Ensayo no radioactivo para medir la fosforilación de polinucleótido de sustratos de nucleótidos pequeños

Resumen

Este protocolo describe un ensayo no radioactivo para medir la actividad quinasa de las quinasas de polinucleótidos (PNK) en sustratos pequeños de ADN y ARN.

Resumen

Las quinasas de polinucleótidos (PNK) son enzimas que catalizan la fosforilación del extremo hidroxilo de 5' del ADN y los oligonucleótidos de ARN. La actividad de los PNK se puede cuantificar mediante enfoques directos o indirectos. Aquí se presenta un enfoque directo e in vitro para medir la actividad de PNK que se basa en un sustrato de oligonucleótido con etiqueta fluorescente y electroforesis de gel de poliacrilamida. Este enfoque proporciona la resolución de los productos fosforilados evitando el uso de sustratos radiomarcados. El protocolo detalla cómo configurar la reacción de fosforilación, preparar y ejecutar grandes geles de poliacrilamida, y cuantificar los productos de reacción. La parte técnicamente más difícil de este ensayo es verter y ejecutar los grandes geles de poliacrilamida; por lo tanto, se proporcionan detalles importantes para superar las dificultades comunes. Este protocolo fue optimizado para Grc3, un PNK que se ensambla en un complejo de procesamiento de ARN pre-ribosomal obligado con su socio de unión, la nucleasa Las1. Sin embargo, este protocolo se puede adaptar para medir la actividad de otras enzimas PNK. Además, este ensayo también se puede modificar para determinar los efectos de diferentes componentes de la reacción, como el trifosfato de nucleósidos, iones metálicos y oligonucleótidos.

Introducción

Las quinasas polinucleótidas (PNK) desempeñan un papel fundamental en muchas vías de procesamiento de ADN y ARN, como la reparación del ADN y el ensamblaje ribosoma^{1,,2,,3,,4,,5}. Estas enzimas fundamentales catalizan la transferencia del monofosfato terminal (gamma) de un trifosfato de nucleósido (NTP, más a menudo ATP) al extremo hidroxilo de 5' de un sustrato de nucleótido. Uno de los PNK más caracterizados es el bacteriófago T4 PNK, que tiene una amplia especificidad de sustrato y es muy utilizado por lo....

Protocolo

1. Preparación

1. Prepare el búfer y los reactivos.
   1. Haga 1x Buffer de Reacción combinando 20 l de 1 M Tris (pH a 8,0), 40 ml de cloruro de sodio de 5 M, 2,5 l de cloruro de magnesio de 2 M, 100 l de 50% (v/v) de glicerol y agua libre de RNase para alcanzar un volumen total de 1 ml.
   2. Haga el tinte de carga de urea combinando 4,8 g de urea, 200 l de 1 M Tris (pH a 8,0), 20 l de 0,5 M EDTA (pH a 8,0), 0,5 ml de 1% (p/v) de agua libre de romo para alcanzar un volumen total de 10 mL.
   3. Haga un tampón TBE 10x combinando 108 g de base Tris, 55 g de ácido bórico, 40 ml de 0,5 M EDTA (pH a 8,0) y agua libre de RNase para alcanzar un volumen to....

Resultados

Un gel de desnaturalismo representativo exitoso de una valoración de ATP con una cantidad fija del complejo Las1-Grc3 se muestra en la Figura 1. La adición de enzimas dio lugar a la escisión de ARN mediada por Las1 del sustrato de ARN SC-ITS2, lo que dio lugar a un fragmento de ARN definido (ARN C2 de 5-OH C2). Tras la adición de ATP, el fragmento de ARN C2 fue fosforilado por Grc3 PNK (5-P C2 RNA). En geles desnaturalados, el ARN fosforilado migra más rápido.......

Discusión

Se describe un ensayo para medir la actividad quinasa de Grc3 PNK en sustratos de nucleótidos con etiqueta fluorescente. Este protocolo se puede aplicar para caracterizar otras enzimas PNK adaptando el búfer de reacción y el sustrato de oligonucleótido. Por ejemplo, el protocolo requiere una cantidad de seguimiento de EDTA. La adición de EDTA es beneficiosa por dos razones: En primer lugar, este enfoque favorece grc3 unido al magnesio al impedir que la enzima se une a cantidades traza de metales contaminantes en la mezcl.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
0,4 mm Peine de 34 pocillos	BioRad	1653848
Espaciador de 0,4 mm	BioRad	1653812
0,5 M EDTA ph 8.0	KD Medical	RGF-3130
1M Cloruro de magnesio	KD Medical	CAC-5290
1M Tris pH 8.0	KD Medical	RGF-3360
40% Acrylamida/Bis Solución 29:1	BioRad
5M Cloruro de sodio	KD Medical	RGF-3720
persulfato de amonio (APS)	BioRad	161-0700
ATP	Sigma	A2383-1G
ácido bórico	Sigma	B0394
sal de sodio azul de bromofenol	Sigma	B5525-5G
Placas de vidrio	Thomas Scientific	1188K51
Secuenciador Hoefer SQ3 Hoefer		N/A
Image J Software	N/A	N/A	https://imagej.nih.gov/ij/
Oligonucleótidos de ARN marcados	IDT	Pedido
Pharmacia EPS 3500 Fuente de alimentación	Pharmacia	N/A
Steriflip 0. 22 mmm Filtro	Millipore	5FCP00525
TEMED	BioRad	161-0800
tris base	Sigma	TRIS-RO
Typhoon FLA 9500 generador de imágenes en gel	GE Healthcare	N/A
Ultra Pure DEPC	Invitrogen	750023
Ultra Pure Glycerol	Invitrogen	19E1056865
urea	Fisher Chemical	U15-500

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