Amplificación isotérmica mediada por bucle para la detección de salmonela en alimentos para animales y la confirmación de salmonela del aislamiento cultural

Resumen

La amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) es una prueba de amplificación de ácido nucleico isotérmico (iNAAT) que ha atraído un amplio interés en el campo de detección de patógenos. Aquí, presentamos un protocolo Salmonella LAMP validado multi-laboratorio como un método rápido, confiable y robusto para la detección de Salmonella en alimentos animales y la confirmación de la presunta Salmonella del aislamiento cultural.

Resumen

La amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) ha surgido como una potente prueba de amplificación de ácido nucleico para la detección rápida de numerosos agentes bacterianos, fúngicas, parásitos y virales. La salmonela es un patógeno bacteriano de importancia mundial en la seguridad alimentaria, incluidos los alimentos para los animales. Aquí se presenta un protocolo lamp de salmonela con múltiples laboratorios validado que se puede utilizar para examinar rápidamente los alimentos de los animales para detectar la presencia de la contaminación por Salmonella y también se puede utilizar para confirmar los presuntos aislados de Salmonella recuperados de todas las categorías de alimentos. El ensayo LAMP se dirige específicamente al gen de invasión Salmonella (invA)y es rápido, sensible y altamente específico. Los DNAs de plantilla se preparan a partir de caldos de enriquecimiento de alimentos para animales o cultivos puros de presuntos aislados salmonela. La mezcla de reactivos LAMP se prepara combinando una mezcla maestra isotérmica, imprimaciones, plantilla de ADN y agua. El ensayo LAMP se ejecuta a una temperatura constante de 65 °C durante 30 min. Los resultados positivos se supervisan a través de la fluorescencia en tiempo real y se pueden detectar tan pronto como 5 min. El ensayo LAMP exhibe una alta tolerancia a los inhibidores en los alimentos o medios de cultivo de los animales, sirviendo como un método rápido, fiable, robusto, rentable y fácil de usar para la detección y confirmación de Salmonella. El método LAMP se ha incorporado recientemente al Capítulo 5 del Manual Analítico Bacteriológico (BAM) de la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos.

Introducción

La amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) es una nueva prueba de amplificación de ácido nucleico isotérmico (iNAAT) inventada en 2000 por un grupo de científicos japoneses^1. A través de la formación de una estructura de ADN de bucle vástago específica del objetivo durante los pasos iniciales, LAMP utiliza una polimerasa de ADN que desplaza las hebras para amplificar eficientemente este material de partida de forma cuasi exponencial, lo que resulta en 10⁹ copias de objetivo en menos de 1 h^1. En comparación con la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), un NAAT ampliamente utilizado, LAMP posee varias ventajas. En primer lugar, las reacciones LAMP se llevan a cabo en condiciones isotérmicas. Esto obvia la necesidad de un sofisticado instrumento de ciclismo térmico. En segundo lugar, LAMP es altamente tolerante a los medios de cultivo y sustancias biológicas² con robustez demostrada tanto para aplicaciones clínicas como alimentarias^3,4. Esto simplifica la preparación de la muestra y minimiza los resultados negativos falsos⁵. En tercer lugar, LAMP es apto para múltiples plataformas de detección, como turbidez, colorimetría, bioluminiscencia, fluorescencia y microfluídica^6. En cuarto lugar, LAMP es muy específico, ya que utiliza de cuatro a seis imprimaciones especialmente diseñadas para dirigirse a seis a ocho regiones específicas^1,7. En quinto lugar, LAMP es ultrasensible y numerosos estudios han informado de su sensibilidad superior a PCR o PCR⁸en tiempo real. Por último, LAMP es más rápido con muchos ensayos que ahora adoptan un tiempo de ejecución estándar de 30 minutos, mientras que los ensayos de tipo PCR suelen tomar 1-2 h^8.

Estas atractivas características alimentaron la aplicación de LAMP en amplias áreas de detección de patógenos, incluyendo diagnóstico in vitro ^9,diagnóstico de enfermedades animales¹⁰y pruebas alimentarias y ambientales^11. En particular, la OMS ha recomendado una TB-LAMP (LAMP for Mycobacterium tuberculosis)como prueba de sustitución válida para la microscopía de frotis de esputo para diagnósticos de tuberculosis pulmonar en entornos periféricos^12. La aplicación LAMP también se expande más allá de la identificación microbiana para incluir la detección de alérgenos, especies animales, resistencia a fármacos, organismos genéticamente modificados y pesticidas^13.

Salmonella no fofódica es un patógeno zoonótico de considerable seguridad alimentaria y preocupación de salud pública en todo el mundo^14. También se ha identificado como un importante peligro microbiano en los alimentos para animales (es decir, alimentos para animales)^15,16. Para prevenir enfermedades/brotes de Salmonella de alimentos humanos contaminados y alimentos para animales, es imperativo contar con métodos rápidos, fiables y robustos para probar Salmonella en una variedad de matrices. En la última década, se han realizado considerables esfuerzos internacionales en el desarrollo y aplicación de ensayos de Salmonella LAMP en una amplia gama de matrices de alimentos, como se resumió recientemente en una extensa revisión^8. Varios ensayos de Salmonella LAMP, incluido el presentado aquí, han completado con éxito la validación multi-laboratorio siguiendo directrices internacionales bien establecidas^17,18,19,20.

Nuestro ensayo Salmonella LAMP se dirige específicamente al gen de invasión Salmonella invA (número de adhesión a GenBank M90846)²¹ y es rápido, fiable y robusto en múltiples matrices de alimentos^{4,22,23,24,25,26}. El método ha sido validado en seis matrices de alimentos para animales en un estudio precollaborante²⁶ y en alimentos para perros secos en un estudio colaborativo multi-laboratorio^19. Como resultado, el método Salmonella LAMP presentado aquí se ha incorporado recientemente al Manual Analítico Bacteriológico (BAM) capítulo 5 salmonella 27 de la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos (FDA) capítulo 5 Salmonella²⁷ para servir dos propósitos, uno como método de detección rápida para la presencia de Salmonella en alimentos animales y dos como un método de confirmación confiable para la presunta Salmonella aislada de todos los alimentos.

Protocolo

NOTA: Una mezcla de reacción LAMP contiene ADN polimerasa, tampón, MgSO_4,dNTPs, imprimaciones, plantilla de ADN y agua. Los primeros cuatro reactivos están contenidos en una mezcla maestra isotérmica (Tabla de materiales). Las imprimaciones se premezclan internamente para convertirse en una mezcla de imprimación (10x). Las plantillas de ADN se pueden preparar a partir de caldos de enriquecimiento de muestras de alimentos para animales con fines de detección o de cultivos de presuntos aislados salmonela con fines de confirmación. Además, se incluye un control positivo (ADN extraído de cualquier cepa de referencia de Salmonella, por ejemplo, Salmonella enterica serovar Typhimurium ATCC 19585 [LT2]) y un control sin plantilla (NTC; agua estéril de grado molecular) en cada carrera lamp.

1. Preparación de plantillas de ADN

1. Para preparar plantillas de ADN a partir de enriquecimientos de alimentos para animales, siga estos pasos.
   1. Pesa asépticamente 25 g de muestra de alimentos para animales (por ejemplo, alimentos secos para gatos, alimentos secos para perros, piensos para el ganado, piensos para caballos, piensos para aves de corral y piensos porcinos) en una bolsa de filtro estéril(Tabla de Materiales),o equivalente. Coloque la bolsa en un recipiente o bastidor grande para obtener apoyo durante la incubación.
   2. Agregue 225 ml de agua de peptona tamponada estéril (BPW). Mezcle bien remolinos y masajes breves a mano. Deje pararse a temperatura ambiente durante 60 ± 5 min.
   3. Mezcle bien arremolinándose y determine el pH con un papel de prueba. Ajuste el pH, si es necesario, a 6,8 ± 0,2 con 1 N estéril NaOH o 1 N HCl. Incubar a 35 ± 2 °C durante 24 ± 2 h.
   4. Mezcle bien arremolinando la bolsa que contiene caldos de enriquecimiento de alimentos animales. Transfiera 1 ml del lado filtrado de la bolsa a un tubo de microcentrífuga. Vórtice brevemente.
   5. Extraiga EL ADN utilizando un reactivo de preparación de muestras(Tabla de materiales) dela siguiente manera.
      1. Centrífuga a 900 x g durante 1 minuto para eliminar partículas grandes y transferir sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga.
      2. Centrífuga a 16.000 x g durante 2 minutos y deseche el sobrenadante.
      3. Suspenda el pellet en 100 μL del reactivo de preparación de la muestra y caliente a 100 ± 1 °C durante 10 minutos en un bloque de calor seco.
      4. Enfriar a temperatura ambiente y almacenar extractos de ADN de muestra a -20 °C.
2. Para preparar plantillas de ADN de presuntos cultivos de Salmonella, siga estos pasos.
   1. Obtenga los presuntos aislados de Salmonella del aislamiento cultural en todos los alimentos siguiendo la sección D de Salmonella del Capítulo 5 de BAM de la FDA: Aislamiento de Salmonella²⁷.
   2. Inocular los presuntos aislados salmonela en una placa de agar no selectivo (por ejemplo, agar sanguíneo, agar nutritivo y agar de soja trippticase) e incubar a 35 ± 2 °C durante 24 ± 2 h.
   3. Transfiera varias colonias individuales a 5 ml de caldo de soja trippticase (TSB) o caldo de infusión cardíaca cerebral (BHI) e incuba a 35 ± 2 °C durante 16 ± 2 h.
      NOTA: Este paso puede ser opcional si el presunto cultivo de Salmonella es puro. En ese caso, las plantillas de ADN se pueden preparar suspendiendo varias colonias individuales en 5 ml de TSB y calentando 500 μL de la suspensión a 100 ± 1 °C durante 10 minutos en un bloque de calor seco. Continúe con el paso 5 a continuación.
   4. Transfiera 500 μL del cultivo nocturno a un tubo de microcentrífuga y caliente a 100 ± 1 °C durante 10 minutos en un bloque de calor seco.
   5. Enfriar a temperatura ambiente y almacenar extractos de ADN aislados a -20 °C.
3. Para preparar el ADN de control positivo, siga pasos similares a los anteriores para preparar plantillas de ADN de cultivos presuntivos de Salmonella con un paso de dilución adicional.
   1. Inocular S. Typhimurium ATCC 19585 (LT2) o cualquier cepa de referencia de Salmonella en una placa de agar no seleccionativa (por ejemplo, agar de sangre, agar nutritivo y agar de soja trippticase) e incubar a 35 ± 2 °C durante 24 ± 2 h.
   2. Transfiera varias colonias individuales a 5 ml de caldo TSB o BHI e incuba a 35 ± 2 °C durante 16 ± 2 h para alcanzar ~10⁹ CFU/mL.
   3. Diluir en serie el cultivo nocturno en 0.1% agua de peptona para obtener ~ 10⁷ CFU / mL.
   4. Transfiera 500 μL de esta dilución a un tubo de microcentrífuga y caliente a 100 ± 1 °C durante 10 minutos en un bloque de calor seco.
   5. Enfriar a temperatura ambiente y almacenar ADN de control positivo a -20 °C.

2. Preparación de la mezcla de imprimación (10x)

1. Obtenga imprimaciones LAMP sintetizadas comercialmente (Sal4-F3, Sal4-B3, Sal4-FIP, Sal4-BIP, Sal4-LF y Sal4-LB) con purificación de desaladora estándar(Tabla 1).

Primer nombre	Descripción	Secuencia (5'-3')	Longitud (bp)
Sal4-F3	Imprimación exterior hacia adelante	GAACGTGTCGCGGAAGTC	18
Sal4-B3	Imprimación exterior hacia atrás	CGGCAATAGCGTCACCTT	18
Sal4-FIP	Imprimación interna hacia adelante	GCGCGGCATCCGCATCAATA-TCTGGATGGTATGCCCGG	38
Sal4-BIP	Imprimación interior hacia atrás	GCGAACGGCGAAGCGTACTG-TCGCACCGTCAAAGGAAC	38
Sal4-LF	Imprimación de bucle hacia adelante	TCAAATCGGCATCAATACTCA-TCTG	25
Sal4-LB	Imprimación de bucle hacia atrás	AAAGGGAAAGCCAGCTTTACG	21

Tabla 1: Imprimaciones LAMP para la detección de Salmonella en alimentos para animales y la confirmación de Salmonella del aislamiento cultural. Las imprimaciones están diseñadas sobre la base de la secuencia invA de Salmonella (número de adhesión a GenBank M90846).

2. Preparar soluciones de stock de cada imprimación (100 μM) rehidratando la imprimación con la cantidad adecuada de agua estéril de grado molecular. Mezcle bien con el vórtice durante 10 s y guárdelo a -20 °C (-80 °C para almacenamiento a largo plazo).
3. Prepare la mezcla de imprimación (10x) según una hoja de trabajo (Tabla 2). Añada volúmenes adecuados de soluciones de primer stock y agua estéril de grado molecular en un tubo de microcentrífuga. Mezcle bien todos los reactivos vórtice durante 10 s.

Componente	Conc. de stock (μM)	Mezcla de imprimación conc. (μM)	Volumen (μL)
Imprimación Sal4-F3	100	1	10
Imprimación Sal4-B3	100	1	10
Imprimación Sal4-FIP	100	18	180
Imprimación Sal4-BIP	100	18	180
Imprimación Sal4-LF	100	10	100
Imprimación Sal4-LB	100	10	100
Agua de grado molecular	N/A	N/A	420
Total	N/A	N/A	1000

Tabla 2: Hoja de trabajo para preparar la mezcla de imprimación LAMP (10x). Las imprimaciones se enumeran en la Tabla 1.

4. Aliquot la mezcla de imprimación de 10x a 500 μL por tubo de microcentrífuga y almacenar a -20 °C.

3. Montaje de una reacción LAMP

NOTA: Para evitar la contaminación cruzada, se recomienda separar físicamente las áreas utilizadas para preparar la mezcla maestra lamp y agregar plantillas de ADN. La Figura 1 es un diagrama LAMP.

Figura 1: Un diagrama esquemático del flujo de trabajo de Salmonella LAMP. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

1. Preparación y configuración de carrera
   1. Banco limpio con isopropanol y una solución degradante de ADN y DNase(Tabla de Materiales). Limpie las pipetas y los soportes de tiras de tubo(Tabla de Materiales)con la solución degradante de ADN y DNase.
   2. Descongelar la mezcla maestra isotérmica, mezcla de imprimación (10x), agua de grado molecular, ADN de control positivo y plantillas de ADN a temperatura ambiente.
   3. Encienda el instrumento LAMP(Tabla de materiales)y toque la pantalla de apertura para acceder a la pantalla de inicio. Siga estos pasos para crear una ejecución.
      NOTA: Un modelo del instrumento LAMP tiene 2 bloques (A y B) con 8 muestras en cada bloque y otro modelo tiene un único bloque que admite 8 muestras(Tabla de Materiales).
      1. Puntee LAMP+Anneal y seleccione Editar para introducir información de muestra.
         NOTA: El perfil de ejecución predeterminado de LAMP consiste en amplificación a 65 °C durante 30 min y una fase de recocido de 98 °C a 80 °C con 0,05 °C decremento por segundo.
      2. Toque cada fila de muestra para activar el cursor e introduzca la información de muestra relevante, utilizando el icono de bloque AB para cambiar entre los dos bloques de instrumentos LAMP.
      3. Toque el icono Comprobar cuando se haya introducido toda la información de ejemplo.
         NOTA: Opcionalmente, la configuración de ejecución (denominado "Perfil", que contiene información de muestra junto con el perfil de ejecución predeterminado de LAMP) se puede guardar para su uso posterior. Toque el icono Guardar y asigne al perfil un nombre único. Al probar este mismo conjunto de muestras la próxima vez, se puede iniciar una nueva ejecución con el perfil guardado. Toque el icono Carpeta en la parte inferior izquierda de la pantalla de inicio y seleccione Perfil para cargar perfiles guardados.
2. Montaje de reacción LAMP
   NOTA: Cuando utilice ambos bloques de instrumentos LAMP (A y B, un total de 16 muestras), prepare la mezcla maestra LAMP para 18 muestras. Si utiliza solo un bloque de instrumento LAMP (8 muestras en total), prepare la mezcla maestra LAMP para 10 muestras. Para otros números de muestra, ajuste el volumen en consecuencia para acomodar la pérdida de pipeteo. Incluya siempre un control positivo y un NTC en cada ejecución de LAMP. Se recomienda realizar pruebas duplicadas de cada muestra en ejecuciones lamp independientes.
   1. Prepare la mezcla maestra LAMP según una hoja de trabajo (Tabla 3). Agregue volúmenes apropiados de la mezcla maestra isotérmica, mezcla de imprimación y agua de grado molecular en un tubo de microcentrífuga y vórtice suavemente durante 3 s. Centrifugadora brevemente.
   2. Coloque la tira de tubo en el soporte de la tira y distribuya 23 μL de la mezcla maestra LAMP a cada pozo.
   3. Vórtice todas las plantillas de ADN y centrífuga brevemente. Agregue 2 μL de plantilla de ADN al pozo y tapa apropiados firmemente.
   4. Retire la tira de tubo del soporte y la muñeca de movimiento para asegurarse de que todos los reactivos se hayan agrupado en la parte inferior del tubo.
   5. Cargue la tira de tubo en los bloques de instrumentos LAMP, asegurándose de que las tapas estén seguras antes de cerrar la tapa.

Componente	Conc de trabajo.	Conc de reacción final.	Volumen por muestra (μL)	Volumen para 18 muestras (μL)	Volumen para 10 muestras (μL)
Mezcla maestra isotérmica ISO-001	1.67x	1x	15	270	150
Primera mezcla	10x	1x	2.5	45	25
Agua de grado molecular	N/A	N/A	5.5	99	55
Subtotal de mezcla maestro	N/A	N/A	23	414	230
Plantilla de ADN	N/A	N/A	2	N/A	N/A

Tabla 3: Hoja de trabajo para preparar la mezcla de reacción LAMP. La mezcla de imprimación (10x) se prepara de acuerdo con el Cuadro 2 utilizando soluciones de stock de imprimaciones enumeradas en el Cuadro 1.

4. CARRERA DE LÁMPARAS

NOTA: Durante una carrera lamp, las lecturas de fluorescencia se adquieren utilizando el canal FAM. Los valores de tiempo a pico(T_máx.; min) son determinados automáticamente por el instrumento para el punto de tiempo cuando la relación de fluorescencia alcanza el valor máximo de la curva de velocidad de amplificación. El T_m (°C) es la temperatura de fusión/recocido del producto amplificado final.

1. Haga clic en el icono Ejecutar en la parte superior derecha de la pantalla y seleccione los bloques que contienen tiras de tubo para iniciar la ejecución de LAMP.
2. Opcionalmente, mientras la reacción está en curso, toque las pestañas Temperatura, Amplificacióny Recocido para ver los cambios dinámicos de varios parámetros durante la ejecución de LAMP.
3. Una vez completada la ejecución, toque las pestañas Amplificación y Recocido para ver la amplificación completa y las curvas de recocido y toque la pestaña Resultados para ver los resultados.
4. Opcionalmente, para el mantenimiento de registros, registre el número de ejecución situado en la parte superior izquierda de la pantalla, utilizando el formato de "número de number_run serie de instrumentos", por ejemplo, "GEN2-2209_0030."

5. Interpretación de los resultados de LAMP

NOTA: Los resultados de lamp se pueden ver en el panel de instrumentos LAMP directamente y/o utilizando un software LAMP(Tabla de materiales).

1. Para interpretar los resultados de LAMP en el panel de instrumentos, siga estos pasos.
   1. Toque el icono Carpeta en la parte inferior izquierda de la pantalla de inicio y seleccione Registrar para navegar a la ubicación del archivo para cargar la ejecución lamp de interés.
      NOTA: Las tiradas lamp se organizan por fecha, a partir del año.
   2. Observe las cinco pestañas asociadas a cada ejecución: Perfil, Temperatura, Amplificación, Recocidoy Resultados.
      NOTA: Las pestañas Perfil y Temperatura muestran temperaturas programadas y reales, respectivamente, en los pozos de muestra a medida que avanza la reacción de LAMP. Las lengüetas amplificación y recocido muestran lecturas de fluorescencia y cambios en la fluorescencia durante las fases de amplificación y recocido, respectivamente. La pestaña Resultados muestra una vista tabular de los resultados de LAMP.
   3. Toque la pestaña Resultados para observar los resultados de LAMP para cada pozo.
      NOTA: Hay tres columnas (Bueno, Amplificación y Anneal). La columna "Amplificación" muestra los valores de tiempo de pico(T_máx.; min:seg) para cada muestra ("Bueno") y la columna "Anneal" muestra las temperaturas de fusión/recocido (T_m; °C) para cualquier producto amplificado en ese pozo.
   4. Interprete los resultados de LAMP e informe de los resultados finales de LAMP de la siguiente manera.
      1. Examine primero los pozos de control. El pozo NTC debe tener T_max en blanco, mientras que T_m puede estar en blanco (ambos modelos de instrumentos LAMP) o < 83 °C (solo para el modelo de instrumento LAMP con dos bloques). El pozo de control positivo debe tener T_máx. entre 5 y 10 min y T_m alrededor de 90 °C.
      2. Examine los pozos de muestra. Todas las muestras con la T_m (aproximadamente 90 °C) y T_máx. (entre 5-30 min) se consideran positivas para Salmonella.
      3. Informe de los resultados finales de LAMP en función de los resultados de las ejecuciones duplicadas. Si las ejecuciones duplicadas tienen resultados coherentes, se pueden notificar los resultados finales de LAMP. Si las ejecuciones duplicadas son incoherentes, repita ambas ejecuciones de forma independiente. Si los resultados siguen siendo inconsistentes, la muestra debe considerarse presumiblemente positiva para Salmonella y tendrá que pasar por la confirmación de la cultura.
2. Para interpretar los resultados de LAMP utilizando el software, siga estos pasos.
   1. Haga clic en el icono equipo en el panel izquierdo y vaya a la ubicación del archivo para cargar la ejecución lamp de interés.
      NOTA: El ordenador con el software instalado no necesita estar conectado al instrumento LAMP para analizar los resultados de LAMP, es decir, el acceso remoto está disponible. Las tiradas LAMP se organizan por fecha.
   2. Observe las siete pestañas asociadas a cada ejecución: Perfil, Temperatura, Amplificación, Tasa de amplificación, Anneal, Derivado del recocidoy Resultado.
      NOTA: Al igual que la vista del panel de instrumentos, las pestañas Perfil y Temperatura muestran temperaturas programadas y reales, respectivamente, en los pozos de muestra a medida que avanza la reacción de LAMP. Las pestañas Amplificación/Tasa de Amplificación y Derivado de Recocido/Recocido muestran lecturas de fluorescencia o cambios en la fluorescencia durante las fases de amplificación y recocido, respectivamente. La pestaña Resultados muestra una vista tabular de los resultados de LAMP que difieren ligeramente de la vista del panel de instrumentos.
   3. Toque la pestaña Tasa de amplificación para ver una visualización gráfica de las relaciones de fluorescencia por tiempo. Haga clic en el icono Configuración en la parte superior derecha de la pantalla y ajuste la "Relación de umbral de detección máxima" de 0,020 a 0,010.
      NOTA: El ajuste es necesario para garantizar que se identifiquen todos los picos válidos y que los resultados obtenidos con el software coincidan con los que se muestran en el panel de instrumentos.
   4. Toque la pestaña Resultado para observar los resultados de LAMP para cada pozo.
      NOTA: Hay cuatro columnas (Nombre del gráfico, Número de pozo, Nombre del pozo y Valor máximo). La parte superior de la columna "Valor máximo" muestra "Amp Time"(T_max; min:sec) para cada muestra ("Nombre bueno") mientras que la parte inferior muestra "Anneal Derivative" (T_m; °C) para cualquier producto amplificado en ese pozo.
   5. Interprete los resultados de LAMP e informe de los resultados finales de LAMP siguiendo pasos similares a cuando se utiliza el panel de instrumentos con una excepción de que el pozo NTC y otras muestras negativas deben tener T_m en blanco, ya que la configuración del software LAMP elimina esos resultados de T_m < 83 °C. Del mismo modo, todas las muestras con la T_m (aproximadamente 90 °C) y T_máx. (entre 5-30 min) se consideran positivas para Salmonella.

Resultados

La Figura 2 y la Figura 3 muestran gráficos/tablas LAMP representativos que se muestran en ambas plataformas. En esta ejecución lamp, las muestras S1 a S6 son diluciones serie de 10 veces de S. enterica serovar Infantis ATCC 51741 que van desde 1.1 x 10⁶ CFU a 11 CFU por reacción. El control positivo es S. enterica serovar Typhimurium ATCC 19585 (LT2) a 1,7 x 10⁴ CFU por reacción y NTC es agua de grado molecular.

Como se muestra en la Figura 2E y la Figura 3G,los pozos NTC y PC son controles válidos. El pozo NTC tiene T_max en blanco, mientras que T_m es < 83 °C en el panel de instrumentos LAMP y en blanco en el software LAMP, lo que sugiere un resultado negativo. El pozo pc tiene T_máx. de 7 min 45 seg y T_m de ~ 90 °C en ambas plataformas, lo que sugiere un resultado positivo. Las muestras S1 a S6 tienen T_max entre 6 min 30 seg y 12 min 15 seg, todas son Salmonella-positivas.

Después de las ejecuciones duplicadas del mismo conjunto de muestras, se notifican los resultados finales de LAMP para estas muestras. Esta ejecución representativa de LAMP muestra que LAMP detecta con éxito Salmonella con una amplia gama de concentraciones en las muestras.

Figura 2: Resultados representativos de LAMP que se muestran en el panel de instrumentos LAMP. (A) La pestaña Perfil muestra el perfil de temperatura programado. (B) La pestaña Temperatura muestra las temperaturas reales en los pozos de muestra a medida que avanza la reacción de LAMP. (C) La pestaña Amplificación muestra lecturas de fluorescencia durante la amplificación de LAMP. (D) La pestaña Anneal muestra cambios en la fluorescencia (derivado) durante la fase de recocido. (E) La pestaña Resultados muestra una vista tabular de los resultados de LAMP. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Resultados representativos de LAMP vistos en el software LAMP. (A) La pestaña Perfil muestra el perfil de temperatura programado. (B) La pestaña Temperatura muestra las temperaturas reales en los pozos de muestra a medida que avanza la reacción de LAMP. (C) La pestaña Amplificación muestra lecturas de fluorescencia durante la amplificación de LAMP. (D) La pestaña Tasa de amplificación muestra cambios en la fluorescencia (relación de fluorescencia) durante la amplificación de LAMP. (E) La pestaña Anneal muestra lecturas de fluorescencia durante la fase de recocido. (F) La pestaña Derivado de Anneal muestra cambios en la fluorescencia (derivado) durante la fase de recocido. (G) La pestaña Resultado muestra una vista tabular de los resultados de LAMP. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Hemos presentado aquí un método LAMP simple, rápido, específico y sensible para la detección y confirmación de Salmonella en alimentos para animales y cultivo puro, respectivamente. Con la comodidad de una mezcla maestra isotérmica que contiene cuatro reactivos clave, y una mezcla de imprimación preparada internamente lista para usar, el montaje de una reacción LAMP requiere sólo unos pocos pasos de pipeteo (Figura 1). El tiempo total de ejecución, incluidas las fases de amplificación y recocido, es inferior a 38 min(Figura 2A, B y Figura 3A,B). Los resultados positivos se supervisan mediante fluorescencia en tiempo real(Figura 2C y Figura 3C,D)y se pueden detectar tan pronto como 5 min²⁶. La fase de recocido sirve como una confirmación adicional de la especificidad de LAMP ya que sólo las muestras con T_m correcta (alrededor de 90 °C) se notifican como positivas(Figura 2D, E y Figura 3E-G). Previamente se han notificado sensibilidades de 1 célula salmonela en cultivo puro y < 1 CFU/25 g en alimentos^animales.

Como LAMP es bastante eficaz y genera una gran cantidad de ADN^1,es fundamental que se utilicen las mejores prácticas de laboratorio para prevenir la contaminación cruzada, que pueden incluir separar físicamente las áreas para preparar la mezcla maestra LAMP y agregar plantillas de ADN, evitar generar aerosoles, usar puntas de pipeta de filtro, cambiar guantes a menudo y abstenerse de abrir tubos de reacción LAMP después de la amplificación.

La especificidad de este método Salmonella LAMP se probó previamente utilizando 300 cepas bacterianas (247 Salmonella de 185 serovars y 53 noSalmonella)y demostró ser 100% específica^26. En particular, se observaron diferencias significativas en T_max entre las dos especies de Salmonella, S. enterica y Salmonella bongori,y entre las subespecies S. enterica, especialmente subsp. arizonae (IIIa)^26. No obstante, estos resultados positivos siguen siendo válidos según las normas para interpretar los resultados de LAMP. En nuestro estudio colaborativo multi-laboratorio en alimentos para perros secos en el que participaron 14 analistas^19,ocasionalmente se observaron muestras con resultados inconsistentes en corridas duplicadas de LAMP. Estos generalmente implicaban muestras con resultados positivos retrasados_(Máx. T> 15 min). Repetir ambas ejecuciones de forma independiente normalmente resuelve el problema. Más raramente, observamos muestras con valores_máximos T m correctos_pero no o irregulares T(< 5 min). Esto fue generalmente causado por burbujas de aire en el tubo de reacción.

A lo largo del ciclo de vida del desarrollo de métodos LAMP, evaluación, estudio precolaborante y validación multi-laboratorio, hemos observado alta tolerancia de LAMP a inhibidores en diversos alimentos animales o matrices alimentarias y medios de cultivo^{4,19,22,23,24,}destacando la robustez del método y colaborando numerosos otros estudios a escala global^8. Esto es superior en comparación con PCR o PCR en tiempo real, que normalmente requiere un control de amplificación interna para asegurarse de que los resultados negativos no se deben a la inhibición de la matriz²⁸. Además, LAMP demostró una especificidad y sensibilidad similares (o superiores) en comparación con pcr o PCR en tiempo real en la gran mayoría de los estudios^8. El costo de los reactivos LAMP es de aproximadamente $1 por reacción. Los instrumentos LAMP utilizados en este protocolo son pequeños, de bajo mantenimiento y portátiles. Pueden manejar cualquier método de amplificación isotérmica que emplee la detección de objetivos mediante la medición de fluorescencia, LAMP incluido. Con el software LAMP, se pueden generar informes completos en varios formatos (pdf, texto e imagen).

La validación de métodos es un paso crítico antes de que se pueda adoptar un nuevo método para su uso rutinario. Cabe destacar que el protocolo LAMP notificado aquí ha completado con éxito la validación multi-laboratorio^19. Con la reciente incorporación de este protocolo LAMP en el Capítulo 5 de Salmonella²⁷de bam de la FDA de los Estados Unidos, se espera que el método obtenga un uso mucho más amplio, tanto como un método de detección rápida en alimentos para animales como como un método de confirmación confiable para los presuntos aislados salmonela de todas las categorías de alimentos.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Caldo de infusión cerebro-corazón (BHI)	BD Diagnostic Systems, Sparks, MD	299070	Medio de crecimiento líquido utilizado en el cultivo de Salmonella.
Agua de peptona tamponada (BPW)	BD Diagnostic Systems, Sparks, MD 218105		Medio de preenriquecimiento para la recuperación de Salmonella a partir de muestras de alimentos para animales.
DNA AWAY	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	7010	Elimina el ADN y la DNasa no deseados de la mesa de laboratorio, la cristalería y el material de plástico sin afectar a las muestras de ADN posteriores.
Software Genie Explorer	OptiGene Ltd., West Sussex, Reino Unido	Versión 2.0.6.3	Admite el funcionamiento remoto de los instrumentos Genie, incluidas las ejecuciones de LAMP y el análisis de datos.
Genie II o Genie III (instrumento LAMP)	OptiGene Ltd., West Sussex, Reino Unido	GEN2-02 o GEN3-02	Un pequeño instrumento capaz de controlar la temperatura hasta 100 &°; C con ± 0.1 ° Precisión C y detección simultánea de fluorescencia a través del canal FAM. Genie II tiene 2 bloques (A y B) con 8 muestras en cada bloque. Genie III tiene un solo bloque que tiene capacidad para 8 muestras.
Tira Genie	OptiGene Ltd., West Sussex, Reino Unido	OP-0008	Tiras de microtubos de 8 pocillos con tapones de bloqueo integrales y un volumen de trabajo de 10 a 150 µl.
Soporte de tiras Genie	OptiGene Ltd., West Sussex, Reino Unido	GBLOCK	Utilizado para sujetar tiras Genie al configurar una reacción LAMP, el soporte de aluminio también se puede utilizar como bloque de refrigeración.
Solución de ácido clorhídrico (HCl), 1 N	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	SA48-500	Ajusta el pH de las muestras de alimentos para animales después de agregar BPW y antes del enriquecimiento durante la noche.
Bloque de calor	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	88-860-022	Calienta muestras a 100 ± 1 oC para la extracción de ADN.
Incubadora	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	3960	Incubadora de laboratorio estándar.
ISO-001 mezcla maestra isotérmica	OptiGene Ltd., West Sussex, Reino Unido	ISO-001	Una mezcla maestra optimizada para simplificar el ensamblaje de una reacción LAMP, que contiene un fragmento grande de ADN polimerasa GspSSD que desplaza la hebra de Geobacillus spp., pirofosfatasa inorgánica termoestable, tampón de reacción, MgSO4, dNTP y un colorante de unión al ADN de doble cadena (canal de detección FAM).
Isopropanol	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	A416	Desinfecta las superficies de trabajo.
Imprimaciones LAMP	Integrated DNA Technologies Inc., Coralville, IA		Imprimaciones LAMP personalizadas con información detallada en la Tabla 1.
Microcentrífuga	Eppendorf North America, Hauppauge, NY	22620207	MiniSpin más microcentrífuga personal.
Tubos de microcentrífuga	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	05-408-129	Tubos de microcentrífuga estándar.
Agua de grado molecular	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	AM9938	Se utiliza en la fabricación de material de imprimación, mezcla de cebador y mezcla de reacción LAMP.
Solución de hidróxido de sodio (NaOH), 1 N	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	SS266-1	Ajusta el pH de las muestras de alimentos para animales después de agregar BPW y antes del enriquecimiento durante la noche.
Agar no selectivo (por ejemplo, agar sangre, agar nutrientes y agar de soja tripticasa)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	R01202	Medio de crecimiento sólido utilizado en el cultivo de Salmonella.
Agua de peptona	BD Diagnostic Systems, Sparks, MD	218071	Diluye los cultivos de Salmonella durante la noche para producir ADN de control positivo.
Pipetas y puntas	Mettler-Toledo Rainin LLC, Oakland CA	Pipet Lite LTS series Pipetas	y puntas de laboratorio estándar.
Reactivo de preparación de muestras PrepMan Ultra	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	4318930	Un kit sencillo utilizado para la preparación rápida de plantillas de ADN para su uso en una reacción LAMP.
Cepa de referencia de Salmonella LT2	ATCC, Manassas, VA	700720	Cepa de referencia de Salmonella utilizada como control positivo.
Caldo de soja tripticasasa (TSB)	BD Diagnostic Systems, Sparks, MD	211768	Medio de crecimiento líquido utilizado en el cultivo de Salmonella.
Mezclador de vórtice	Scientific Industries, Inc., Bohemia, NY	SI-0236	Mezclador de vórtice de laboratorio estándar.
Bolsa de filtro Whirl-pak Marca	de muestreo Nasco, Fort Atkinson, WI	B01318	Bolsas de filtro para contener muestras de alimentos para animales para el enriquecimiento previo.