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Cribado directo de cultivo líquido para evaluar la producción de proteínas heterólogas utilizando un mutante auxotrófico de Aspergillus oryzae

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DOI:

10.3791/61219

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12 de mayo de 2020

 , 
1Honda Research Institute Japan Co., Ltd.

En este artículo

Resumen

Se ha desarrollado un método de cribado directo de cultivo líquido (DLC) que reduce significativamente el tiempo necesario para la transformación del protoplasto mediada por polietilenglicol (PEG) del hongo filamentoso, Aspergillus oryzae, cuando se emplea para la evaluación de la producción secretora de proteínas heterólogas. Este método aumenta drásticamente el rendimiento del protocolo de evaluación.

Resumen

El Aspergillus oryzae, un hongo filamentoso, es uno de los huéspedes más utilizados para aplicaciones industriales, incluida la producción de proteínas a gran escala. Un método de transformación de protoplastos mediado por polietilenglicol (PEG) se utiliza generalmente para la introducción de genes heterólogos en A. oryzae. El método convencional suele requerir tres semanas para la detección de transformantes favorables. En este caso, se introduce una nueva técnica, el método de cribado directo de cultivo líquido (DLC), que reduce el tiempo de cribado a seis días en un formato de matraz de 200 ml o a 10 días en un formato de microplaca de 24 pocillos. El método de cribado DLC garantiza la adquisición de transformantes positivos y la evaluación de la producción secretora de proteínas heterólogas en un solo paso, a diferencia del método de cribado convencional en el que se requieren dos pasos separados para lo mismo. Se describe el protocolo para la transformación de protoplastos mediada por PEG de A. oryzae , que consta de cinco pasos: preparación de la suspensión de esporas frescas, precultivo, preparación de protoplastos, introducción de ADN y cribado de DLC. Para obtener resultados exitosos en el cribado de DLC, es fundamental utilizar un medio rico en nutrientes con una presión osmótica optimizada. El protocolo debería popularizar aún más el uso de A. oryzae como un huésped de elección en la producción industrial de proteínas.

Introducción

El Aspergillus oryzae es un microorganismo importante en la industria alimentaria japonesa que se ha utilizado durante más de 1.000 años en la producción de alimentos fermentados, como el sake (vino de arroz), el shoyu (salsa de soja) y el miso (pasta de soja)1,2. Tiene la capacidad de segregar una gran cantidad de proteínas, como proteasas y amilasas3. También se dispone de información sobre la secuencia del genoma de A. oryzae 4. Además, se han establecido técnicas de ingeniería genética potentes y útiles en la práctica para este hongo 5,6,7,8,9,10. Los transformantes favorables se han utilizado como huéspedes para la producción secretora de proteínas heterólogas 11,12,13,14.

La electroporación, la transformación mediada por agrobacterias y la transformación del protoplasto mediada por polietilenglicol (PEG) son las técnicas utilizadas para la introducción de genes heterólogos en A. oryzae 15,16,17. El método de transformación del protoplasto mediado por PEG ha sido ampliamente utilizado desde que se informó por primera vez para Neurospora crassa en 197918. En este método, los protoplastos se preparan y se mezclan con PEG y el gen heterólogo que se va a introducir en las células. Las paredes de los protoplastos están comprometidas enzimáticamente, lo que hace que las células sean vulnerables al estrés físico y a los cambios en la presión osmótica19,20. El método de cribado convencional empleado en la producción secretora de proteínas heterólogas incluye tres etapas: adquisición de transformantes positivos (en placa de agar blanda), selección de transformantes verdaderos y falsos (en placa de agar) y evaluación de la producción secretora de proteínas heterólogas (en cultivo líquido); cada uno de estos pasos dura siete días (Figura 1). Por lo tanto, el método convencional suele requerir unas tres semanas.

El tiempo requerido para el cribado de las células transformadas de A. oryzae es mucho mayor que el requerido para otros microorganismos comúnmente utilizados en la investigación biotecnológica, lo que hace que el proceso sea más engorroso. Por ejemplo, cuando se utiliza Escherichia coli como huésped, se necesitan aproximadamente dos días desde la introducción del ADN hasta la confirmación de su efecto21.

Para sortear la limitación asociada al uso de A. oryzae como se ha mencionado anteriormente, se introduce un nuevo método de cribado directo de cultivo líquido (DLC), que permite un cribado más rápido y sencillo para la evaluación de la producción secretora de proteínas heterólogas (Figura 1). En el método DLC, se utiliza un mutante auxótrofo de uridina y un medio líquido rico en nutrientes. Con este método, la etapa de cribado puede completarse dentro de los seis días posteriores a la introducción del ADN en los protoplastos en un formato de matraz de 200 ml o dentro de los 10 días en un formato de microplaca de 24 pocillos. Además, en este método no es necesaria la laboriosa y laboriosa preparación de los medios de la placa de agar. Hay una gran ventaja en el uso del método recién descrito, especialmente considerando el hecho de que el método convencional requiere dos medios diferentes: la placa de agar suave para la adquisición de transformantes positivos, que requiere un manejo cuidadoso y control de temperatura, y la placa de agar sólido para la selección de transformantes verdaderos.

figure-introduction-1
Figura 1: Esquema de la transformación del protoplasto mediada por polietilenglicol (PEG) del hongo filamentoso Aspergillus oryzae.
(Panel superior) Método de cribado convencional. (Panel inferior) Método de cribado directo de cultivo líquido (DLC). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Protocolo

1. Preparación de la suspensión de esporas frescas

  1. Inocular 20 μL de una suspensión de esporas madre (1 x 107 esporas/mL) en el centro de una placa de cultivo que contenga medio Czapek-Dox (CD) con 20 mM de uridina (esterilizada en autoclave a 121 °C durante 20 min, Tabla 1).
  2. Incubar a 30 °C durante 7 días para favorecer la formación de esporas.
  3. Añadir 1,5 mL de solución Tween 20 al 0,01 % (esterilizada en autoclave a 121 °C durante 20 min) a la placa de cultivo que contiene las esporas y suspender las esporas raspándolas con un esparcidor de células.
  4. Recoja la suspensión de esporas en un tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 ml con una pipeta.
  5. Almacene la suspensión a 4 °C hasta su uso.
    NOTA: Use la suspensión de esporas en el siguiente procedimiento dentro de las 2 semanas. Para hacer un caldo para el almacenamiento a largo plazo, agregue glicerol a la suspensión de esporas hasta una concentración final del 15% y almacene a -80 °C.

2. Precultivo

  1. Añadir 100 mL de medio polipeptona-dextrina (PD) (Tabla 2) en un matraz Erlenmeyer de 500 mL y esterilizarlo en autoclave a 121 °C durante 20 min.
  2. Después de confirmar que la temperatura del medio está reducida, agregue la solución de uridina, esterilizada pasando a través de un filtro con un tamaño de poro de 0,22 μm, hasta una concentración final de 20 mM.
  3. Añadir 200 μL de la suspensión de esporas (1 x 107 esporas/mL) preparada en el paso 1.4, e incubar a 30 °C con agitación a 120 rpm durante 36 h.

3. Preparación de protoplastos

  1. Coseche la biomasa fúngica preparada en el paso 2.3 en un filtro de vidrio con un tamaño de poro de 30 μm (esterilizado en autoclave a 121 °C durante 20 min).
  2. Vierta 100 mL de agua destilada (DW) (esterilizada en autoclave a 121 °C durante 20 min) en el filtro de vidrio y revuelva varias veces con una espátula (esterilizada en autoclave a 121 °C durante 20 min).
  3. Después de lavar con DW, vierta 100 mL de tampón de cloruro de sodio (NaCl) (esterilizado en autoclave a 121 °C durante 20 min, Tabla 3) sobre el filtro de vidrio y revuelva varias veces con una espátula.
  4. Transfiera aproximadamente 1-2 mL (volumen húmedo) de las células a un tubo cónico de 50 mL con una espátula (esterilizado en autoclave a 121 °C durante 20 min).
  5. Después de agregar 15 mL de la solución enzimática (esterilizada pasando a través de un filtro de tamaño de poro de 0,22 μm, Tabla 4) a un tubo cónico de 50 mL, agregue tampón de NaCl hasta que el volumen total alcance los 30 mL.
  6. Cierre la tapa y selle con una película de parafina. Incubar a 30 °C con agitación a 60 rpm durante 2 h.
  7. Haga fluir la solución resultante a través de un filtro de células de 70 μm conectado al tubo cónico de 50 ml para eliminar los micelios no reaccionados.
  8. Centrifugar la solución de protoplasto en un tubo cónico de 50 mL a 2.150 x g y 4 °C durante 20 min.
  9. Deseche suavemente el sobrenadante para evitar que el pellet se desprenda. Añadir 1 mL de solución B esterilizada helada (esterilizada en autoclave a 121 °C durante 20 min, Tabla 5) y suspender suavemente los protoplastos precipitados mediante pipeteo.
  10. Transfiera los protoplastos suspendidos a un tubo estéril de 1,5 mL.
  11. Centrifugar a 2.220 x g y 4 °C durante 5 min y retirar el sobrenadante. A continuación, añada 1 ml de solución B helada y suspenda suavemente el pellet pipeteando.
  12. Repita el paso 3.9.
  13. Con un hemocitómetro, mida el número de protoplastos bajo un microscopio.
  14. Prepare una suspensión de protoplastos (1−3 x 107 protoplastos/mL) en la solución B y guárdela en hielo hasta su uso.
    NOTA: Utilice la suspensión de protoplast inmediatamente en el siguiente procedimiento.

4. Introducción del ADN para la producción secretora de proteínas

  1. Utilizando un plásmido que contiene un casete de ADN para la producción secretora de proteínas como plantilla, amplifique el fragmento de ADN necesario para la producción secretora mediante PCR.
  2. Prepare la muestra de ADN que se utilizará para la transformación procesando el producto de PCR utilizando un kit de purificación de PCR.
  3. Añadir 1 mL de la solución de protoplasto, 200 μL de solución C (esterilizada en autoclave a 121 °C durante 20 min, Tabla 6) y 50 μL de la muestra de ADN (0,5−1 μg/μL) en un tubo cónico estéril preenfriado de 15 mL, y mezclar la solución suavemente mediante pipeteo.
    NOTA: La solución C es altamente viscosa y puede ser difícil de manipular; Asegure una mezcla completa mediante pipeteo.
  4. Incuba el tubo en hielo durante 30 min.
  5. Agregue 1,5 mL de solución C, mezcle suavemente mediante pipeteo y luego deje la solución a temperatura ambiente durante 20-30 min.

5. Cribado directo de cultivos líquidos

NOTA: Seleccione el sistema de cultivo utilizando matraces Erlenmeyer (sección 5.1) o microplacas (sección 5.2).

  1. Sistema de cultivo con matraz Erlenmeyer de 200 mL
    1. Añadir 50 mL de medio PD que contenga 0,8 M de sorbitol a un matraz Erlenmeyer de 200 mL y esterilizar en autoclave a 121 °C durante 20 min.
    2. Después de confirmar que la temperatura del medio está reducida, agregue la suspensión de protoplast preparada en el paso 4.5 hasta una concentración final de 1 x 105 protoplastos/mL.
    3. Incubar el cultivo durante 6 días a 30 °C con agitación a 120 rpm.
    4. Recoja 1 ml del medio y guárdelo en un tubo de 1,5 ml a 4 °C. Almacene la muestra de cultivo a -20 ° C, si no se analiza inmediatamente.
    5. Mezclar 20 μL de muestra de cultivo y 20 μL de tampón de muestra de dodecil sulfato de sodio (SDS) (Tabla 7) en un tubo de 1,5 mL y hervir a 95 ° C durante 5 min.
    6. Después de enfriar en hielo, cargue 20 μL de la muestra hervida y 5 μL de patrón de proteína preteñida en un gel prefabricado y analice la producción secretora de la proteína heteróloga objetivo mediante electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE)10.
  2. Sistema de cultivo mediante microplaca de 24 pocillos
    1. Añadir la suspensión de protoplastos preparada en el paso 4.5 a un medio PD esterilizado de 0,8 M que contenga sorbitol hasta una concentración final de 1 x 105 protoplastos/mL, y mezclar suavemente mediante pipeteo.
    2. Agregue 1 mL de la solución preparada en el paso 5.2.1 a tres pocillos en una microplaca de 24 pocillos.
    3. Coloque la tapa e incube a 30 °C agitando a 175 rpm durante 10 días.
    4. Recoja 1 mL de medio y almacene en un tubo de 1,5 mL a 4 ° C. Almacene la muestra de cultivo a -20 ° C, si no se analiza inmediatamente.
    5. Mezclar 20 μL de la muestra de cultivo y 20 μL de tampón de muestra SDS en un tubo de 1,5 mL y hervir a 95 ° C durante 5 min.
    6. Después de enfriar en hielo, cargue 20 μL de la muestra hervida y 5 μL de patrón de proteína preteñida en un gel prefabricado y analice la producción secretora de la proteína heteróloga objetivo mediante SDS-PAGE10.

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Resultados

A continuación se describen los resultados para la introducción del casete de expresión de ADN que codifica para la cellobiohidrolasa de Talaromyces cellulolyticus (CBH: GenBank Accession Number E39854) en un auxótrofo de uridina de la cepa HO422 de A. oryzae y el cribado de la producción secretora de la proteína heteróloga.

Preparación de suspensión de esporas frescas

El rendimiento final de la suspensión d...

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Discusión

Hemos desarrollado un sistema que permite el cribado de transformantes de A. oryzae de forma más rápida que el método convencional, mediante la realización de cultivo líquido de los protoplastos. El aspecto más crítico de este método es la presión osmótica del medio líquido. La presión osmótica adecuada para el cultivo líquido se optimizó utilizando sorbitol. El crecimiento de la cepa HO4 de A. oryzae fue más activo en presencia de 0,8 M de sorbitol (

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Los autores agradecen a Rinkei Okano por su ayuda con los experimentos. Los autores agradecen al profesor Katsuya Gomi, de la Universidad de Tohoku, y al profesor Masayuki Machida, del Instituto de Tecnología de Kanazawa, por sus valiosos debates. Este trabajo fue financiado por Honda Research Institute Japan Co., Ltd.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
1 M NaOHNACALAI TESQUE, INC.37421-05
1 M Tris-HCl (pH 7.5)FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation318-90225
1 M Tris-HCl (pH 6.8)FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation2106-100
1.5 mL Tubo de microcentrífugaAS ONE Corporation1-1600-03
15 mL Tubo de centrífuga cónicoBecton, Dickinson and Company352196
2- mercaptoetanolBio-Rad Laboratories, Inc.
Microplaca de 24 pocillosAGC TECHNO GLASS CO., LTD.3820-024
Tubo centrífugo cónico de 50 mlBecton, Dickinson and Company352070
70-µ m Filtro de célulasBecton, Dickinson y compañía352350
AgarFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation010-15815
AutoclaveTOMY SEIKO CO., LTD.LSX-700
Azul de bromofenolFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation021-02911
CaCl2FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation038-24985
Ácido de casaminoFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation393-02145
Celulasa R-10Cosmo Bio Co., Ltd.16419
Hidrato de dextrinaFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation044-00585
D-SorbitolFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation191-14735
e-PAGELATTO CORPORATIONE-T/R1020LUtilizado para gel prefabricado en SDS-PAGE
Dispositivo de electroforesisATTO CORPORATIONWSE-1150Utilizado para SDS-PAGE
FeSO4· 7H2OFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation098-01085
Filtro de vidrio 17G3Tokio Garasu Kikai Co., Ltd.
GlicerolFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation070-04941
HemocitómetroFunakoshi Co., Ltd.521-10
Centrífuga refrigerada de alta velocidadKUBOTA CORPORATION7780Se utiliza para la centrifugación de muestras en tubos de centrífuga cónicos de 50 mL
IncubadoraTAITEC CORPORATION.G· BR-200Se utiliza para el cultivo de líquidos en matraces y la preparación de protoplastos
IncubadoraTAITEC CORPORATION.BR-43FLSe utiliza para el cultivo líquido de microplacas y el cultivo de placas
KClFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation163-03545
KH2PO4NACALAI TESQUE, INC.28721-55
Enzima lisanteSigma-AldrichL1412-10G
MgSO4· 7H2OFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation131-00405
Micro centrífuga refrigeradaKUBOTA CORPORATION3740Se utiliza para la centrifugación de muestras en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml
MicroscopioLeica MicrosystemsDMI6000 B
NaClFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation190-13921
NaH2PO4· 2H2ONACALAI TESQUE, INC.31718-15
NaNO3FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation195-02545
Parafilm MBemis Company, IncPM-996
Kit de purificación de PCRQIAGEN K.K28104
Placa de PetriSumitomo Baquelita Co., Ltd.MS-11900Utilizado como placa de cultivo
PolietilenglicolSigma-AldrichP3640-500G
Polipeptona peptonaBecton, Dickinson and Company211910
Escaleras de proteínasBio-Rad Laboratories, Inc.161-0377Utilizado como marcador de peso molecular en SDS-PAGE
Sodium dodecil sulfatoBio-Rad Laboratories, Inc.
Filtro estérilMerck KGaASLGP033RB
SacarosaNACALAI TESQUE, INC.30404-45
Tween 20Tokio Industria Química Co., Ltd.T0543
UridinaSigma-AldrichU3750-25G
YatalaseTakara Bio Inc.T017
161071000000941471610301

Referencias

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