotechnological applications. Biotechnology Advances. 36 (7), 1946-1970 (2018).
- Yang, J. R., Lin, Y. T., Liao, C. H.
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Reimpresiones y permisos
