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Artículo de método

Ensayo no radioactivo para medir la fosforilación de polinucleótido de sustratos de nucleótidos pequeños

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DOI:

10.3791/61258

⸱

8 de mayo de 2020

 , 
1Signal Transduction Laboratory, National Institute of Environmental Health Sciences, Department of Health and Human Services, National Institutes of Health

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe un ensayo no radioactivo para medir la actividad quinasa de las quinasas de polinucleótidos (PNK) en sustratos pequeños de ADN y ARN.

Resumen

Las quinasas de polinucleótidos (PNK) son enzimas que catalizan la fosforilación del extremo hidroxilo de 5' del ADN y los oligonucleótidos de ARN. La actividad de los PNK se puede cuantificar mediante enfoques directos o indirectos. Aquí se presenta un enfoque directo e in vitro para medir la actividad de PNK que se basa en un sustrato de oligonucleótido con etiqueta fluorescente y electroforesis de gel de poliacrilamida. Este enfoque proporciona la resolución de los productos fosforilados evitando el uso de sustratos radiomarcados. El protocolo detalla cómo configurar la reacción de fosforilación, preparar y ejecutar grandes geles de poliacrilamida, y cuantificar los productos de reacción. La parte técnicamente más difícil de este ensayo es verter y ejecutar los grandes geles de poliacrilamida; por lo tanto, se proporcionan detalles importantes para superar las dificultades comunes. Este protocolo fue optimizado para Grc3, un PNK que se ensambla en un complejo de procesamiento de ARN pre-ribosomal obligado con su socio de unión, la nucleasa Las1. Sin embargo, este protocolo se puede adaptar para medir la actividad de otras enzimas PNK. Además, este ensayo también se puede modificar para determinar los efectos de diferentes componentes de la reacción, como el trifosfato de nucleósidos, iones metálicos y oligonucleótidos.

Introducción

Las quinasas polinucleótidas (PNK) desempeñan un papel fundamental en muchas vías de procesamiento de ADN y ARN, como la reparación del ADN y el ensamblaje ribosoma1,,2,,3,,4,,5. Estas enzimas fundamentales catalizan la transferencia del monofosfato terminal (gamma) de un trifosfato de nucleósido (NTP, más a menudo ATP) al extremo hidroxilo de 5' de un sustrato de nucleótido. Uno de los PNK más caracterizados es el bacteriófago T4 PNK, que tiene una amplia especificidad de sustrato y es muy utilizado por los laboratorios de biología molecular para la incorporación de etiquetas de isótopos radiactivos en el 5 terminus de un sustrato de ADN o ARN6,7,8,9,10,11,12. Otro ejemplo de una enzima PNK es CLP1, que se encuentra en Eukarya, Eubacteria y Archaea, y está implicado en varias vías de procesamiento de ARN4,13,14,15.

Históricamente, la mayoría de los ensayos que miden la actividad de polinucleótido quinasa dependen del etiquetado de isótopos radiactivos y de la posterior autoradiografía5,,16. En los últimos años se han desarrollado una serie de ensayos adicionales para medir la actividad de PNK, incluyendo enfoques de molécula única, electroforesis de microchip, balizas moleculares, así como ensayos colorimétricos y basados en luminiscencia17,18,19,20,21,22. Si bien muchos de estos nuevos enfoques proporcionan límites de detección mejorados y evitan el uso de radiactividad, cada uno tiene inconvenientes, como el costo, la dependencia de la resina inmovilizada y las limitaciones en la elección del sustrato.

Grc3 es un polinucleótido quinasa que desempeña un papel fundamental en el procesamiento de ARN pre-ribosomal2,3,23. Grc3 forma un complejo obligado con la endoribonucleasa Las1, que corta el Espaciador Transcrito Interno 2 (ITS2) del ARN pre-ribosomal3. Cleavage del ITS2 de Las1 genera un producto que alberga un hidroxilo de 5' que posteriormente es fosforilado por la Grc3 quinasa3. Para investigar la especificidad de nucleótidos y sustratos de Grc3, se requirió un ensayo barato que permitió realizar pruebas de diferentes sustratos de oligonucleótidos. Por lo tanto, se desarrolló un ensayo de fosforilación PNK utilizando sustratos con etiqueta fluorescente. Este ensayo se utilizó con éxito para determinar que Grc3 puede utilizar cualquier NTP para la actividad de transferencia de fósforo, pero favorece ATP24. Este protocolo adapta el ensayo original para medir la actividad PNK de Grc3 en una imitación de ARN de su sustrato de ARN pre-ribosomal (SC-ITS2, Tabla 1). Un aspecto desafiante de este enfoque basado en la fluorescencia es la dependencia de grandes geles de poliacrilamida para resolver eficazmente los sustratos fosforilados y no fosforilados. El protocolo proporciona detalles específicos sobre cómo verter estos geles grandes y evitar escollos comunes al hacerlo.

Trabajar con ARN requiere un cuidado especial porque es muy susceptible a la degradación. Hay medidas preventivas simples que uno puede tomar para limitar la contaminación por ribonucleasa. Una estación de trabajo de ARN independiente que se puede tratar fácilmente con un agente limpiador que contiene inhibidores de la ARNa a menudo es útil. Es necesario usar siempre guantes cuando se manejen muestras y se utilicen consumibles certificados sin RNase. Debido a que el agua es otra fuente común de contaminación, lo mejor es utilizar agua recién purificada y esterilizar todas las soluciones utilizando un filtro de 0,22 m.

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Protocolo

1. Preparación

  1. Prepare el búfer y los reactivos.
    1. Haga 1x Buffer de Reacción combinando 20 l de 1 M Tris (pH a 8,0), 40 ml de cloruro de sodio de 5 M, 2,5 l de cloruro de magnesio de 2 M, 100 l de 50% (v/v) de glicerol y agua libre de RNase para alcanzar un volumen total de 1 ml.
    2. Haga el tinte de carga de urea combinando 4,8 g de urea, 200 l de 1 M Tris (pH a 8,0), 20 l de 0,5 M EDTA (pH a 8,0), 0,5 ml de 1% (p/v) de agua libre de romo para alcanzar un volumen total de 10 mL.
    3. Haga un tampón TBE 10x combinando 108 g de base Tris, 55 g de ácido bórico, 40 ml de 0,5 M EDTA (pH a 8,0) y agua libre de RNase para alcanzar un volumen total de 1 L.
    4. Hacer 10% (p/v) persulfato de amonio (APS). Pesar 0,5 g de APS y añadir 3 ml de agua libre de RNase para disolver el sólido. Añadir agua libre de RNase para alcanzar un volumen total de 5 ml. Envuelva el tubo en papel de aluminio y almacene la solución a 4 oC.
      NOTA: El APS disuelto se descompone con el tiempo. Sustituya el stock de APS del 10% cada 2 semanas.
  2. Obtener enzima polinucleótida quinasa.
    1. Adquirir la enzima pura Las1-Grc3PNK2 almacenada en Búfer de reacción (ver paso 1.1.1) en una concentración de stock de 20 oM. El búfer de almacenamiento variará dependiendo del PNK específico.
  3. Preparar sustrato de ácido nucleico.
    NOTA: Este protocolo supervisa la 5'-fosforilación de un sustrato de ARN de 27 nt que alberga el sitio de procesamiento Las1-Grc3 (sitio C2) contenido en el espaciador interno transcrito De Saccharomyces cerevisiae pre-ribosomal 2 (SC-ITS2; véase la Tabla 1)2,25,26.
    1. Sintetiza químicamente un sustrato de oligonucleótido de ARN que contenga un extremo de 5'-hidroxilo junto con una etiqueta fluorescente de 3'. El fluoróforo se utilizará para la visualización del ARN. Asegúrese de que el fluoróforo esté colocado en el extremo del ARN que no está dirigido a la fosforilación. Como alternativa a las fuentes comerciales, el etiquetado fluorescente interno y terminal de sustratos de ARN se puede realizar internamente utilizando protocolos rentables27.
    2. Eliminar el exceso de fluoróforo de la reacción de etiquetado de ARN por HPLC-purificación28.
    3. Resuspender el ARN liofilizado utilizando agua libre de RNase a 500 nM.
    4. Almacene las alícuotas de ARN a -80 oC para almacenamiento a largo plazo o a -20 oC para almacenamiento a corto plazo.
  4. Prepare la serie de concentración de ATP.
    1. Haga un stock de trabajo de 20 mM de ATP usando El búfer de reacción (véase el paso 1.1.1). Utilice este stock de trabajo para generar cuatro diluciones en serie que van desde 20 mM-0.02 mM.
    2. Para realizar la primera dilución de la serie de concentración, mezcle 1 l del stock de trabajo ATP de 20 mM con 9 ml de búfer de reacción. Esto resultará en una dilución de 10 veces el ATP con una concentración final de 2 mM.
    3. Utilice el stock DE ATP de 2 mM generado en el paso 1.4.2 para realizar la siguiente dilución en la serie de concentración. Mezcle 1 l de la población de ATP de 2 mM con 9 ml de búfer de reacción. Esto hará una nueva concentración de acciones ATP de 0,2 mM.
    4. Continúe diluyendo 1 l de la población anterior de ATP con 9 sl de búfer de reacción para hacer el stock de ATP subsiguiente en la serie de concentración.

2. Reacción in vitro del ARN quinasa

NOTA: Este ensayo se puede utilizar para medir varias variables como el tiempo, los niveles de nucleótidos o la concentración enzimática. El objetivo de este experimento es evaluar la cantidad de ARN fosforilado en presencia de niveles constantes de ATP complejos Las1-Grc3 y variados.

  1. Para cada reacción de arn-enzima quinasa, combine 1 l de sustrato de ARN de 500 nM, 8,3 l de 130 nM Las1-Grc3 y 0,2 l de EDTA de 5 mM.
    NOTA: Si realiza varias reacciones, prepare un stock maestro de la mezcla de ARN-enzima y alícuota de 9,5 ml de esta mezcla maestra a cada tubo de reacción.
  2. Comience el ensayo.
    1. Ajuste el bloque de calor a 37 oC.
    2. A intervalos de 10 s, mezcle 0,5 ml de un substock ATP de la serie de concentración de ATP preparado en el paso 1.4 con una mezcla de ARN-enzima y coloque la reacción en el bloque de calor de 37 oC.
      NOTA: Agregue 0,5 ml de búfer de reacción en lugar de ATP a una mezcla de enzimas ARN para un control negativo PNK. Utilice también otro control necesario (es decir, sustrato de ARN en ausencia de enzima PNK).
    3. Incubar las reacciones durante 60 min a 37oC.
      NOTA: El ARN con etiqueta fluorescente es sensible a la luz; por lo tanto, cubrir las reacciones con papel de aluminio.
    4. Usando el mismo orden que en el paso 2.2.2, apague cada reacción cada 10 s escupiendo la reacción con 10 l de tinte de carga de urea (ver paso 1.1.2).
      NOTA: Además de 4 M de urea, se puede añadir proteinasa K en este paso para degradar la enzima. Siga las instrucciones proporcionadas por el proveedor para determinar la cantidad de proteasa requerida y las condiciones de reacción.
    5. Utilice inmediatamente las reacciones de ARN quinasa in vitro apagados para el análisis posterior (ver sección 3) o almacenar a -20 oC para analizarse más adelante.

3. Electroforesis de gel

  1. Preparar 15% de acrilamida/8 M solución de gel de urea.
    ADVERTENCIA: La acrilamida debe manejarse con cuidado, ya que es una neurotoxina. Use siempre guantes, un abrigo de laboratorio y gafas cuando lo manipule.
    1. En un vaso de vidrio de 150 ml, combine 22,5 ml de solución premezclada de acrilamida/bis-acrilamida 29:1, 6 ml de TBE de 10x (ver paso 1.1.3), 28,8 g de urea y agua libre de RNase hasta un volumen total de 59 ml. Revuelva suavemente la solución.
      NOTA: Dependiendo de la longitud del sustrato de ARN, la alteración del porcentaje de poliacrilamida puede mejorar la resolución entre ARN sin fosforilado y fosforilado.
    2. Para disolver la urea, calentar la solución en el microondas durante 20 s, agitar el líquido, y volver a colocar inmediatamente la solución en el microondas durante otros 20 s. Revuelva suavemente la solución hasta que la urea se disuelva por completo.
    3. Enfríe lentamente la solución colocando el vaso de precipitados de vidrio en un baño de aguas poco profundas que contenga agua fría. Asegúrese de que el nivel de agua fría que rodea el vaso de precipitados de vidrio está por encima del nivel de solución dentro del vaso de precipitados de vidrio. Esto promoverá una transferencia de calor eficiente. Espere 5 min.
      NOTA: No continúe con este protocolo si el vaso de vidrio se siente caliente; el agua debe estar por debajo de 25 oC. Si todavía se siente caliente después de 5 minutos, a continuación, reemplace el agua en el baño de agua con agua fría fresca y esperar otros 5 minutos.
    4. Filtrar y desgascar la solución utilizando una unidad de filtración desechable de 0,22 m para eliminar partículas y burbujas de aire microscópicas.
  2. Vierta el gel desnatural.
    1. Utilice jabón y agua tibia para limpiar una placa de vidrio corta y larga diseñada para geles con dimensiones totales de 31,0 cm x 38,5 cm. Rocíe cada placa de vidrio con 95% de etanol y limpie el vidrio para eliminar cualquier humedad.
      NOTA: Una de las dos placas se puede siliconar para evitar daños en el gel al separar el sándwich de placa de vidrio. Sin embargo, este paso no es necesario porque este protocolo está diseñado para visualizar el ARN sin separar las placas de vidrio.
    2. Coloque la placa de vidrio larga horizontalmente en la parte superior de una caja para que se eleve fuera de la mesa.
      ADVERTENCIA: La acrilamida es tóxica, por lo tanto, la estación de vertido de gel debe estar cubierta en papel de banco que pueda absorber cualquier líquido derramado y colocarse inmediatamente en una bolsa de residuos una vez completado el procedimiento.
    3. Coloque un espaciador limpio de 0,4 mm a lo largo de los bordes largos de la placa de vidrio larga.
    4. Poner la placa de vidrio corta encima de la placa larga y asegurar que los bordes de la placa corta, placa larga, y espaciadores están alineados. Sujete cada lado con tres abrazaderas metálicas espaciadas uniformemente.
    5. Añadir 24 l de TEMED a la solución de urea de 15% de acrilamida/8 M preparada en el paso 3.1 y mezclar la solución.
    6. Añadir 600 l de APS al 10% (p/v) (ver paso 1.1.4) a la solución en el paso 3.2.5 y mezclar suavemente la solución.
    7. Verter inmediatamente la solución entre las placas de vidrio.
      NOTA: Para evitar burbujas, toque el vaso mientras se vierte la solución.
    8. Agregue cuidadosamente un peine limpio, de 0,4 mm y 32 pozos a la parte superior del sándwich de placa de vidrio.
    9. Permita un mínimo de 30 min para que la acrilamida se polimerice.
  3. Ejecuta el gel desnatural.
    1. Ajuste el bloque de calor a 75 oC.
    2. Retire las abrazaderas metálicas que sujetan el sándwich de placa de vidrio y lave y seque bien el sándwich de placa de vidrio.
    3. Coloque el sándwich de placa de vidrio en el aparato de gel con la placa corta orientada hacia adentro.
    4. Prepare el búfer de funcionamiento TBE de 0,5x combinando 100 ml de TBE de 10x con agua libre de RNase de 1,9 L. Añada 600 ml del tampón de funcionamiento a las cámaras superior e inferior del aparato de gel.
    5. Retire suavemente el peine y enjuague bien los pozos con una jeringa.
      NOTA: Este paso es fundamental para eliminar la urea de los pozos.
    6. Pre-ejecutar el gel durante 30 min a 50 W. El voltaje es de aproximadamente 2.000 V.
      ADVERTENCIA: Este aparato de gel funciona a una alta potencia y los usuarios deben exhibir precaución.
    7. Enjuague bien los pozos con una jeringa.
      NOTA: Este paso es fundamental para cargar incluso la muestra en los pozos.
    8. Pulse girar las reacciones agudadas del paso 2.2.5. A continuación, incubar los tubos a 75oC durante 3 min. Repite el giro del pulso.
    9. Cargue inmediatamente 10 ml de muestra por pozo y ejecute el gel durante 3 h a 50 W.
      NOTA: El ARN con etiqueta fluorescente es sensible a la luz; por lo tanto, cubra el aparato de gel con papel de aluminio.
  4. Imagen del gel desnatural.
    1. Apague la fuente de alimentación y drene la cámara superior del aparato de gel.
    2. Lave y seque el lado exterior del sándwich de placa de vidrio con agua y jabón. Cubra el sándwich de placa de vidrio con papel de aluminio mientras transporta el gel.
    3. Monte el sándwich de placa de vidrio en el escenario de un escáner láser capaz de detección cuantitativa y sensible de fluorescencia.
      NOTA: Este gel es extremadamente delgado para una resolución máxima. Por esta razón, este protocolo está diseñado para evitar las dificultades de retirar el gel del sándwich de placa de vidrio mediante la visualización directa del ARN con etiqueta fluorescente a través de las placas de vidrio. El uso de placas de vidrio de baja fluorescencia disponibles comercialmente aumentará la señal capturada mejorando la relación señal-ruido.
    4. Establezca las longitudes de onda de excitación y emisión del escáner láser para el fluoróforo deseado.
      NOTA: Las longitudes de onda óptimas de excitación y emisión pueden diferir para fluoróforos específicos. Para el fluoróforo FAM, las longitudes de onda de excitación y emisión son de 495 nm y 535 nm, respectivamente.
    5. Defina el área que se visualizará en la etapa del escáner láser e imagen del gel de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Figura 1).

4. Análisis de imágenes y cuantificación de señales

  1. Cargue la imagen de gel digital adquirida en el paso 3.4.5 en el software de procesamiento de imágenes (consulte Tabla de materiales).
  2. Con el botón izquierdo del ratón, haga clic y arrastre un rectángulo para definir un cuadro de plantilla para marcar los límites de la imagen de gel digital que se utilizará para cuantificar cada banda de ARN. La banda de ARN vista en la mezcla de reacción establecida en ausencia de enzima PNK es generalmente una buena banda para generar esta plantilla.
    NOTA: Para evitar el sesgo causado por la señal de fondo, es fundamental que el área que rodea cada banda de ARN que se mide sea idéntica. Por esta razón, es mejor utilizar el mismo cuadro de plantilla para demarcar cada banda de ARN.
  3. Abra el Administrador de ROI en"Herramientas"y marque la posición del cuadro de plantilla haciendo clic en "Agregar".
    NOTA: Los programas de cuantificación también pueden dibujar cuadros automáticamente siguiendo el manual del usuario del software.
  4. Con el botón izquierdo del ratón, haga clic y arrastre el cuadro de plantilla a la siguiente banda de ARN y repita el paso 4.3. Continuar este proceso hasta que se haya marcado la posición de todas las bandas de ARN sin fosforilado y fosforilado en cada reacción.
  5. Mida la densidad integrada dentro de cada cuadro haciendo clic en"Medir"en el Administrador de ROI.
  6. Para calcular la cantidad relativa de ARN fosforilado en una reacción, divida la densidad integrada de la banda de ARN fosforilada por la suma de las densidades integradas de las bandas de ARN no fosforiladas y fosforiladas de la misma reacción. Este enfoque también se puede aplicar para calcular la cantidad relativa de ARN no fosforilado.
  7. Para visualizar la acumulación de producto de ARN fosforilado y el correspondiente agotamiento del sustrato de ARN sin fosforilado en toda la serie de concentración de ATP, trazar la cantidad relativa de ARN calculado en el paso 4.6 contra la concentración de ATP.

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Resultados

Un gel de desnaturalismo representativo exitoso de una valoración de ATP con una cantidad fija del complejo Las1-Grc3 se muestra en la Figura 1. La adición de enzimas dio lugar a la escisión de ARN mediada por Las1 del sustrato de ARN SC-ITS2, lo que dio lugar a un fragmento de ARN definido (ARN C2 de 5-OH C2). Tras la adición de ATP, el fragmento de ARN C2 fue fosforilado por Grc3 PNK (5-P C2 RNA). En geles desnaturalados, el ARN fosforilado migra más rápido...

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Discusión

Se describe un ensayo para medir la actividad quinasa de Grc3 PNK en sustratos de nucleótidos con etiqueta fluorescente. Este protocolo se puede aplicar para caracterizar otras enzimas PNK adaptando el búfer de reacción y el sustrato de oligonucleótido. Por ejemplo, el protocolo requiere una cantidad de seguimiento de EDTA. La adición de EDTA es beneficiosa por dos razones: En primer lugar, este enfoque favorece grc3 unido al magnesio al impedir que la enzima se une a cantidades traza de metales contaminantes en la mezcl...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Agradecemos al Dr. Andrew Sikkema y Andrea Kaminski por su lectura crítica de este manuscrito. Este trabajo fue apoyado por el Programa de Investigación Intramuros del Instituto Nacional de Salud de los Estados Unidos; Instituto Nacional de Ciencias de la Salud Ambiental de los Estados Unidos (NIEHS; ZIA ES103247 a R.E.S) y los Institutos Canadienses de Investigación Sanitaria (CIHR; 146626 a M.C.P).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
0,4 mm Peine de 34 pocillosBioRad1653848
Espaciador de 0,4 mmBioRad1653812
0,5 M EDTA ph 8.0KD MedicalRGF-3130
1M Cloruro de magnesioKD MedicalCAC-5290
1M Tris pH 8.0KD MedicalRGF-3360
40% Acrylamida/Bis Solución 29:1BioRad
5M Cloruro de sodioKD MedicalRGF-3720
persulfato de amonio (APS)BioRad161-0700
ATPSigmaA2383-1G
ácido bóricoSigmaB0394
sal de sodio azul de bromofenolSigmaB5525-5G
Placas de vidrioThomas Scientific1188K51
Secuenciador Hoefer SQ3 HoeferN/A
Image J SoftwareN/AN/Ahttps://imagej.nih.gov/ij/
Oligonucleótidos de ARN marcadosIDTPedido
Pharmacia EPS 3500 Fuente de alimentaciónPharmaciaN/A
Steriflip 0. 22 mmm FiltroMillipore5FCP00525
TEMEDBioRad161-0800
tris baseSigmaTRIS-RO
Typhoon FLA 9500 generador de imágenes en gelGE HealthcareN/A
Ultra Pure DEPCInvitrogen750023
Ultra Pure GlycerolInvitrogen19E1056865
ureaFisher ChemicalU15-500
1610146personalizado Water

Referencias

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Ensayo no radioactivo para medir la fosforilación de polinucleótido de sustratos de nucleótidos pequeños
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