Artículo de método

Preparación de tejidos cardíacos de ingeniería en forma de malla derivados de células iPS humanas para la reparación del miocardio In Vivo

DOI:

10.3791/61246

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9 de junio de 2020

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1Clinical Translational Research Program, RIKEN Center for Biosystems Dynamics Research, 2Department of Cardiovascular Surgery, Graduate School of Medicine, Kyoto University, 3Laboratory of Stem Cell and Neuro-Vascular Biology, Cell and Developmental Biology Center, National Institutes of Health, 4Kosair Charities Pediatric Heart Research Program, Cardiovascular Innovation Institute, University of Louisville, 5Department of Pediatrics, School of Medicine, University of Louisville, 6Department of Cardiovascular Surgery, Mitsubishi Kyoto Hospital, 7Cincinnati Children's Heart Institute

En este artículo

Resumen

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El presente protocolo genera tejidos cardíacos de ingeniería en forma de malla que contienen células cardiovasculares derivadas de células madre pluripotentes inducidas por el hombre para permitir la investigación de la terapia de implantación celular para enfermedades del corazón.

Resumen

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El protocolo actual describe métodos para generar tejidos cardíacos (ECT) de ingeniería en forma de malla escalables compuestos por células cardiovasculares derivadas de células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSC), que se desarrollan hacia el objetivo del uso clínico. Los cardiomiocitos derivados de HiPSC, las células endoteliales y las células murales vasculares se mezclan con matriz de gel y luego se vierten en un molde de tejido de polidimetilsiloxano (PDMS) con postes escalonados internos rectangulares. Por día de cultivo 14 ECT maduran en una estructura de malla de 1,5 cm x 1,5 cm con paquetes de miofibra de 0,5 mm de diámetro. Los cardiomiocitos se alinean con el eje largo de cada haz y golpean espontáneamente sincrónicamente. Este enfoque se puede escalar hasta un ECT de malla más grande (3,0 cm x 3,0 cm) conservando la maduración y función de construcción. Por lo tanto, los ECT en forma de malla generados a partir de células cardíacas derivadas de hiPSC pueden ser factibles para los paradigmas de regeneración cardíaca.

Introducción

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Numerosos estudios preclínicos y ensayos clínicos han confirmado la eficiencia de las terapias regenerativas cardíacas basadas en células para corazones en quiebra1,2,3. Entre varios tipos de células, las células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSC) son fuentes celulares prometedoras en virtud de su capacidad proliferativa, potencial para generar varios linajes cardiovasculares4,,5,y alogenicidad. Además, las tecnologías de ingeniería de tejidos han hecho posible transferir millones de células a un corazón dañado5,,6,7,8.

Anteriormente, informamos de la generación de tejidos cardíacos de ingeniería lineal tridimensional (3D) (ECT) a partir de linajes cardiovasculares derivados de hiPSC utilizando un sistema de cultivo disponible comercialmente para tejidos bioartificiales 3D5,,7. Encontramos que la coexistencia de células endoteliales vasculares y células murales con cardiomiocitos dentro de la ECT facilitaba la maduración del tejido estructural y electrofisiológico. Además, validamos el potencial terapéutico de los hiPSC-ECT implantados en un modelo de infarto de miocardio de rata tolerante al inmunelí para mejorar la función cardíaca, regenerar el miocardio y mejorar la angiogénesis5. Sin embargo, los ECT lineales construidos por este método eran cilindros de 1 mm por 10 mm y, por lo tanto, no eran adecuados para la implantación en estudios preclínicos con animales más grandes o uso clínico.

Basándonos en el uso exitoso de moldes tisulares para generar la formación de tejidos de ingeniería porosa utilizando mioblastos esqueléticos de rata y cardiomiocitos9,cardiomiocitos humanos derivados de ESC10 y iPSCsde ratón 11,desarrollamos un protocolo para generar tejido implantable más grande derivado de hiPSC escalable utilizando moldes de polidimemetilsiloxano (PDMS). Evaluamos una gama de geometrías de moldes para determinar las características más efectivas del molde. Los ECT en forma de malla con múltiples haces y uniones presentaban excelentes características en viabilidad celular, función de tejido y escalabilidad en comparación con formatos lineales o de hojas lisas que carecía de poros o uniones. Implantamos el ECT en forma de malla en un modelo de infarto de miocardio de rata y confirmamos sus efectos terapéuticos similares a los ECT cilíndricos implantados12. Aquí describimos el protocolo para generar un ECT en forma de malla derivado de hiPSC.

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Protocolo

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1. Mantenimiento de hiPSC y diferenciación cardiovascular

  1. Ampliar y mantener hiPSCs en la matriz de membrana del sótano de capa delgada (factor de crecimiento reducido, 1:60 dilución) en medio condicionado extraído de fibroblastos embrionarios de ratón (MEF-CM) con factor de crecimiento de fibroblastos básico humano (hbFGF)4.
    NOTA: Utilizamos una línea hiPSCs (4 factores (Oct3/4, Sox2, Klf4 y c-Myc): 201B6). Agregue hbFGF a la concentración adecuada para cada línea celular. El fragmento de Laminin-511 también se puede utilizar para el recubrimiento de la placa de cultivo en lugar de la matriz de membrana del sótano. El medio disponible comercialmente diseñado para la cultura libre de alimentadores de hiPSC se puede utilizar como sustituto de MEF-CM.
  2. Utilice Versene (0,48 mM de solución de ácido etilendiaminetetraacético (EDTA)) para separar y disociar las células cuando la confluencia celular alcanza los 90o U2012100%.
    NOTA: También se pueden utilizar otros productos disponibles comercialmente para la disociación celular.
  3. Células de placa a una densidad de 10.000 células/mm2 en placas de cultivo celular recubiertas de matriz en MEF-CM con hbFGF y cultivo durante dos o tres días.
  4. Cuando el cultivo se vuelva completamente confluente, cubra las células con matriz (1:60 dilución con MEF-CM) durante un día.
  5. Sustituya el MEF-CM por el medio RPMI 1640 + B27. Añadir 100 ng/mL de Activin A y 100 ng/mL de Wnt3A al medio durante un día.
    NOTA: Este es el día 0 de diferenciación. Para regular la señalización canónica de Wnt, también se pueden utilizar inhibidores GSK3 en lugar de Wnt3A.
  6. En el día 1 de diferenciación, cambie el medio a la nueva RPMI 1640 + B27 con 10 ng/mL de BMP4 y 10 ng/mL de hbFGF. Células de cultivo para dos (protocolo MC) o cuatro (protocolo CM+EC) días sin cambio medio5.
    NOTA: El protocolo CM+EC está optimizado para inducir simultáneamente cardiomiocitos (CM) y células endoteliales vasculares (CE). El protocolo MC está optimizado para inducir preferentemente células murales vasculares (MC).
  7. Protocolo CM+EC para la inducción de CM y ECs(Figura 1A).
    1. Sustituya el medio en el día 5 de diferenciación por RPMI 1640 + B27 complementado con 50 ng/ml de VEGF165.
    2. Cambiar el medio de cultivo cada 48 h hasta el día 13-u201215 de diferenciación.
  8. Protocolo MC para la inducción de células murales vasculares(Figura 1B)
    1. Sustituya el medio por el suero bovino fetal RPMI1640 + 10% (FBS) en el día 3 de diferenciación.
    2. Cambiar el medio de cultivo cada 48 h hasta el día 13-u201215 de diferenciación.

2. Cosecha celular y análisis de linaje en el día de diferenciación 13-u201215

  1. Lavar las células con Ca2+ y Mg2+ solución salina libre de fosfato amortiguado (PBS).
  2. Añadir solución de disociación celular (que contiene proteasas, colagenasas y DNAses) en el plato de cultivo celular para cubrir la placa. Incubar la placa durante 5 min a 37oC.
  3. Recoger y disociar las células con medio de cultivo utilizando una pipeta después de la incubación.
  4. Asigne 1 x 106 celdas para el análisis de linaje con citometría de flujo. Para eliminar las células muertas, manche las células con un tinte de viabilidad fijable.
  5. Manche las células con marcadores de superficie de membrana en PBS con 5% FBS. Utilice las siguientes diluciones de anticuerpos en la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) tampón de tinción: anti-PDGFR (1:100), anti-VE cadherina (1:100), anti-TRA-1-60 (1:20).
  6. Para proteínas intracelulares, resuspender y fijar las células con 4% de paraformaldehído (PFA) en PBS.
  7. Manchar las células con isoforma anti-cardiaca de Troponina T (cTnT) en PBS con 5% FBS y 0.75% Saponina, luego etiquetar el anticuerpo cTnT con 488 ratón IgG1 (dilución 1:50).
  8. Resuspender las células manchadas en PBS con 5% FBS y ponerlas en tubos FACS con colador celular.
  9. Analizar la composición celular de las células manchadas de cada protocolo de diferenciación con citometría de flujo para facilitar la generación de suspensiones celulares con distribuciones de linaje definidas.
    NOTA: Durante la realización de este procedimiento, la suspensión celular restante para las ECT se conserva en un refrigerador de 4 oC.

3. Fabricación de moho tisular PDMS

  1. Funde una capa de 0,5 mm de espesor y más de 30 mm x 30 mm de polidimetilsiloxano (PDMS) mezclando el prepolímero y la solución de reticulación a una relación de 10:1 y luego cura a 80 oC durante 3 h.
  2. Corte la hoja PDMS y adhiera con adhesivo de silicona para fabricar una bandeja rectangular de 21 mm x 20,5 mm con 7 mm de largo, 0,5 mm de ancho y postes rectangulares de 2,5 mm de alto en una posición escalonada. El espaciado horizontal de los postes entre dos líneas de los postes es de 2,5 mm(Figura 2B).
  3. Autoclave la bandeja a 120oC durante 20 min.
  4. Cubrir la bandeja con 1% de poloxámero 407 en PBS durante 1 h. Enjuague el poloxámero 407 y enjuague el molde con PBS lo suficiente antes de usarlo.

4. Construcción de TEC

  1. Después del análisis del linaje celular, combine las células de los protocolos CM+EC y MC para que la concentración final de MCs sea de 10 a 20% en un número de células total de seis millones de células por construcción5.
  2. Suspenda seis millones de células mixtas en el medio de cultivo de ECT (medio esencial mínimo alfa complementado con 10% FBS, 50 m 2-mercaptoetanol y 100 U/mL Penicilina-Estreptomicina).
  3. Preparación de la solución de matriz
    1. Mezclar 133 l de solución de colágeno de cola de rata soluble en ácido tipo I (2 mg/ml, pH 3) con 17 l de 10x medio esencial mínimo (MEM). A continuación, mezcle la solución con 17 l de tampón alcaldiano (0,2 M NaHCO3, 0,2 M HEPES y 0,1 M NaOH).
      NOTA: El colágeno debe mantenerse sobre hielo (4 oC). Compruebe el color del búfer y si el medio no se vuelve rosado cuando todas las soluciones se mezclan, agregue búfer alcaldizo adicional al medio. Los pasos de mezcla deben ser mezclar colágeno I + 10x MEM, y luego añadir buffer alcalico. NO cambie este orden. NO genere burbujas en la mezcla.
    2. Añadir 67 l de matriz de membrana del sótano a la solución de colágeno neutralizado.
      NOTA: La solución mixta debe mantenerse sobre hielo (4 oC).
  4. Centrifugar la suspensión celular preparada que contiene seis millones de células a 1.100 rpm (240 x g)durante 5 min y resuspenda las células con 167 l de DMEM de alta glucosa + 20% FBS + 1% penicilina-estreptomicina (100x).
  5. Mezclar la suspensión celular y la solución de matriz. El volumen total de la mezcla de células/matrices para una construcción es de 400 l.
    NOTA: La mezcla de celda/matriz debe ser no viscosa y de color rosado en este paso. Manténgalo sobre hielo, ya que el gel se solidificará a temperatura ambiente. La concentración final de colágeno tipo I es de 0,67 mg/ml.
  6. Vierta la mezcla celular/matriz uniformemente sobre el molde de tejido PDMS recubierto de poloxámero 407, que se coloca en una placa de cultivo de seis pozos12.
    NOTA: Vierta la mezcla cuidadosamente para evitar la generación de burbujas con el fin de evitar defectos de llenado en el gel vertido.
  7. Incubar la mezcla celular/matriz en una incubadora estándar deCO2 (37C, 5 % CO2) durante 60 min.
  8. Después de que se forme el tejido, remoje el molde tisular con 4 ml de medio de cultivo de TEC.
    NOTA: Aunque la celda/matriz está reticulada en 60 min, la construcción sigue siendo muy frágil. Agregue suavemente el medio para evitar dañarlo.
  9. Cultivo del tejido durante 14 días con cambio medio todos los días.
  10. Antes de la implantación de la TEC, retire la TEC de los postes de carga con fórceps finos esterilizados.
    NOTA: Las dimensiones finales de ECT después de la eliminación del molde son menores que el molde original. Un molde de 2,1 cm x 2,05 cm genera un ECT liberado de aproximadamente 1,5 cm x 1,5 cm. Un molde más grande de 3,9 cm x 4,05 cm genera un ECT de aproximadamente 3 cm x 3 cm. La TEC descargada muestra golpes espontáneos intrínsecos en un medio de cultivo cálido. Aunque inicialmente mantiene una estructura de malla, un ECT descargado se encoge y se condensa con el tiempo. Es posible sostener el tejido suavemente con fórceps finos y luego usar sutura de seda 7-0 para unir el ECT al epicardio.

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Resultados

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El cuadro 1A, B muestra los esquemas del protocolo CM+EC y MC. Después de inducir los CM y los FC del protocolo CM+EC y los MC del protocolo MC, las células se mezclan ajustando las concentraciones finales de MC para representar entre el 10 y el 20% del total de células. El molde de tejido de 2 cm de ancho se fabrica de acuerdo con el dibujo de diseño de una hoja PDMS de 0,5 mm de espesor(Figura 2A,B). Seis millones de células C...

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Discusión

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Tras la finalización de nuestra investigación de un formato lineal, derivado de hiPSC ECT5,adaptamos el protocolo para mezclar CM, EC y MC derivados de hiPSC para facilitar la expansión in vitro de las células vasculares dentro de las ECT y el posterior acoplamiento vascular in vivo entre las ECT y el miocardio receptor.

Para facilitar la generación de geometrías ECT de malla más grandes e implantables, utilizamos láminas delgadas de PDMS para diseñar los moldes 3D con ...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen conflictos financieros o científicos que revelar.

Agradecimientos

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Este trabajo fue apoyado financieramente por el Programa de Investigación pediátrica del corazón de Kosair Charities en la Universidad de Louisville y el Proyecto Organoid en el CENTRO RIKEN para la Investigación de Dinámica de Biosistemas. HiPSCs utilizados en nuestros protocolos publicados fueron proporcionados por el Centro de Investigación y Aplicación de Células iPS, Universidad de Kioto, Kioto, Japón.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Materials
mm estiloFalcon/ Thomas scientific9380C51
Placas de pocillos múltiples para cultivo celular 6well 50/CSFalcon / Thomas scientific6902A01
Sylgard 184 Kit de elastómero de siliconaDow Corning761036
AccumaxInnovative Cell TechnologiesAM-105
BMP4, recombinantes (10µ g)R& DRSD-314-BP-010
Colágeno, solución tipo I de cola de rataSigmaC3867
MatrigelCorningreducido en
VEGF humano (165) IS, grado premiumMiltenyi130-109-385
Pluronic F-127, 0.2 y micro; m filtrado (solución al 10% en agua)Sondas molecularesP-6866
bFGF humano recombinanteWAKO060-04543
ActivinA recombinante humano/ratón/rata (50µ g)R& D338-AC-050
rh Wnt-3a (10µ g)R& D5036-WN
Versene soluciónGibco15040066
Medio de cultivo y suplementos
10x MEMInvitrogen11430
2 Mercaptro EtanolSIGMAM6250
B27 suplemento sin insulinaGibco
DMEM,Gibco11965084
Suero Fetal Bovino Alto en Glucosa (500 ml)Cualquier
Suero Fetal Bovino (500 ml)Cualquier
L-GlutaminaGibco25030081
NaHCO3Cualquier
PBS 1xGibco10010-031
Penicilina-estreptomicina (5000 U/mL)Gibco15070-063
RPMI1640 medioGibco21870092
α MEMInvitrogen11900024
Flowcytometry
anti-TRA-1-60, FITC, Clon: TRA-1-60, BD BiosciencesBD / Fisher560380
anti-troponina T, Isoforma cardíaca Ab-1, Clon: 13-11, Thermo Scientific Lab VisionFisherMS-295-P0
BD FACS Clean SoluciónBD340345
BD FACSFo fluido de funda bajaBD342003
BD FACSRina SoluciónBD340346
EDTACualquier
Tubo Falcon con Tapa de Filtro de Células (Caja de 500)Suero352235
(500ml)Cualquiera
Kit de tinción de células muertas Aqua LIVE/DEAD fijable, para excitación de 405 nmSondas molecularesL34957
PDGFRb; anti-CD140b, R-PE, Clon: 28D4, BD BiosciencesBD / Fisher558821
SaponinaSigma-Aldrich47306-50G-F
VEcad-FITC; anti-CD144, FITC, Clon: 55-7H1, BD BiosciencesBD / Fisher560411
Zenon Alexa Fluor 488 Ratón IgG1 Kit de etiquetadoSondas molecularesZ25002
Cell Culture Platos 100x20 factor de crecimiento 356231 A1895601 Bovino Fetal Corning

Referencias

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  1. Sanganalmath, S. K., Bolli, R. Cell therapy for heart failure: A comprehensive overview of experimental and clinical studies, current challenges, and future directions. Circulation Research. 113, 810-834 (2013).
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  3. Menasché, P., et al. Human embryonic stem cell-derived cardiac progenitors for severe heart failure treatment: first clinical case report: Figure 1. European Heart Journal. 36, 2011-2017 (2015).
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  5. Masumoto, H., et al. The myocardial regenerative potential of three-dimensional engineered cardiac tissues composed of multiple human iPS cell-derived cardiovascular cell lineages. Scientific Reports. 6, 29933(2016).
  6. Zimmermann, W. H., et al. Engineered heart tissue grafts improve systolic and diastolic function in infarcted rat hearts. Nature Medicine. 12, 452-458 (2006).
  7. Fujimoto, K. L., et al. Engineered fetal cardiac graft preserves its cardiomyocyte proliferation within postinfarcted myocardium and sustains cardiac function. Tissue engineering. Part A. 17, 585-596 (2011).
  8. Lancaster, J. J., et al. Surgical treatment for heart failure: cell-based therapy with engineered tissue. Vessel Plus. 2019, (2019).
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  13. Kowalski, W. J., et al. Quantification of Cardiomyocyte Alignment from Three-Dimensional (3D) Confocal Microscopy of Engineered Tissue. Microscopy and Microanalysis. 1, (2017).

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