Evaluación de la oxidación celular utilizando una proteína fluorescente verde sensible al redox específica del compartimento subcelular

Summary

Este protocolo describe la evaluación del estado redox subcelular específico del compartimento dentro de la célula. Una sonda fluorescente sensible al redox permite un análisis ratiométrico conveniente en las células intactas.

Abstract

La medición del equilibrio de oxidación/reducción intracelular proporciona una visión general del estado redox fisiológico y/o fisiopatológico de un organismo. Los tioles son especialmente importantes para iluminar el estado redox de las células a través de sus proporciones reducidas de ditiool y disulfuro oxidado. Las proteínas fluorescentes que contienen cisteína de diseño abren una nueva era para los biosensores sensibles al redox. Una de ellas, la proteína fluorescente verde sensible al redox (roGFP), se puede introducir fácilmente en las células con transducción adenoviral, lo que permite evaluar el estado redox de los compartimentos subcelulares sin interrumpir los procesos celulares. Las ciisteínas reducidas y las cistinas oxidadas de roGFP tienen máximas de excitación a 488 nm y 405 nm, respectivamente, con emisión a 525 nm. La evaluación de las proporciones de estas formas reducidas y oxidadas permite el cálculo conveniente del equilibrio redox dentro de la célula. En este artículo del método, se utilizaron células de cáncer de mama de triple negativo humano inmortalizados (MDA-MB-231) para evaluar el estado de redox dentro de la célula viva. Los pasos del protocolo incluyen la transducción de línea celular MDA-MB-231 con adenovirus para expresar roGFP citosólico, el tratamiento con H₂O₂y la evaluación de la relación de cisteína y cistina con citometría de flujo y microscopía de fluorescencia.

Introduction

El estrés oxidativo fue definido en 1985 por Helmut Sies como "una alteración en el equilibrio prooxidante-antioxidante a favor de la primera"¹, y se ha llevado a cabo una plétora de investigación para obtener enfermedad-, nutrición-, y el envejecimiento-específico estado redox de los organismos^1,2,3. Desde entonces, la comprensión del estrés oxidativo se ha vuelto más amplia. Probar las hipótesis del uso de antioxidantes contra enfermedades y/o envejecimiento ha demostrado que el estrés oxidativo no sólo causa daño, sino que también tiene otras funcio....

Protocol

NOTA: Este protocolo se optimizó para celdas MDA-MB-231 confluentes del 70% al 80%. Para otras líneas celulares, se debe reoptimizar el número de células y la multiplicidad de infección (MOI).

1. Preparación de células (día 1)

1. Mantener la línea celular MDA-MB-231 en matraces de 75 cm² con 10 ml del medio águila modificado de Dulbecco (DMEM) complementado con un 10% de suero bovino fetal (FBS) a 37 oC en una atmósfera humidificada de 5% CO_2.
   NOTA: DMEM complementado con 10% FBS, 37 oC, y una atmósfera humidificada 5% CO₂ se utilizan para todas las incubaciones de apego y tratamiento a lo largo de....

Results

El estado redox de CyS/CySS se ensaya fácilmente con roGPPs transducidos. La sonda fluorescente cuantifica la relación entre las formas reducidas y oxidadas (longitudes de onda de excitación 488 nm y 405 nm, respectivamente). Los datos de fluorescencia se pueden obtener mediante citometría de flujo y microscopía.

Un gran número de células se pueden adquirir de manera consistente y conveniente utilizando la citometría de flujo. El análisis consta de 3 pasos principales: 1) seleccionar la poblac.......

Discussion

El equilibrio tiol/disulfuro en un organismo refleja el estado redox de las células. Los organismos vivos tienen glutatión, cisteína, tioles proteicos y tioles de bajo peso molecular, todos los cuales se ven afectados por el nivel de oxidación y se hacen eco del estado redox de las células^4. Los roGRP diseñados permiten la cuantificación no disruptiva del equilibrio tiol/disulfuro a través de sus residuos CyS⁷. La propiedad ratiométrica de roGFP proporciona mediciones fiabl.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,25% Tripsina-EDTA	Gibco de Life Sciences	25200-056
Portaobjetos de cámara de 4 pocillos	Thermo Scientific	154526	Material de siembra de células para la obtención de imágenes fluorescentes
Tubos de 5 ml con tapón de filtro	de células Falcon	352235	Tubo de suspensión unicelular para análisis de citometría de flujo
Placa de 6 pocillos	Corning	353046	Material de siembra celular para análisis de citometría de flujo
Tubos cónicos de 15 ml	MidSci	C15B	Cultivo celular
75 cm2 matraces de cultivo de tejidos con tapón ventilado	Corning	4306414	Cultivo celular
Citosol adenoviral específico roGFP	ViraQuest	VQAd roGFP roGFP	amablemente proporcionado por el Dr. Schumaker
Clase II, Tipo A2 Gabinete	de campana de seguridadThermo Scientific	1300 Series A2	Cultivo celular
Contador de células automatizado Countess	Invitrogen	C10227	Recuento de células
Portaobjetos de cámara de contador de células Countess	Invitrogen	C10283	Recuento de células
DMEM	Gibco de Life Sciences	11995-065	Cultivo celular
FBS	Atlanta Biologicals	S11150	Cultivo celular
Puntas de pipeta filtradas, estériles, 20 y micro; l	Fisherbrand	02-717-161	Cultivo celular
Puntas de pipeta filtradas, estériles, 1000 y micro; l	Fisherbrand	02-717-166	Citómetro
	BD Biosciences	LSRFortessa	Instrumento equipado con filtros de paso de banda FITC y BV510 para análisis de citometría de flujo
Microscopio fluorescente	Grupo de microscopía avanzada (AMG)	Evos FL	Imágenes fluorescentes
Peróxido de hidrógeno 30%	Fisher Scientific	H325-100	Control positivo
Light Cube, Custom	Life Sciences	CUB0037	Imágenes fluorescentes de células que expresan roGFP (ex 405 nm)
Light Cube, GFP	Thermo Scientific	AMEP4651	Imágenes fluorescentes de células que expresan roGFP (ex 488 nm)
MDA-MB-231	American Tissue Culture Collection	HTB-26	Línea celular de cáncer de mama epitelial humano
Tubos de microcentrífuga, 2 ml	Grenier Bio-One	623201	Cultivo celular
PBS	Gibco de Life Sciences	10010-023	Cultivo celular
Controlador de pipetas	Drummond	Hood Mate Model 360	Cultivo celular
Pipeta serológica, 1 ml	Fisherbrand	13-678-11B	Cultivo celular
Pipeta serológica, 5 ml	Fisherbrand	13-678-11D	Cultivo celular
Pipeta serológica, 10 ml	Fisherbrand	13-678-11E	Cultivo celular
Incubadora de cultivo de tejidos	Thermo Scientific	HERACell 150i	CO2 incubadora para cultivo celular
Tinción de azul de tripán 0,4%	Invitrogen	T10282	Recuento de células