Una pantalla genética hacia adelante basada en la elevación de Ca2+ como lectura conduce a la identificación de los componentes genéticos involucrados en las vías de señalización dependientes del calcio en las plantas.
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Artículo de método
Antaño de la pantalla genética utilizando la aequorin de la reportera transgénica de calcio para identificar nuevas metas en la señalización del calcio
En este artículo
Resumen
Resumen
Las pruebas genéticas directas han sido herramientas importantes en la identificación imparcial de los componentes genéticos implicados en varias vías biológicas. La base de la pantalla es generar una población mutante que se puede examinar con un fenotipo de interés. El SME (sulfonato de metano etílico) es un agente alquilante comúnmente utilizado para inducir mutaciones aleatorias en una pantalla genética avanzada clásica para identificar múltiples genes implicados en cualquier proceso dado. La elevación del calcio citosólico (Ca2+)es una vía clave de señalización temprana que se activa tras la percepción del estrés. Sin embargo, la identidad de los receptores, canales, bombas y transportadores de Ca2+ sigue siendo esquiva en muchos sistemas de estudio. Aequorin es una proteína de reportero de calcio celular aislada de Aequorea victoria y expresada stably en Arabidopsis. Aprovechando esto, diseñamos una pantalla genética hacia adelante en la que el SME mutaba la aequorin transgénica. Las semillas de las plantas mutantes fueron recolectadas (M1) y la detección del fenotipo de interés se llevó a cabo en la población segregadora (M2). Usando un protocolo de medición Ca2+ de alto rendimiento de 96 pozos, se pueden identificar varios mutantes novedosos que tienen una respuesta de calcio variable y se miden en tiempo real. Los mutantes con el fenotipo de interés son rescatados y propagados hasta obtener una población de plantas mutantes homocigotas. Este protocolo proporciona un método para las pantallas genéticas directas en los antecedentes de los reporteros de Ca2+ e identificar nuevos objetivos regulados de Ca2+.
Introducción
Un cambio en la concentración de calcio citosólico (Ca2+)tras la percepción del estímulo biótico o abiótico es un evento de señalización temprana bien estudiado que activa muchas vías de señalización1,2,3,4. Una célula en su estado de reposo basal mantiene una menor concentración de Ca2+ en el citosol y secuestra el exceso de Ca2+ en varios orgánulos intracelulares y apoplasto extracelular que conduce a un pendiente de Ca2+ 5,,6. Tras la pe....
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Protocolo
1. Mutagénesis de EMS y colección de semillas única basadas en pedigrí (1-3 meses)
- Pesar 150 mg de semillas (7500) de aequorin para EMS mutagénesis (semillas M0). Pesar otros 150 mg de semillas para ser utilizadas como control.
- Transfiera las semillas a un tubo de 50 ml y añada 25 ml de 0,2% emS (v/v) (CAUTION) (para tratamiento) o 25 ml de agua autoclavada (para control).
NOTA: El sulfonato de etil-metano es un agente químico para mutagenizar el material vegetal. - Selle el tubo con parafilm y envuélvalo en papel de aluminio. Gire el extremo final del tubo durante 18 h a temperatura ambiente.
- Deje que las semillas s....
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Resultados
La población de EMS se hizo un anzado paralaelevación de Ca 2+ inducida por H 2 O2. 2+ Como se discutió anteriormente, 12 plántulas M2 individuales fueron examinadas desde cada línea M1. En la Figura 3,una de esas líneas M1 se traza con cada panel mostrando 12 plántulas M2 individuales. Una aequorin de tipo salvaje se utiliza como control para comparar y evaluar la respuesta mutante. Un mutante recesivo se separa en.......
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Discusión
La mutagénesis del SME es una poderosa herramienta para generar mutaciones en la población. Las pantallas genéticas delanteras clásicas que utilizan EMS han sido una herramienta eficaz para identificar genes nuevos por dos razones principales: en primer lugar, no requieren ninguna suposición previa sobre la identidad génica y, en segundo lugar, no introducen ningún sesgo. Existen varios métodos para generar poblaciones de cribado como EMS, inserciones de ADN-T, radiaciones, etc. De todos los métodos, la mutagénesis basad.......
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Divulgaciones
Ninguno de los autores tiene conflictos de intereses que declarar.
Agradecimientos
Agradecemos al Instituto Nacional de Investigación del Genoma Vegetal - Phytotron Facility por el crecimiento de las plantas, Bombay Locale por la sesión de vídeo y el Departamento de Biotecnología- Consorcio eLibrary por proporcionar acceso a los recursos electrónicos. Este trabajo fue apoyado por el Departamento de Biotecnología de la India a través del National Institute of Plant Genome Research Core Grant, programa Max Planck Gesellschaft-India Partner Group; y la Beca de Investigación CSIR-Junior (a D.M y S.M) y al Departamento de Biotecnología-Beca de Investigación Junior (a R.P).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos | Jetbiofil | 11024 | para el cultivo de plántulas |
| cliniplate blanco de 96 pocillos | Thermo Scientific | 9502887 | para mediciones de luminómetro |
| Aequorin | |||
| Agropet | Lab Chem India | para el crecimiento de las plantas | |
| Cloruro de calcio | Fisher Scientific | 12135 | para descarga solución |
| Celenterazina | PJK | 55779-48-1 | grupo protésico para aequorina |
| Sultoneato de etilaminano | Sigma Aldrich | M0880-5G | para mutagénesis |
| de semillas Etanol | Reactivo analítico | 1170 | para solución de descarga |
| Ácido clorhídrico | Merck Life Sciences | 1.93001.0521 | solución de esterilización |
| Peróxido de hidrógeno | Fisher Scientific | 15465 | como estímulo para la elevación del calcio |
| Ascenso de Luminoskan | Thermo Scientific | 5300172 | medición de luminiscencia de aequorin |
| Tampón MES | Himedia | RM1128-100G | crecimiento de plantas |
| Murashige y skoog media | PT021-25L | plantas | Hidróxido |
| de sodio | Fisher Scientific | 27805 | para neutralizar EMS |
| Hipoclorito de sodio | Merck Life Sciences | 1.93607.5021 | solución de esterilización |
| Tiosulfato de sodio | Fisher Scientific | 28005 | para el lavado de semillas en el paso 1.6 |
| soilrite | Lab Chem India | para el crecimiento | |
| de plantas macetas cuadradas | Lab Chem India | para el crecimiento de plantas | |
| Sacarosa | Sigma Aldrich | S0389 | crecimiento de plantas |
| Taxim | Alkem 7180720 | para el rescate de plántulas |
Referencias
- Kudla, J., Batistic, O., Hashimoto, K. Calcium signals: The lead currency of plant information processing. The Plant Cell. 22 (3), 541-563 (2010).
- Wasternack, C., Hause, B.
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Reimpresiones y permisos
