Este protocolo describe la evaluación del estado redox subcelular específico del compartimento dentro de la célula. Una sonda fluorescente sensible al redox permite un análisis ratiométrico conveniente en las células intactas.
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Artículo de método
Evaluación de la oxidación celular utilizando una proteína fluorescente verde sensible al redox específica del compartimento subcelular
En este artículo
Resumen
Resumen
La medición del equilibrio de oxidación/reducción intracelular proporciona una visión general del estado redox fisiológico y/o fisiopatológico de un organismo. Los tioles son especialmente importantes para iluminar el estado redox de las células a través de sus proporciones reducidas de ditiool y disulfuro oxidado. Las proteínas fluorescentes que contienen cisteína de diseño abren una nueva era para los biosensores sensibles al redox. Una de ellas, la proteína fluorescente verde sensible al redox (roGFP), se puede introducir fácilmente en las células con transducción adenoviral, lo que permite evaluar el estado redox de los compartimentos subcelulares sin interrumpir los procesos celulares. Las ciisteínas reducidas y las cistinas oxidadas de roGFP tienen máximas de excitación a 488 nm y 405 nm, respectivamente, con emisión a 525 nm. La evaluación de las proporciones de estas formas reducidas y oxidadas permite el cálculo conveniente del equilibrio redox dentro de la célula. En este artículo del método, se utilizaron células de cáncer de mama de triple negativo humano inmortalizados (MDA-MB-231) para evaluar el estado de redox dentro de la célula viva. Los pasos del protocolo incluyen la transducción de línea celular MDA-MB-231 con adenovirus para expresar roGFP citosólico, el tratamiento con H2O2y la evaluación de la relación de cisteína y cistina con citometría de flujo y microscopía de fluorescencia.
Introducción
El estrés oxidativo fue definido en 1985 por Helmut Sies como "una alteración en el equilibrio prooxidante-antioxidante a favor de la primera"1, y se ha llevado a cabo una plétora de investigación para obtener enfermedad-, nutrición-, y el envejecimiento-específico estado redox de los organismos1,2,3. Desde entonces, la comprensión del estrés oxidativo se ha vuelto más amplia. Probar las hipótesis del uso de antioxidantes contra enfermedades y/o envejecimiento ha demostrado que el estrés oxidativo no sólo causa daño, sino que también tiene otras funcio....
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Protocolo
NOTA: Este protocolo se optimizó para celdas MDA-MB-231 confluentes del 70% al 80%. Para otras líneas celulares, se debe reoptimizar el número de células y la multiplicidad de infección (MOI).
1. Preparación de células (día 1)
- Mantener la línea celular MDA-MB-231 en matraces de 75 cm2 con 10 ml del medio águila modificado de Dulbecco (DMEM) complementado con un 10% de suero bovino fetal (FBS) a 37 oC en una atmósfera humidificada de 5% CO2.
NOTA: DMEM complementado con 10% FBS, 37 oC, y una atmósfera humidificada 5% CO2 se utilizan para todas las incubaciones de apego y tratamiento a lo largo de....
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Resultados
El estado redox de CyS/CySS se ensaya fácilmente con roGPPs transducidos. La sonda fluorescente cuantifica la relación entre las formas reducidas y oxidadas (longitudes de onda de excitación 488 nm y 405 nm, respectivamente). Los datos de fluorescencia se pueden obtener mediante citometría de flujo y microscopía.
Un gran número de células se pueden adquirir de manera consistente y conveniente utilizando la citometría de flujo. El análisis consta de 3 pasos principales: 1) seleccionar la poblac.......
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Discusión
El equilibrio tiol/disulfuro en un organismo refleja el estado redox de las células. Los organismos vivos tienen glutatión, cisteína, tioles proteicos y tioles de bajo peso molecular, todos los cuales se ven afectados por el nivel de oxidación y se hacen eco del estado redox de las células4. Los roGRP diseñados permiten la cuantificación no disruptiva del equilibrio tiol/disulfuro a través de sus residuos CyS7. La propiedad ratiométrica de roGFP proporciona mediciones fiabl.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
El adenovirus constructor y recombinante para expresar roGFP específico de citosol en células se generó en el laboratorio de Paul T. Schumacker, PhD, Freiberg School of Medicine, Northwestern University y ViraQuest Inc., respectivamente. Este estudio fue apoyado por el Centro de Estudios de Respuesta Anfitriona a la Terapia del Cáncer subvención P20GM109005 a través del NIH National Institute of General Medical Sciences Centers of Biomedical Research Excellence (COBRE NIGMS), National Institute of General Medical Sciences Systems Pharmacology and Toxicology Training Program grant T32 GM106999, UAMS Foundation/Medical Research Endowment Award AWD00053956, UAMS Year-End....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 0,25% Tripsina-EDTA | Gibco de Life Sciences | 25200-056 | |
| Portaobjetos de cámara de 4 pocillos | Thermo Scientific | 154526 | Material de siembra de células para la obtención de imágenes fluorescentes |
| Tubos de 5 ml con tapón de filtro | de células Falcon | 352235 | Tubo de suspensión unicelular para análisis de citometría de flujo |
| Placa de 6 pocillos | Corning | 353046 | Material de siembra celular para análisis de citometría de flujo |
| Tubos cónicos de 15 ml | MidSci | C15B | Cultivo celular |
| 75 cm2 matraces de cultivo de tejidos con tapón ventilado | Corning | 4306414 | Cultivo celular |
| Citosol adenoviral específico roGFP | ViraQuest | VQAd roGFP roGFP | amablemente proporcionado por el Dr. Schumaker |
| Clase II, Tipo A2 Gabinete | de campana de seguridadThermo Scientific | 1300 Series A2 | Cultivo celular |
| Contador de células automatizado Countess | Invitrogen | C10227 | Recuento de células |
| Portaobjetos de cámara de contador de células Countess | Invitrogen | C10283 | Recuento de células |
| DMEM | Gibco de Life Sciences | 11995-065 | Cultivo celular |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | Cultivo celular |
| Puntas de pipeta filtradas, estériles, 20 y micro; l | Fisherbrand | 02-717-161 | Cultivo celular |
| Puntas de pipeta filtradas, estériles, 1000 y micro; l | Fisherbrand | 02-717-166 | Citómetro |
| BD Biosciences | LSRFortessa | Instrumento equipado con filtros de paso de banda FITC y BV510 para análisis de citometría de flujo | |
| Microscopio fluorescente | Grupo de microscopía avanzada (AMG) | Evos FL | Imágenes fluorescentes |
| Peróxido de hidrógeno 30% | Fisher Scientific | H325-100 | Control positivo |
| Light Cube, Custom | Life Sciences | CUB0037 | Imágenes fluorescentes de células que expresan roGFP (ex 405 nm) |
| Light Cube, GFP | Thermo Scientific | AMEP4651 | Imágenes fluorescentes de células que expresan roGFP (ex 488 nm) |
| MDA-MB-231 | American Tissue Culture Collection | HTB-26 | Línea celular de cáncer de mama epitelial humano |
| Tubos de microcentrífuga, 2 ml | Grenier Bio-One | 623201 | Cultivo celular |
| PBS | Gibco de Life Sciences | 10010-023 | Cultivo celular |
| Controlador de pipetas | Drummond | Hood Mate Model 360 | Cultivo celular |
| Pipeta serológica, 1 ml | Fisherbrand | 13-678-11B | Cultivo celular |
| Pipeta serológica, 5 ml | Fisherbrand | 13-678-11D | Cultivo celular |
| Pipeta serológica, 10 ml | Fisherbrand | 13-678-11E | Cultivo celular |
| Incubadora de cultivo de tejidos | Thermo Scientific | HERACell 150i | CO2 incubadora para cultivo celular |
| Tinción de azul de tripán 0,4% | Invitrogen | T10282 | Recuento de células |
Referencias
- Sies, H. Oxidative stress: A concept in redox biology and medicine. Redox Biology. 4, 180-183 (2015).
- Jones, D. P. Redefining Oxidative Stress. Antioxidants & Redox Signalling. 8 (9-10), (2006).
- Pizzino, G., et al.
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Reimpresiones y permisos
