Un protocolo mejorado para purificar y directamente monobiocalinato recombinante BDNF en un tubo para estudios de tráfico celular en neuronas

Resumen

BDNF recombinante que contiene una secuencia Avi (BDNFAvi) se produce en células HEK293 de una manera rentable y se purifica mediante cromatografía de afinidad. BDNFavi es entonces directamente monobiontilado con la enzima BirA en un tubo. BDNFavi y BDNFavi monobionicionados conservan su actividad biológica en comparación con BDNF disponible comercialmente.

Resumen

BdNF recombinante que contiene una secuencia Avi (BDNFAvi) se produce en células HEK293 y luego se purifica de manera rentable mediante cromatografía de afinidad. Se desarrolló un protocolo reproducible para directamente el monobiotinilato BDNFAvi con la enzima BirA en un tubo. En esta reacción, el BDNFAvi monobionitilado conserva su actividad biológica.

Las neurotrofinas son factores de crecimiento derivados de objetivos que juegan un papel en el desarrollo y mantenimiento neuronal. Requieren mecanismos de transporte rápido a lo largo de la vía endocítica para permitir la señalización de larga distancia entre diferentes compartimentos neuronales. El desarrollo de herramientas moleculares para estudiar el tráfico de neurotrofinas ha permitido el seguimiento preciso de estas proteínas en la célula utilizando la grabación in vivo. En este protocolo, desarrollamos un procedimiento optimizado y rentable para la producción de BDNF monobionitilado. Una variante BDNF recombinante que contiene una secuencia avi biotinipilable (BDNFAvi) se produce en células HEK293 en el rango de microgramos y luego se purifica en un procedimiento fácilmente escalable utilizando cromatografía de afinidad. El BDNF purificado puede ser homogéneamente monobioniizado por una reacción in vitro directa con la enzima BirA en un tubo. La actividad biológica del BDNF monobiotinilado (mbtBDNF) se puede conjugar con estreptavidina conjugada con diferentes fluoróforos. BDNFAvi y mbtBDNF conservan su actividad biológica demostrada mediante la detección de objetivos fosforilados aguas abajo utilizando la mancha occidental y la activación del factor de transcripción CREB, respectivamente. Usando puntos estreptavidina-cuánticos, pudimos visualizar la internalización mbtBDNF concomitante con la activación de CREB, que se detectó con un anticuerpo específico fosfo-CREB. Además, mbtBDNF conjugado con puntos estreptavidina-cuánticos era adecuado para el análisis de transporte retrógrado en neuronas corticales cultivadas en cámaras microfluídicas. Por lo tanto, en tubo producido mbtBDNF es una herramienta fiable para estudiar la señalización fisiológica dinámica endosome y el tráfico de neuronas.

Introducción

Las neuronas son las unidades funcionales del sistema nervioso que poseen una morfología compleja y especializada que permite la comunicación sináptica, y por lo tanto, la generación de comportamiento coordinado y complejo en respuesta a diversos estímulos. Las proyecciones neuronales como las dendritas y los axones son características estructurales críticas implicadas en la comunicación neuronal, y las neurotrofinas son actores cruciales para determinar su morfología y función^1. Las neurotrofinas son una familia de factores de crecimiento secretados que incluyen NGF, NT-3, NT-4 y factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF)

Protocolo

Todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices aprobadas del CONICYT (Comisión Nacional Chilena de Investigación Científica y Tecnológica). Los protocolos utilizados en este estudio fueron aprobados por los Comités de Bioseguridad y Bioética y Bienestar Animal de la Pontificia Universidad Católica de Chile. Los experimentos con vertebrados fueron aprobados por el Comité de Bioética y Bienestar Animal de la Pontificia Universidad Católica de Chile.

NOTA: El siguiente protocolo fue diseñado para purificar BDNFAvi a partir de un volumen total de 500 ml de medio acondicionado producido en células HEK293. La cantidad de....

Resultados

El uso de un protocolo cromatográfico basado en columnas permite el procesamiento de volúmenes significativos de medios condicionados HEK293. En la Figura 1se muestran los resultados de la purificación de BDNFAvi a partir de 500 ml de medios acondicionados. Las eluciones consecutivas de BDNFAvi de las cuentas de agarosa de Ni-NTA producen concentraciones decrecientes de BDNFAvi (Figura 1A). Después de cuatro eluciones consecutivas (cada una con una duración de 1.......

Discusión

En este artículo, se describe una metodología optimizada para la producción y purificación de mbtBDNF en un procedimiento basado en cromatografía de afinidad, basada en el trabajo de Sung y colaboradores^17. Las optimizaciones incluyen el uso de un reactivo de transfección (PEI) rentable mientras se mantiene la eficiencia de métodos de transfección más caros como la lipofectamina. Esta optimización se traduce en una reducción significativa de los costos en el protocolo, lo que permite la escalabili.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Llave de paso de 2 vías	BioRad	7328102	Componente del aparato de cromatografía
2-mercaptoetanol	Sigma	M6250	Tampón de elución BDNF
Acrilamida/Bisacrilamida	BioRad	1610154	SDS-PAGE Preparación de gel
Amicon Ultra-15 10K	Millipore	UFC901024	concentración de BDNF
Persulfato de amonio	Sigma	A9164	SDS-PAGE Preparación de gel
anticuerpo anti B-III-Tubulina	Sigma	T8578	Ensayos de Western blot para la detección de actividad biológica BDNF
anticuerpo anti BDNF	Alomone	AGP-021	Ensayos de Western blot para la cuantificación de BDNF
anticuerpo anti BDNF	Alomone	ANT-010	Ensayos de Western blot para la cuantificación de BDNF
Anticuerpo Anti ERK	Cell Señalización	9102	Ensayos de Western blot para la detección de la actividad biológica de BDNF
anticuerpo anti pCREB (S133)	Señalización celular	9198	Ensayos de Western blot para la detección de la actividad biológica de BDNF
anticuerpo anti pERK (T202, Y204)	Señalización celular	4370	Ensayos de Western blot para la detección de la actividad biológica de BDNF
anticuerpo anti pTrkB (Y515)	Abcam	ab109684	Ensayos de Western blot para la detección de la actividad biológica del BDNF
Antibióticos/antimicóticos	Gibco	15240-062	HEK293 Mantenimiento
ATP	Sigma	A26209	Tampón de monobiotinilación BDNF
B-27 Suplemento	Gibco	17504-044 Mantenimiento de	neuronas
Bicine	Sigma	B3876	Tampón de monobiotinilación BDNF
BirA-GST	BPS Bioscience	70031	Enzima para la monobiotinilación de BDNF AviTag
Suero fetal bovino	HyClone	HC. SH30396.02	Mantenimiento de HEK293
Albúmina sérica bovina	Jackson ImmunoResearch	001-000-162	Componente de modificación del tampón BDNF, tampón de bloqueo para Western blot e inmunofluorescencia
D-Biotina	Sigma	B4639	Tampón de monobiotinilación BDNF
DMEM Medio de alta glucosa	Gibco	11965-092	Semilla de neuronas
DMEM Medio	Gibco	11995-081	HEK293
mantenimiento embudo de columna Econo	BioRad	7310003	Componente del aparato de cromatografía
EDTA	Merck 108418
EZ-ECL Kit Biological	1633664	Detección de proteínas por Western blot
Glutamax	Gibco	35050-061	Mantenimiento de Neuron y HEK293
Glycerol	Merck	104094	Tampón de elución BDNF, tampón de lisis para ensayos de Western blot
Centrífuga Hettich Rotina 46R Centrífuga	descontinuada	Hettich	utilizada para limpiar el medio de escombros
Centrífuga universal Hettich 32R Centrífuga	descontinuada	Hettich	utilizada para la centrifugación del concentrador de proteínas
Suero de caballo	Gibco	16050-122	Siembra de neuronas
ImageQuant LAS 500	GE Healthcare Life Sciences	29005063	Western blot adquisición de imágenes
Imidazol	Sigma	I55513	Componente de modificación de tampón
BDNF KCl	Winkler	BM-1370	PBS componente
KH2PO4	Merck	104873	componente PBS
Laminin	Invitrogen	23017-015 Recubrimiento de	cubierta para neuronas compartimentadas
Luer Tubing Adaptor	BioRad	7323245	componente del aparato de cromatografía
Luminata™ Forte Western HRP Substrate	Millipore WBLUF0100		Detección de proteínas mediante Western blot
Mg(CH3COO)2	Merck	105819	tampón de monobiotinilación BDNF
Mowiol 4-88	Calbiochem	475904	Reactivo de montaje para ensayos de inmunofluorescencia
MyOne C1 Streptavidin Magnetic Beads	Invitrogen	65001	Verificación de biotinilación
Na2HPO4	Merck	106586	Componente de modificación del tampón BDNF
NaCl	Winkler	BM-1630	Componente PBS, componente de modificación del tampón BDNF
NaH2PO4	Merck	106346	Componente de modificación del tampón BDNF
Medio neurobasal	Gibco	21103-049	Mantenimiento de neuronas
Ni-NTA Agarose	Beads Qiagen	30210	BDNF Purificación
AviTag Nikon Ti2-E	Microscopio Nikon		para imágenes de fluorescencia
Membrana de nitrocelulosa	BioRad	1620115	Transferencia de proteínas para Western blot
ORCA-Flash4.0 V3 Cámara CMOS digital	Hamamatsu	C13440-20CU	Cámara para imágenes de epifluorescencia
P8340 Cóctel de inhibidores de la proteasa	Sigma	P8340	Componente de modificación del tampón BDNF
Paraformaldehído	Merck	104005	Fijador para ensayos de inmunofluorescencia
Penicilina/Estreptomicina	Gibco	15140-122	Mantenimiento de neuronas
Poli-D-Lisina	Corning		DLW354210 Recubrimiento de cubierta para neuronas compartimentadas
Poli-L-Lisina	Millipore	P2363	Recubrimiento de cubierta para neuronas no compartimentadas
Columna de cromatografía Poly-Prep BioRad		7311550	Componente del aparato de cromatografía
Polietileneimina 25K	Polysciences Inc.	PLY-0296	HEK293 transfección
Puntos cuánticos 655 conjugado de estreptavidina	Invitrogen Q10121MP		Etiqueta AviTag de BDNF monobiotinilado para experimentos con células vivas y fijas
Saponina	Sigma	S4521	Detergente para ensayos de inmunofluorescencia
Syldgard 184 base de elastómero de silicona	Poirot	4019862	Preparación de la cámara microfluídica
TEMED	Sigma	T9281	SDS-PAGE Preparación de gel
Tris	Winkler	BM-2000	Componente tampón de lisis
Triton X100	Merck	108603	permeabilización celular en ensayos de inmunofluorescencia y Western blot
Tripsina-EDTA 0,5%	Gibco	15400-054	HEK293 paso

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