Artículo de método

Diferenciación neuronal de las células madre embrionarias del ratón in vitro

DOI:

10.3791/61190

⸱

2 de junio de 2020

 , 
1Wuhan Center for Disease Control and Prevention, 2College of Life Science and Health, Wuhan University of Science and Technology

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

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Aquí, establecimos un método de bajo costo y fácil de operar que dirige la diferenciación rápida y eficiente de las células madre embrionarias a las neuronas. Este método es adecuado para la popularización entre laboratorios y puede ser una herramienta útil para la investigación neurológica.

Resumen

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La diferenciación neuronal de las células madre embrionarias del ratón (MESC) es una herramienta potencial para dilucidar los mecanismos clave implicados en la neurogénesis y potencialmente ayudar en la medicina regenerativa. Aquí, establecimos un método eficiente y de bajo costo para la diferenciación neuronal de los MESC invitro, utilizando la estrategia de cribado combinatorio. En las condiciones definidas aquí, la formación de cuerpos embrionados de 2 días + protocolo de inducción de ácido retinoico de 6 días permite una diferenciación rápida y eficiente de los mESC en células precursoras neuronales (NPC), como lo ve la formación de A2lox bien apilado y similar a un neurite y 129 derivados que son nestin positivos. El estado saludable de los cuerpos embrionarios y el punto de tiempo en el que se aplica el ácido retinoico (AR), así como las concentraciones de AR, son críticos en el proceso. En la diferenciación posterior de los PNJ en las neuronas, N2B27 medio II (complementado por medio neurobasal) podría apoyar mejor el mantenimiento a largo plazo y la maduración de las células neuronales. El método presentado es altamente eficiente, de bajo costo y fácil de operar, y puede ser una poderosa herramienta para la neurobiología y la investigación en biología del desarrollo.

Introducción

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Las células madre embrionarias (ESC) son pluripotentes y pueden diferenciarse en células precursoras neuronales (NPC) y posteriormente en neuronas bajo ciertas condiciones1. La neurogénesis basada en ESC proporciona la mejor plataforma para imitar la neurogénesis, sirviendo así como una herramienta útil para estudios de biología del desarrollo y potencialmente ayuda en medicina regenerativa2,3. En las últimas décadas, muchas estrategias se han divulgado para inducir neurogénesis embrionaria, como el método transgénico4,utilizando moléculas pequeñas

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Protocolo

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1. Cultivo de células madre embrionarias del ratón

  1. Prepare platos o platos de cultivo celular recubiertos de gelatina al 0,1%.
    1. Añadir 2 ml de gelatina esterilizada del 0,1% (0,1% w/v en agua) a platos de cultivo celular de 60 mm. Rockear suavemente para asegurar incluso el recubrimiento de los platos de cultivo celular.
    2. Coloque los platos en una incubadora de CO2 al 5% a 37 °C y deje el recubrimiento durante 1 h.
    3. Retire la solución de gelatina del 0,1% antes de sembrar las células.
      NOTA: Después de retirar la gelatina, no es necesario secar o lavar los platos recubiertos.
  2. Cultivo de células m....

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Resultados

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La formación de cuerpos embrionados de 2 días + la inducción por AR de 6 días funciona mejor en la dirección de la diferenciación de los MESC en PNJ (Fase I). Para determinar el protocolo óptimo que mejor promueve la diferenciación de los MESC en PNJ (Fase I), se probaron 7 protocolos tanto en A2lox como en 129 mESCs(Cuadro 1)y se monitorizó el estado de diferenciación de cada grupo utilizando microscopio ligero. Como se muestra en la Figura 3A, la mayoría de los derivados A.......

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Discusión

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En el presente estudio, establecimos un método simple y eficaz para la diferenciación neuronal de los mESC, con materiales de bajo costo y fácil obtención. En este método, 2 días de formación de cuerpos embrionados seguidos de 6 días de inducción por AR pueden promover eficazmente la diferenciación de los MESC en LOSP (Fase I-protocolo 3). Para la diferenciación de fase II, N2B27 medio II (Fase II-protocolo 3) más eficazmente inducen la diferenciación de los NPC en las neuronas. Para garantizar el éxito, se debe prestar .......

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 31501099) y el Departamento de Educación Media y Joven de la Provincia de Hubei, China (No. Q20191104). Además, agradecemos al profesor Wensheng Deng de la Universidad de Ciencia y Tecnología de Wuhan por proporcionar las líneas de células madre embrionarias del ratón A2lox.

....

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Anticuerpo anti-Nestina [Rat-401]AbcamAb11306almacenado a -80 ° C, evite la congelación y descongelación repetidas
anticuerpo anti-β-Tubulina III producido en conejoSigma AldrichT2200almacenado a -80 ° C, evite la congelación y descongelación repetidas
Alexa Fluor 488-Label Goat Anti-Mouse IgGBeyotimeA0428almacenado a -20 & grados; C y proteger de la luz
B-27 Suplemento (50X), sin sueroGibco17504044almacenado a -20 & grados; C, y proteger de la luz
CHIR-99021 (CT99021)SelleckS1263almacenado a -20 ° C
CubreobjetosNEST 801007
Cy3-Label Cabra Anti-Conejo IgGBeyotimeA0516almacenado a -20 ° C y proteger de la luz
DME/F-12 1:1 (1x)HyCloneSH30023.01Balmacenado a 4 & grados; C
Suero fetal bovinoHyCloneSH30084.03almacenado a -20 ° C, evite la congelación y descongelación repetidas
Microscopía de fluorescenciaOlympusCKX53
GelatinaGibcoCM0635Balmacena a temperatura ambiente
GlutaMAX SupplementGibco35050061almacena a 4 & grados; C
Immunol Staining Tampón de dilución de anticuerpos primariosBeyotimeP0103almacenado a 4 & grados; C
KnockOut DMEM/F-12Gibco12660012almacena a 4 & grados; C
KnockOut Serum ReplacementGibco10828028almacenado a -20 ° C, evite la congelación y descongelación repetidas
Factor inhibidor de la leucemia humanoSigmaL5283almacenado a -20 ° C
Medio de montaje con DAPI - Acuoso, FluoroshieldAbcamab104139almacenado a 4 & grados; C y proteger de la luz
MEM Solución de aminoácidos no esencialesGibco11140076almacena a 4 & grados; C
N-2 Suplemento (100X)Gibco17502048almacenado a -20 ° C y proteger de la luz
Suero de cabra normalJackson005-000-121almacenado a -20 ° C
Medio NeurobasalGibco21103049almacena a 4 &°; C
Plato bacteriano no adhesivoCorning3262
Solución salina tamponada con fosfato (1X)HyCloneSH30256.01Balmacenado a 4 & grados; C
Penicilina/Estreptomicina SoluciónHyCloneSV30010almacena a 4 & grados; C
PD0325901(Mirdametinib)SelleckS1036almacenado a -20 ° C
Ácido retinoicoSigmaR2625almacenado a -80 ° C y proteger de la luz
Cepa 129 Células madre embrionarias de ratónCyagenMUAES-01001Mantenidas en un sistema de cultivo sin alimentador
Stem-Cellbanker (libre de DMSO)ZENOAQcell cellbanker DMSO freealmacenado a -20 ° C, evite la congelación y descongelación repetidas
de tripsina 0.25% (1X) SoluciónHyCloneSH30042.01almacenada a 4 & grados; C
Triton X-100SigmaT8787
2-MercaptoethanolGibco21985023almacenado a 4 & grados; C y proteger de la luz
4% de paraformaldehídoBeyotimeP0098almacenado a -20 ° C
6 - placa de pocillosCorning3516
placa de cultivo celular de 60 mmCorning430166
tubo de centrífuga de 15 mlNUNC339650
del

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vieira, M. S., et al. Neural stem cell differentiation into mature neurons: mechanisms of regulation and biotechnological applications. Biotechnology Advances. 36 (7), 1946-1970 (2018).
  2. Yang, J. R., Lin, Y. T., Liao, C. H.

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Etiquetas

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