Medición de interacciones transcelulares a través de la agregación de proteínas en un sistema celular heterologoso

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo optimizado para medir rápida y semicuantitativamente las interacciones ligando-receptor en trans en un sistema celular heterologoso utilizando microscopía de fluorescencia.

Resumen

Las interacciones proteicas en las interfaces celulares dictan una multitud de resultados biológicos que van desde el desarrollo de tejidos y la progresión del cáncer hasta la formación y mantenimiento de sinapsis. Muchas de estas interacciones fundamentales ocurren en trans y suelen ser inducidas por interacciones heterofílicas u homofílicas entre células que expresan pares de unión anclados por membrana. Dilucidar cómo las mutaciones relevantes para la enfermedad interrumpen estas interacciones proteicas fundamentales puede proporcionar una visión de una miríada de campos de biología celular. Muchos ensayos de interacción proteína-proteína no suelen desambiguar entre las interacciones cis y trans, lo que potencialmente conduce a una sobreestimación del grado de unión que se está produciendo in vivo e implican la purificación intensiva de proteínas y/o equipos de monitoreo especializados. Aquí, presentamos un protocolo simple optimizado que permite la observación y cuantificación de sólo interacciones trans sin necesidad de largas purificaciones de proteínas o equipos especializados. El ensayo de agregación celular HEK implica la mezcla de dos poblaciones independientes de células HEK, cada una expresando ligandos de cognato unidos a membrana. Después de un breve período de incubación, las muestras se muestran en imágenes y se cuantifican los agregados resultantes.

Introducción

Las interacciones sinápticas facilitadas por moléculas de adhesión sináptica son fundamentales para el desarrollo, la organización, la especificación, el mantenimiento y la función de las sinapsis y la generación de redes neuronales. La identificación de estas moléculas de adhesión celular transsináptica está aumentando rápidamente; por lo tanto, es fundamental identificar socios de unión y entender cómo estas nuevas moléculas de adhesión interactúan entre sí. Además, la secuenciación del genoma ha identificado mutaciones en muchas de estas moléculas de adhesión que comúnmente están relacionadas con una multitud de trastornos neurodesarrollo, neuropsiquiátrico y de ad....

Protocolo

1. Cultivo celular y transfección

1. Hacer medios celulares HEK con DMEM, 1x (Dulbecco's Modification of Eagle's Medium) complementado con glucosa de 4,5 g/L, piruvato de L-glutamina y sodio y 10% FBS. Filtro estéril.
2. Predeterminar ligandos y receptores adecuados para el ensayo de agregación.
   NOTA: Neurexin3α SS4+/- y uno de sus ligandos conocidos, LRRTM2, fueron utilizados en este estudio. Ligandos y receptores de interés se expresaron a partir de CDNAs en pcDNA3.1. Se utilizó un conjunto Gibson para insertar Neurexin3α en pcDNA3.1¹². Neurexin3α F/R: TTTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCGCCACCATGAGCTTTACCCTCCACTCTC/
   GAGCGGCC....

Resultados

La mutación A687T aumenta la unión de Neurexin3α SS4 a LRRTM2⁷
Para investigar cómo las interacciones intercelulares de dos proteínas sinápticas conocidas se ven afectadas por la introducción de una mutación puntual encontrada en un paciente con discapacidad intelectual y epilepsia, utilizamos el ensayo de agregación celular HEK anterior (Figura 1). Las células fueron transfectadas de acuerdo con la sección 1 y preparadas para la toma de imágenes de acuerdo con.......

Discusión

La disección de las interacciones proteína-proteínas que se producen en trans durante la adhesión celular puede conducir a una mejor comprensión de los mecanismos moleculares subyacentes a los procesos celulares básicos, incluyendo la formación, función y mantenimiento de sinapsis durante la maduración y remodelación. Las implicaciones de las interacciones de célula a célula se expanden más allá de la neurobiología y tienen un papel más amplio en la transducción de la señal, la migración celular y el desarrollo de tejido.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Microtubos desechables de 1,5 mL con tapones a presión	VWR	89000-028	Incubación de población mixta de células HEK
1000 mL Rapid— Unidad de filtro de flujo, membrana aPES de 0,2 mmm	Thermo Fisher	567-0020	Esterilización de medios HEK
15 mL Tubos de centrífuga SpectraTube	Ward' s Science	470224-998	Recolección de células HEK
placas de cultivo de tejidos estériles	VWR	100062-892	células HEK
Cloruro de calcio	Sigma	223506-500G	Transfección de fosfato de calcio, centrífuga de resuspensión de células HEK
- Sorvall Legend RT	Kendro Productos de laboratorio	75004377	Recolección de células HEK Incubadora
	de células de CO2Thermo Scientific	HERACELL 150i	Incubación de células HEK durante el crecimiento
DMEM, 1x (Dulbecco's Modification of Eagle's Medium) con 4,5 g/L de glucosa, L-glutamina y piruvato de sodio	Corning	10-013-CV	Mantenimiento de células HEK
Dulbecco' s Solución salina tamponada con fosfato PBS (1X)	Gibco	14190-144	Paso/cosecha de células HEK
Ácido etilendiaminotetraacético	Sigma	ED-500G	Recolección de células HEK
Falcon Matraces de cultivo ventilados, 75cm2 área de crecimiento	Corning	9381M26	Cultivo de células HEK
Suero fetal bovino	Sigma	17L184	Mantenimiento
HEK293T celdas	ATCC		Sistema de modelos
ImageJ	NIH	V: 2.0.0-rc-69/1.52p	Análisis
de imágenes Cloruro de magnesio hexahidratado	Sigma	M9272-500G	Resuspensión celular HEK
Fosfato de sodio dibásico anhidro	Fisher BioReagents	BP332-500	Transfección de fosfato de calcio Tripsina
0,25% (1X) Solución	GE Healthcare Life Ciencias	SH30042.01	Paso de células HEK
Rotador			de tubo Incubación de población mixta de células HEK
Portaobjetos de microscopio UltraClear. Blanco esmerilado, cargado positivo	Denville Scientific Inc.	M1021	Adquisición
de imágenes Microscopio de campo amplio	Zeiss	Axio Vert 200M	Adquisición de imágenes

6 cultivo de de células HEK