MRM Microcoil Performance Calibration and Usage Demonstrated on Medicago truncatula Roots at 22 T

Resumen

Se presenta un protocolo para estudiar el tejido biológico a alta resolución espacial utilizando microscopía de resonancia magnética de campo ultra alto (MRM) utilizando microcobinas. Se proporcionan instrucciones paso a paso para caracterizar las microcobalas. Por último, la optimización de las imágenes se demuestra en las raíces de las plantas.

Resumen

Este protocolo describe un método de calibración y preparación de muestras de relación señal-ruido (SNR) para microcoflicciones solenoidales combinadas con muestras biológicas, diseñadas para imágenes de resonancia magnética (RM) de alta resolución, también conocidas como microscopía MR (MRM). Se puede utilizar en espectrómetros de RMN preclínicos, demostrados en muestras de raíz de truncatula de Medicago. Las microcobinas aumentan la sensibilidad al hacer coincidir el tamaño del resonador de RF con el tamaño de la muestra de interés, lo que permite resoluciones de imagen más altas en un tiempo de adquisición de datos determinado. Debido al diseño relativamente simple, las microcoflijas solenoidales son sencillas y baratas de construir y se pueden adaptar fácilmente a los requisitos de la muestra. Sistemáticamente, explicamos cómo calibrar microcollas nuevas o caseras, utilizando una solución de referencia. Los pasos de calibración incluyen: determinación de potencia de pulso utilizando una curva de nutation; estimación de la homogeneidad del campo RF; y calcular una relación señal-ruido (SNR) normalizada por volumen utilizando secuencias de pulsos estándar. Se discuten pasos importantes en la preparación de muestras para pequeñas muestras biológicas, así como posibles factores atenuantes como las diferencias de susceptibilidad magnética. Las aplicaciones de una bobina solenoide optimizada se demuestran con imágenes 3D de alta resolución (13 x 13 x 13 m^3, 2,2 pL) de una muestra de raíz.

Introducción

La resonancia magnética es una herramienta versátil para la imagen no invasiva de una amplia variedad de muestras biológicas, que van desde humanos hasta células individuales^1,2,3. Mientras que los escáneres de RMN para aplicaciones de imágenes médicas suelen utilizar imanes con una intensidad de campo de 1,5 T a 3 T, las aplicaciones de una sola celda se visualizan a intensidades de campo mucho más altas^1,3,4. El estudio de muestras a resoluciones inferiores a cien micrómetros se conoce como microscopía de resonancia magnética (MRM)⁵. Sin embargo, MRM sufre de una baja relación señal-ruido (SNR) en comparación con otras técnicas disponibles de microscopía o imagen (por ejemplo, microscopía óptica o TC). Se pueden seguir varios enfoques para optimizar SNR⁶. Un enfoque consiste en utilizar una mayor intensidad de campo magnético, mientras que un enfoque complementario es optimizar el detector de señal para muestras individuales. Para este último, las dimensiones del detector deben ajustarse para que coincidan con las dimensiones de la muestra de interés. Para muestras pequeñas de ≈0,5-2 mm de diámetro (por ejemplo, tejidos radiculares), las microbobinas son útiles ya que el SNR es inversamente proporcional al diámetro de la bobina^6,7. Se han alcanzado resoluciones de hasta 7,8 x 7,8 x 15 m³ en células animales utilizando microcoils dedicados^8. Existe una variedad de tipos de microcobinas, con bobinas planas y solenoides más utilizadas dependiendo de la aplicación y la geometría del tejido^9. Las bobinas planas tienen una alta sensibilidad cerca de su superficie, lo que es útil para aplicaciones en rodajas finas. Por ejemplo, se ha descrito un método diseñado específicamente para la toma de imágenes de tejido perfundido para microcoflijas planas¹⁰. Sin embargo, las bobinas planas tienen una alta caída de sensibilidad y ninguna potencia de pulso de referencia bien definida. Las bobinas solenoides, siendo cilíndricas, tienen un área de aplicación más amplia y son más favorecidas por muestras más gruesas. Aquí, describimos las características de la bobina solenoide, un protocolo para preparar muestras para la RMN de microcoil, así como la calibración de una microbobina solenoide (Figura 1A).

La bobina solenoide consiste en un alambre conductor enrollado, como un sacacorchos, alrededor de un capilar que sostiene la muestra (Figura 1B). Los conjuntos de microcoil se pueden construir utilizando sólo alambre de cobre esmaltado, una variedad de capacitores y una base adecuada para soldar los componentes (Figura 1B). Las principales ventajas son la simplicidad y el bajo costo, combinado con buenas características de rendimiento en términos de SNR por volumen de unidad y homogeneidad de campo B_1. La facilidad de construcción permite una rápida iteración de diseños de bobinas y geometrías. Los requisitos específicos de diseño de microcobos solenoide y caracterización de sondas (esdecir, la teoría de la electrónica, mediciones de la mesa de trabajo y mediciones de espectrómetros para una variedad de geometrías de bobinas) se han descrito extensamente en otros lugares^{7,11,12,13,14}.

Una bobina solenoide se puede construir teniendo en cuenta las reglas de diseño para las dimensiones deseadas de acuerdo con las directrices descritas en otros lugares^15,16. En este caso específico, se utilizó una bobina con un diámetro interior de 1,5 mm, hecha de alambre de cobre esmaltado, de 0,4 mm de diámetro, en bucle alrededor de un capilar de 1,5 mm de diámetro exterior. Este solenoide se mantiene en una placa base sobre la que se hace un circuito, compuesto por un condensador de afinación (2,5 pF), un condensador de coincidencia variable (1,5-6 pF) así como cables de conexión de cobre(Figura 1A, 1C). El condensador de ajuste se elige para lograr la frecuencia resonante deseada de 950 MHz, mientras que el condensador coincidente se elige para lograr la transmisión de señal máxima a una impedancia de 50 ohmios. El condensador más grande es variable para permitir un ajuste más fino. En el funcionamiento regular, el ajuste y la coincidencia se realizan utilizando capacitores en la base de la sonda. La microcoil montada debe montarse en una sonda para que pueda insertarse en el imán. Es posible que se requiera un soporte adicional, dependiendo del sistema. Aquí utilizamos una combinación de imán de 22,3 T con una consola Bruker Avance III HD en combinación con una sonda Micro5. En este caso, utilizamos un inserto de soporte modificado equipado con las conexiones necesarias para conectarse al canal ¹H de la sonda (Figura 1A).

El diseño de la bobina con susceptibilidad incluye un depósito con líquido perfluorado para reducir las desaceptabilidades de la susceptibilidad, derivado de que la bobina de cobre esté muy cerca de la muestra^17. Se hizo un depósito de una jeringa de plástico para encerrar la bobina y se llenó de fomblin. Como el líquido perfluorado necesita encerrar la bobina, el diámetro disponible para una muestra se reduce a un diámetro exterior de 1 mm. Para facilitar el cambio de la muestra, la muestra se preparó en un capilar con un diámetro exterior de 1 mm y un diámetro interior de 700 m. Las herramientas necesarias para la preparación de muestras se muestran en la Figura 2A.

Los parámetros básicos de RM experimental dependen en gran medida del hardware del sistema utilizado, incluido el sistema de gradiente, la intensidad de campo y la consola. Se pueden utilizar varios parámetros para describir el rendimiento del sistema, de los cuales la longitud y potencia del pulso de 90o, la homogeneidad B₁y la SNR por volumen de unidad (SNR/mm^3),son las más relevantes. SNR/mm³ es útil para comparar el rendimiento de diferentes bobinas en el mismo sistema¹⁸. Si bien pueden existir diferencias de hardware entre sistemas, la aplicación uniforme de un protocolo de benchmarking también facilita la comparación del rendimiento del sistema.

Este protocolo se centra en la calibración y la preparación de muestras. Se muestra la caracterización escalonada del rendimiento de las microcoils solenoide: calibrando la longitud o potencia del pulso de 90o; evaluar la homogeneidad del campo RF; y el cálculo de SNR por volumen unitario (SNR/mm³). Se describe una medición de eco de giro estandarizada utilizando un fantasma para facilitar una comparación de los diseños de bobinas, lo que permite la optimización de aplicaciones distintas. Se describen los preparados de muestras de muestras fantasma y biológicas, específicas para microbobinas. El protocolo puede aplicarse en cualquier imán vertical adecuado de diámetro estrecho (≤60 mm) equipado con un sistema de microimagen disponible en el comercio. Para otros sistemas, puede servir como una guía y se puede utilizar con algunos ajustes.

La preparación biológica de muestras para las mediciones de RMN generalmente no es muy extensa, ya que la muestra se muestra lo más intacta posible. Sin embargo, los espacios de aire en el tejido biológico pueden causar artefactos de imagen debido a diferencias en la susceptibilidad magnética¹⁹. El efecto aumenta con el aumento de la fuerza del campo magnético²⁰. Por lo tanto, los espacios de aire deben evitarse a altas intensidades de campo, y esto podría requerir la inmersión de la muestra en un fluido para evitar el aire alrededor del tejido y la eliminación de espacios de aire dentro de las estructuras de tejido. Específicamente, cuando se emplean microcoflicciones, puede ser necesaria la escisión del tejido de muestra deseado, seguido de sumergirlo en un fluido adecuado. Esto es seguido por la inserción de la muestra en un capilar precortado, y finalmente sellar el capilar con cera capilar. El uso de cera como sellador en lugar de pegamento, sellado de llamas o alternativas, significa que la muestra puede extraerse fácilmente. Este procedimiento se demuestra en la raíz de Medicago truncatula, una pequeña planta leguminosa. Una ventaja de este protocolo es la posibilidad de un posterior registro conjunto de datos de RMN con microscopía óptica, ya que la muestra no se destruye durante la medición de la RMN.

El protocolo presentado es adecuado para mediciones in situ de alta resolución espacial, y diseños más elaborados podrían permitir la toma de imágenes de muestras in vivo, donde los desafíos relacionados con los sistemas de soporte vital tendrían que ser abordados.

Protocolo

NOTA: Este protocolo describe los procedimientos de uso y evaluación de las características de la bobina de una bobina solenoide de 1,5 mm de diámetro interior (ID)(Figura 1). La bobina utilizada para demostrar el protocolo está alojada en un depósito con coincidencia de susceptibilidad, pero el protocolo es igualmente aplicable a bobinas sin igual. El protocolo puede adaptarse a otros tamaños y configuraciones de espectrómetro diferentes.

1. Preparación de muestras de referencia

1. Para preparar 100 ml de la solución de referencia de sensibilidad, disolver 156,4 mg de CuSO₄ a 5 H₂O en 80 ml de D₂O contenido en un matraz GL45 de 100 ml. El sulfato de cobre reduce el tiempo de relajación T₁ y T_2, lo que permite mediciones más rápidas, mientras que el D₂O evita la amortiguación de la radiación y los efectos de saturación. Revuelva manualmente hasta que los sólidos se disuelvan por completo.
   1. Ajuste el volumen a 100 ml utilizando agua desionizada para una concentración final de 1 g/L CuSO₄ (anhidro, 6,3 mM). Esta concentración es suficiente para acortar la relajación T₁ y T₂ pero no demasiado alta para ser afectada por la precipitación. Selle la muestra de referencia para evitar que se cambie la relación de H₂O: D₂O.
2. Opcionalmente, conecte la sonda a un analizador de red, para probar si la bobina resuena en la frecuencia de resonancia deseada. Realice una prueba de reflectancia S₁₁ para medir el rango de frecuencia alcanzado mediante el ajuste y para las mediciones de factor Q como se describe detalladamente por Haase et al.¹⁴. Conecte la microcoil al analizador de red mediante un cable coaxial. Utilice un cable adaptador BNC si es necesario.
   1. Establezca la frecuencia central en el analizador de red a la frecuencia resonante deseada, dependiendo de la intensidad de campo magnético prevista para la que se diseñe la bobina. A continuación, establezca el ancho de barrido en 10 MHz. Ajuste el condensador variable en el conjunto de microcoil, si está presente, para ajustar la inmersión de reflectancia a la frecuencia deseada.
   2. Registre el nivel de reflectancia en la frecuencia central y la frecuencia f₁ y f₂ en el nivel de -7 dB. Utilícelos para calcular el factor Q en el nivel de -7 dB según Haase et^al.

2. Preparación de muestras

1. Si prepara una muestra de referencia para la calibración de la bobina, transfiera 1 ml de solución CuSO₄ a una placa de vidrio de reloj bajo un estereomicroscopio.
2. Si prepara una muestra biológica, transfiera 1 ml de perfluorodecalin (PFD) a un cristal de reloj bajo un estereomicroscopio, que se utilizará para sumergir la muestra. La PFD se utiliza ya que puede llenar espacios de aire en la muestra, sin entrar en células biológicas. Tampoco es observable por la RMN de protones. Cubra inmediatamente el vaso del reloj con una tapa de la placa Petri para evitar la pérdida evaporativa, antes de que se necesite el PFD.
   NOTA: La PFD es altamente volátil y un potente gas de efecto invernadero a largo plazo²¹. Cuando sus propiedades de disolución de oxígeno y su baja viscosidad no son necesarias, puede ser sustituido por Fomblin, un perfluoroéter que tampoco da ninguna señal observable ^{de 1}H, pero que no se evapora tan rápidamente¹⁷.
3. Cortar capilares de diámetro exterior adecuado a tamaño, para caber dentro del diámetro del soporte de microbobina (18 mm) y permitir el reposicionamiento (Figura 1C). Utilice un cortador de cerámica para hacer una incisión cada 10-12 mm y romper cuidadosamente en el punto de incisión.
4. Si prepara una muestra de referencia, utilice pinzas y el estereomicroscopio para poner un capilar precortado en contacto con la superficie de la solución CuSO₄ dentro del cristal del reloj, lo que permite que la acción capilar llene el capilar.
5. Si prepara una muestra biológica, utilice pinzas y un estereomicroscopio para poner un capilar precortado en contacto con la superficie del PFD dentro del cristal del reloj, permitiendo que la acción capilar llene el capilar completamente. Suelte el capilar en el cristal del reloj para que quede completamente sumergido.
   1. Extraiga cuidadosamente un sistema radicular entero de cinco semanas de edad de su sustrato de crecimiento, como un reemplazo de suelo de perlita. Limpie la muestra de raíz meticulosamente de rizosheath. Retire las partículas grandes del suelo usando pinzas, y si hay partículas más pequeñas, retírelas lavando el sistema radicular con agua destilada. Fotografía si es necesario para futuras referencias. Seleccione e excime una pequeña sección de raíz fibrosa libre de rizos con un bisturí.
   2. Para el tratamiento al vacío, coloque la muestra en un tubo de 1,5 ml que contenga una solución fijadora adecuada. Deje la tapa del tubo fuera y luego selle el tubo con parafilm para sellar la abertura del tubo. A continuación, perforar agujeros en la película con una herramienta afilada para permitir la ventilación del tubo.
   3. Coloque el tubo de muestra en una cámara de vacío, selle la cámara y conecte una bomba de vacío de membrana de laboratorio a la cámara. Somete la muestra al tratamiento al vacío durante un máximo de 30 minutos, para reducir la presencia de bolsas de aire dentro de muestras biológicas. Detenga el tratamiento de vacío cuando no se vean burbujas de aire escapando de la muestra.
   4. Mientras mira a través de un estereomicroscopio, utilice pinzas para sumergir la muestra en el medio de infiltración preparado previamente. Lave la muestra de residuos potenciales.
   5. Inserte la muestra en el capilar con pinzas, mientras que tanto el capilar como la muestra están completamente sumergidos para evitar la inclusión de burbujas de aire. Utilice una punta capilar o de aguja de jeringa más pequeña como varilla de empuje(Figura 2B).
   6. Tome el capilar de la muestra del vidrio medio del reloj, usando pinzas. En el caso de PFD, cubra la tapa del plato Petri.
6. Dé forma el papel tisú en un punto fino y utilícelo para eliminar alrededor de 1 mm de líquido de ambos extremos del capilar.
7. Derretir un pequeño volumen de cera capilar con una pluma de cera. Aplique cera en ambos lados. La cera se volverá opaca cuando se solidifique. Tenga cuidado de excluir las burbujas de aire del capilar(Figura 2C).
   NOTA: Evite el sobrecalentamiento de la cera o el capilar, ya que esto puede causar un hervor explosivo, así como bolsillos de cavitación cuando la muestra terminada se enfríe.
8. Después, raspa el exceso de cera del exterior del capilar usando un bisturí y límpiate con papel tisú fino.

3. Montaje de la muestra

1. Coloque una microcobina debajo del estereomicroscopio e inserte la muestra con pinzas mientras mantiene la microcobra estable(Figura 2D).
2. Utilice una varilla para centrar la muestra en la microbobina, deslizando el capilar dentro de la bobina solenoide.
3. Opcionalmente, aplique cinta adhesiva para fijar la posición del capilar.
4. Inspeccione el capilar para asegurarse de que no haya burbujas de aire visibles dentro de la bobina solenoide, para evitar la destrucción de la señal MR causada por diferencias de susceptibilidad.
5. Fije la microcobina a la toma de la base de la sonda, manteniendo la microbobina en posición vertical(Figura 3A,3B).
6. Deslice con cuidado las bobinas de gradiente de tres ejes sobre la microbobina mientras coincide con los conectores de refrigeración por agua del gradiente con el de la base de la sonda (Figura 3C). Gire la rosca de tornillo en la base de la sonda para fijar el gradiente en su lugar.
   NOTA: Este paso solo se aplica a una sonda Micro5. En el caso de otros sistemas como Micro2.5 o Biospect, los gradientes están en un zócalo separado que la bobina.

4. Determinación de las características de la bobina

1. Si la bobina se prueba por primera vez, utilice la solución de muestra de referencia para crear una muestra homogénea, que es útil para la calibración de potencia y las pruebas de homogeneidad B_1. Los posibles problemas de susceptibilidad debido a los cables de la bobina se pueden probar fácilmente con esta muestra de referencia.
2. Inserte la sonda en el imán y conecte los cables necesarios: cable de transmisión/recepción de RF, líneas de refrigeración por agua, cable termopar y línea de refrigeración de aire.
3. Ajuste la temperatura de refrigeración por agua deseada (recomendado 298 K) para la unidad de refrigeración por agua.
4. Ajuste la temperatura objetivo (298 K) y el flujo de gas objetivo (300 L/h). El flujo de gas puede ser diferente para un diseño de bobina diferente o volumen de muestra. Esto sólo se aplica a los sistemas con un sistema de control de temperatura.
   NOTA: Los siguientes pasos solo son necesarios cuando se prueban bobinas nuevas (construidas en casa).
5. Conecte la sonda utilizando un cable coaxial de 50 Ω a un analizador de red con un ancho de barrido convenientemente amplio (400 MHz), centrado en la frecuencia de resonancia prevista.
6. Observe los modos resonantes ajustando los capacitores de coincidencia y afinación variables que están presentes en la base de la sonda.
7. Sintonice y haga coincidir el modo resonante con la frecuencia deseada.
8. Opcionalmente, determine el factor de calidad de la bobina (factor Q) en el analizador de red. Un método para obtener el factor de calidad es utilizar una red de acoplamiento y dividir la frecuencia central (f_c) por la anchura de la inmersión de reflexión a -7 dB (es decir, Q a f_c /(f₁ - f₂)¹⁴. Ajuste f_c a la frecuencia de funcionamiento del imán, mientras que f₁ y f₂ se establecen en el punto de -7 dB a la izquierda y a la derecha de f _c, respectivamente. Algunos analizadores de red tienen la determinación del factor Q integrada.
9. Inicie una prueba de reflectancia en el escáner, generalmente llamada curva de tambaleo, y ajuste la afinación y la coincidencia según sea necesario. Se recomienda ajustar los capacitores de ajuste y coincidencia al punto medio de su gama para las bobinas nuevas. Por lo tanto, comience con un ancho de barrido espectral alto. En algunos casos, podría ser más conveniente sintonizar y emparejar la bobina fuera del imán en un analizador de red.
10. Seleccione un archivo de cuña para la bobina de mayor volumen de la sonda de imagen si está disponible. Si a partir de una bobina que se ha utilizado anteriormente, utilice un archivo de cuña disponible. Si ambas opciones no están disponibles, comience con todos los valores de shim establecidos en 0.
11. Seleccione la configuración de bobina correcta para la microbobina si está disponible en el software de imágenes (esdecir, ParaVision). De lo contrario, cree una nueva configuración de bobina que coincida con las especificaciones de la bobina (por ejemplo, afinada simple o doble ajustada) de acuerdo con el manual del sistema. Las estimaciones de los límites seguros para esta microcoil solenoide utilizada en esta investigación con un diámetro interior de 1,5 mm de tamaño es de 1 ms a una potencia máxima de 1 W y una potencia continua de 1 mW.
    ADVERTENCIA: Los condensadores pequeños (normalmente de 1 mm de tamaño) necesarios para las microcobalas son altamente sensibles y se dañan fácilmente por altos voltajes. La determinación automatizada de la potencia del pulso podría no funcionar con bobinas no estándar, y potencias demasiado altas podrían causar daños en la bobina u otras partes del espectrómetro. Por lo tanto, se recomiendan ajustes manuales.
12. Registre una curva de nutation para una nueva bobina para obtener una indicación de la potencia DE RF correcta para la bobina(Figura 4). En caso de que se desconozcan los límites de seguridad para la bobina, comience con 10 s a una potencia de pulso baja de 0,6 W y aumente lentamente las longitudes del pulso en 1 s a la vez hasta que aparezca la señal.
    1. Usando un experimento FID en ausencia de codificación de gradiente, varíe la longitud del pulso RF sistemáticamente mientras mantiene la potencia del pulso constante. La longitud de pulso ideal es la longitud del pulso, donde la intensidad de la señal alcanza el máximo. Si prueba una bobina nueva, utilice un pulso de 10 s con una potencia muy baja primero y comience a aumentar la potencia del pulso gradualmente.
       NOTA: En caso de que la potencia sea mucho mayor de lo esperado para la combinación de características de bobina y espectrómetro, esto ya es una indicación de que se ha seleccionado el modo resonante incorrecto.
    2. Para una bobina con un campo homogéneo B_1-field,como una bobina solenoide, determine el pulso de 180o donde la intensidad de la señal disminuye a cero²².
13. Establezca la potencia de pulso determinada de 90o en la tarjeta de ajuste del estudio creado. En ParaVision, la tarjeta de ajuste de potencia de referencia se puede utilizar para introducir la potencia del pulso duro.
14. Utilice un escaneo localizador con 3 rebanadas, una rebanada en cada uno de los tres ejes primarios, para localizar la posición de la bobina dentro del imán. Para ello, cargue un análisis de localizador desde la biblioteca predeterminada del espectrómetro. Comenzando con un campo de visión grande sin desplazamiento se recomienda. Realice un ajuste automatizado de ganancia del receptor e inicie manualmente la medición.
    NOTA: Si la muestra está exactamente en el centro del sistema de degradado, el análisis del localizador mostrará la muestra. Si la bobina o la muestra no está centrada en los sectores de la imagen o falta, es necesario ajustar el escaneo del localizador, en cuyo caso el paso 4.12 debe realizarse de nuevo.
15. Alternativamente, utilice una forma complementaria para encontrar el pulso correcto de 90o basado en la evaluación de imágenes. Una vez que se encuentra una potencia de pulso aproximada utilizando la curva de nutation, ajuste las potencias de pulso gradualmente para comprobar la imagen para la homogeneidad de campo B_1. Para algunas bobinas con un campo inhomogénico B_1, la potencia de pulso de 90o determinada utilizando la curva de nutación puede ser sobreestimada, lo que conduce a sobrepasar en el punto dulce deseado de la bobina. En este caso, reduzca la potencia del pulso de referencia y compruebe las nuevas imágenes con las imágenesanteriores (Figura 5).
16. Ajuste manualmente el campo magnético basado en la señal FID. Un orden recomendado para el shimming inicial es Z-Z²-Z-X-Y-Z-Z²-Z-XY-XZ-YZ-Z. En el caso de un solenoide, el eje de simetría principal está en el plano XY. Por lo tanto, las cuñas en diferentes direcciones pueden resultar en una corrección más fuerte de la homogeneidad B₀ para esta configuración de bobina. Las cuñas de orden superior tienen poco efecto y pueden ser ignoradas.
17. Calcular un SNR normalizado por volumen para permitir la comparación de las características de las microbobinas entre diferentes sistemas, adaptados del protocolo¹⁸del fabricante. Para las microcoballas utilizadas aquí, utilizamos una secuencia de eco de giro con los siguientes parámetros: campo de visión (FOV) 6 mm x 6 mm, tiempo de repetición (TR) 1000 ms, tiempo de eco (TE) 7 ms, matriz 256 x 256 y espesor de corte a 0,5 mm. Ajuste el grosor de la rebanada hasta que la ganancia del receptor sea unitaria. A continuación, ajuste el número de sectores para que los sectores se extiendan más allá de la región de homogeneidad de campo B_1. Grabe las imágenes sin promediar señal, si es posible.
    1. Determine el volumen normalizado SNR (SNR/mm³) en dos pasos. En primer lugar, calcule el volumen de voxel (V_voxel)(Eq. 1):
       (1)
       NOTA: Las unidades para el_corte D_x, D_y y D están en mm. Este cálculo también se puede realizar para una serie de sectores.
    2. Seleccione las regiones de interés para determinar la intensidad de la señal(μ_ROI)de la muestra y la intensidad de la señal_{(μ ruido)}y la desviación estándar (σ_ruido)para una región fuera de la muestra (esdecir, el ruido). La señal media se toma del centro de la imagen, mientras que la señal de ruido se calcula a partir de los parches de esquina (Figura 6). Para estos cálculos se puede utilizar el software de control del espectrómetro o el software de procesamiento de imágenes de uso general. Utilice una sola repetición si es posible, para mantener la comparabilidad entre diferentes bobinas.
    3. Utilice los valores para calcular un volumen normalizado SNR (Eq. 2):
       (2)
       Para la bobina utilizada aquí en combinación con la solución de referencia, utilizando Eq. 2 resulta en la siguiente solución:
       (3)
       NOTA: Al comparar el SNR de bobinas a diferentes intensidades de campo magnético, las propiedades de relajación del fantasma deben medirse^23,a menos que se utilice un tiempo de repetición muy largo y un tiempo de eco muy corto.
18. Compruebe si hay problemas de susceptibilidad debido a las inhomogeneidades del campo magnético: cargue y ejecute una secuencia de eco de gradiente múltiple (MGE) (Figura 7). Las inhomogeneidades del campo magnético debido a diferencias de susceptibilidad son visibles en las imágenes con tiempos de eco más largos, ya que el eco de degradado no reenfoca los giros, que se desfasen debido a las inhomogeneidades de campo estáticos. De esta manera, se pueden visualizar inhomogeneidades en la muestra (debido a los espacios de aire en la muestra), así como las inhomogeneidades de campo B₀ introducidas por el material de la bobina. Utilice los siguientes parámetros, que se ajustarán en función de las especificaciones del espectrómetro y la bobina utilizados: TR 200 ms, TE 3,5 ms con 48 ecos espaciados a 3,5 ms de distancia, ángulo de volteo 30 grados. Tamaño de matriz 128 x 128.
    NOTA: Si se observaron varios modos resonantes (potenciales) o caídas de reflexión en la curva de resonancia (wobble), repita los pasos anteriores para cada modo resonante para determinar el más sensible. Dependiendo de la microcobra, diferentes partes del ensamblaje de microbobina pueden ser propensas a modos de resonancia no intencionales.

5. Imágenes de alta resolución

1. Ejecute un experimento 3D-FLASH con los siguientes parámetros: TR 70 ms, TE 2,5 ms, tamaño de matriz de 128 x 64 x 64, FOV 1,6 x 0,8 x 0,8 mm, ángulo de volteo de 30o y ancho de banda del receptor 50 kHz.
2. Derive las potencias de pulso de la potencia de pulso de referencia determinada anteriormente; esto es automático en la mayoría de los programas de imágenes. Determine la ganancia del receptor mediante ajustes automáticos. Ajuste el FOV si es necesario, cubriendo todo el objeto en ambas direcciones de codificación de fase para evitar el alias. Ejecute una simulación de ciclo de trabajo de gradiente, si está disponible en el sistema, para verificar que el ciclo de trabajo del experimento permanece dentro de las especificaciones de las bobinas de gradiente.
   NOTA: Estos parámetros son específicos de la bobina utilizada para la demostración; es importante optimizar los detalles del sistema local.

6. Recuperación de muestras para su posterior estudio o almacenamiento

1. Retire el capilar de la muestra de la microbobina.
2. Con pinzas, retire los tapones de cera debajo de un estereomicroscopio.
3. Utilice una jeringa para lavar la muestra del capilar con una solución de elección. Alternativamente, utilice una varilla de empuje de vidrio para expulsar la muestra.
4. Para evitar la deshidratación de la muestra, guárdelo en un medio adecuado para su almacenamiento.

Resultados

Caracterización de bobinas
Tras el ajuste exitoso y la coincidencia de una bobina, su rendimiento puede caracterizarse por el factor Q de la bobina, el pulso de referencia de 90o y el SNR/mm^3. Para la bobina solenoide de 1,5 mm con susceptibilidad ID que se muestra aquí, el factor Q medido (descargado) fue de 244, en comparación con 561 para una bobina de jaula de aves de 5 mm.

El pulso de referencia de 90o fue de 12o a un nivel de potencia de 0,6 W; cf. 5 s a 45 W para una bobina de jaula de aves de 5 mm(Figura 4 y Figura 5). Esto equivale a una intensidad de campo de pulso RF (B₁), usando de 0.53 mT para la microbobina y 1.17 mT para la bobina de jaula de aves¹⁴ donde y es la relación giromagnética, mientras que tau es la duración del pulso. Dado que los niveles de potencia de pulso (P) difieren, las bobinas se pueden comparar en términos de eficiencia de transmisión: 0,69 mT/W^1/2 y 0,18 mT/W^1/2 para la microcoil y la jaula de aves respectivamente¹⁴. Comparado por un pulso de 90o, la microbobina se encuentra como un factor ≈ 4 veces más sensible que la bobina de jaula de aves.

Efecto de la coincidencia de susceptibilidad
A intensidades de campo ultra-altas, la susceptibilidad a la muestra y a la bobina se convierte en un factor dominante para la calidad de imagen, como se ve en la Figura 7A,7B. En comparación con una bobina que carece de un depósito de fluido coincidente de susceptibilidad, la señal se retiene más tiempo y de forma más homogénea en una muestra de referencia. Sin embargo, debido al depósito de susceptibilidad, las dimensiones máximas de la muestra disminuyen con respecto a la bobina sin el depósito.

Imágenes de alta resolución
Se alcanzó una alta resolución de 13 x 13 x 13 m³ de un espécimen de raíz de la raíz truncatula de Medicago en 20 horas y 23 minutos(Figura 8). A partir de la superficie de la raíz, se observa la corteza radicular, junto con un poco de agua residual en el exterior de la raíz. Además, el xiónigo se observa como una banda oscura que encierra el floema. Algunas bolsas de aire se observan como puntos oscuros con pérdida de señal completa.

Los nódulos de raíz simbiótica de M. truncatula también pueden ser imageados usando este protocolo (Figura 9). Usando una bobina ligeramente más grande y sin igual (longitud circa 3500 m, diámetro interior de 1500 m), las imágenes con una resolución de hasta 16 x 16 x 16 m³ se obtuvieron en 33 minutos.

Figura 1: Una microbobina solenoide. (A) El diseño de la bobina solenoide consiste en alambre en bucle helicoidalmente, típicamente envuelto alrededor de un capilar. La geometría del alambre, como su grosor, diámetro, número de bobinados y espaciado de alambre, influyen en las características de la bobina. (B) Una microboma solenoide casera con un depósito para fluido de coincidencia de susceptibilidad (Fomblin). Consiste en una herida de alambre de cobre recubierto de 0,4 mm de espesor seis veces alrededor del capilar con un diámetro exterior de 1500 m y una longitud de bobina de 3500 m. La bobina se sumerge en un depósito que está hecho de una jeringa. Se pueden insertar capilares de muestra hasta un diámetro exterior de 1000 m. Se utilizan dos capacitores, un condensador de 1,5 pF en serie con el inductor y un segundo condensador de 1,5-6 pF variable se coloca en paralelo al inductor. Todos los componentes se sueldas a una placa de fibra de vidrio (amarillo). Se monta en un soporte comercial (polímero gris) que se modifica para soportar el depósito.  (C) Componentes de diseño de bobina solenoide: 1. bobina solenoide, 2. capilar de muestra, condensador de ajuste de 3.5 pF, 4. condensador de coincidencia variable, 5. placa base de fibra de vidrio, 6. cables de alambre de cobre. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Preparación de muestras bajo un estereomicroscopio. (A) Elementos necesarios para la preparación de microcobales. De izquierda a derecha: 1. Solución de referencia CuSO_4, 2. perfluorodecalin, 3. microbobina, 4. bisturí, 5. pinzas de tensión positiva, 6. pinzas, 7. capilares diámetro exterior a 1000 m, 8. pluma de cera, 9. cera capilar, 10. guantes de nitrilo, 11. estereomicroscopio, 12. reloj de cristal con cubierta de plato Petri, 13. material vegetal en sustrato de crecimiento. No se muestra: Jeringa de 2 ml con aguja de 0,8 x 40 mm y papel de tejido fino. (B) Primer plano de la inserción de la muestra en un capilar utilizando pinzas, mientras que ambos se mantienen sumergidos. (C) Sellado del capilar utilizando cera fundida. (D) Inserción del capilar preparado en la microbobina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: El componente de una sonda de microimagen. (A) Base de sonda Micro5, que contiene todas las conexiones necesarias para refrigeración por agua, calefacción, sensores de temperatura, potencia de gradiente, RF (conector coaxial visible) y, opcionalmente, identificación de sonda (PICS). Debajo de la base de la sonda hay perillas que permiten ajustar la variable de afinación y capacitores coincidentes, así como tornillos de retención para mantener la sonda en su lugar dentro del espectrómetro. (B) El montaje de microbobinas construido en casa sobre la base de la sonda. Observe los capacitores variables (cerámica blanca) montados en la base de la sonda que permiten la afinación y la coincidencia. (C) Gradiente integrado de 3 o axiales montado en la base de la sonda con receptáculos de refrigeración por agua y contactos chapados en oro para la puesta a tierra del gradiente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Curva de tuerca. Se adquiere una curva de nutación para determinar la potencia del pulso de referencia. La potencia del pulso de referencia (pulso de 90o) se define como la combinación de potencia y longitud de pulso necesaria para generar un campo B₁ que voltea toda la magnetización disponible en la dirección z al plano transversal. Se registra una serie de pulsos en ausencia de codificación de gradiente. Con cada pulso, se incrementa la longitud del pulso o la potencia del pulso. Aquí la potencia del pulso se establece en 0.6 W, mientras que la longitud del pulso se incrementa en 1 s cada vez. La intensidad máxima de la señal indica el pulso de 90o, alrededor de 12 s. El pulso de 180o también se puede determinar de esta manera utilizando la intensidad mínima. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Determinación visual de la potencia de pulso de 90o. Una vez que se ha encontrado una potencia de pulso de referencia aproximada utilizando una curva de nutación, se puede comprobar visualmente variando la longitud del pulso. Dependiendo de la bobina, el campo B₁ puede ser más o menos sensible a los cambios. (A) 11 s de longitud de pulso. (B) Longitud del pulso de 12 s, óptima para esta bobina. (C) Longitud del pulso de 13 s. (D) Longitud del pulso de 20 s. Si la potencia del pulso es demasiado alta, puede producirse un sobrecuelto, lo que reduce la intensidad de la imagen en el centro de la bobina (punta de flecha). El campo B₁ aumentado también aumenta el rango de la bobina, como se puede observar en el ancho de la imagen. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Colocación de la región de interés. Se pueden ver las regiones de interés (ROI) para el cálculo de SNR normalizado por volumen. La intensidad media de la muestra se toma de un ROI que se encuentra dentro de la muestra de solución de referencia. El ruido medio y la desviación estándar se calculan a partir de uno o más ROI ubicados en las esquinas de la imagen. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: Homogeneidad RF evaluada por imágenes de eco de gradiente. Una secuencia de eco de degradado múltiple (MGE) se utiliza para evaluar la homogeneidad RF(B₁ -Field) utilizando una serie de ecos de degradado. Los parámetros básicos fueron: tiempo de repetición 200 ms, tiempo de eco 3,5 ms con el número de ecos 48, espaciado de eco 3,5 ms, 64 promedios, tiempo de adquisición 27 m 18 s, ángulo de volteo 30o. El campo de visión era de 5 x 5 mm, matriz 128 x 128, resolución 39 x 39 x 200 m. (A) bobina de coincidencia de susceptibilidad. El líquido de coincidencia de susceptibilidad (Fomblin) que rodea la bobina RF reduce los efectos de susceptibilidad debido al cable de la bobina. Las pequeñas burbujas de aire causan la pérdida de señal a medida que aumenta el tiempo de eco. (B) Una bobina (no susceptibilidad coincidente) con el mismo diámetro de la bobina. En tiempos de eco más largos, se observan artefactos crecientes causados por la inhomogeneidad de campo B_0. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 8: Imágenes 3D de una sección raíz truncatula de Medicago. (Arriba) imagen FLASH. Se pueden distinguir varias características de la sección raíz, incluyendo la epidermis (e), la corteza (c), el phloem (ph) y el xylem (xy). Las bolsas de aire (a) en la causa raíz causan la pérdida de señal completa. Los parámetros básicos fueron los siguientes: Tiempo de repetición 70 ms, tiempo de eco 2,5 ms, 256 promedios, tiempo de adquisición 20 h 23 m. Resolución 13 x 13 x 13 m³. El tamaño de la matriz era de 128 x 64 x 64 y campo de visión de 1,6 x 0,8 x 0,8 mm. Ancho de banda del receptor 50 kHz. (Inferior) Imagen MSME. Los parámetros básicos fueron los siguientes: Tiempo de repetición 500 ms, tiempo de eco 5,2 ms, 28 promedios, tiempo de adquisición 15 h 55 m. Resolución 13 x 13 x 13 m³. El tamaño de la matriz era de 128 x 64 x 64 y campo de visión de 1,6 x 0,8 x 0,8 mm. Ancho de banda del receptor 70 kHz. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 9: Imágenes 3D de un nódulo raíz truncatula de Medicago. (Superior) Imagen de baja resolución. Los parámetros básicos fueron los siguientes: Tiempo de repetición 60 ms, tiempo de eco 2,3 ms, 4 promedios, tiempo de adquisición 4 m. Resolución 31 x 31 x 31 m³. El tamaño de la matriz era de 64 x 32 x 32 y campo de visión 2 x 1 x 1 mm. Ancho de banda del receptor 50 kHz. (Inferior) Imagen de alta resolución. Los parámetros básicos fueron los siguientes: Tiempo de repetición 60 ms, tiempo de eco 2,3 ms, 8 promedios, tiempo de adquisición 33 m. Resolución 16 x 16 x 16 m³. El tamaño de la matriz era de 128 x 64 x 64 y campo de visión 2 x 1 x 1 mm. Ancho de banda del receptor 50 kHz. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Este protocolo es el más adecuado para muestras biológicas, ya que muchos materiales y muestras geológicas tienen tiempos de relajación T₂ significativamente más cortos, que no pueden ser imageados por las secuencias utilizadas aquí. Incluso algunos tejidos biológicos, que presentan una alta heterogeneidad de susceptibilidad magnética de muestra, pueden ser difíciles de imaginar en un campo ultra alto, ya que los efectos están correlacionados con la intensidad de campo²⁴. El protocolo no sólo es útil para bobinas nuevas, sino que también puede ayudar en la resolución de problemas y el diagnóstico de posibles problemas. Al probar muestras nuevas o desconocidas, este protocolo se puede realizar de antemano en la solución de referencia para comprobar que la configuración experimental funciona de acuerdo con las especificaciones. Esto ayuda en la solución de problemas ya que el espectrómetro se puede excluir como una fuente de artefactos y mal funcionamiento. Además, esto establece los capacitores de afinación y coincidencia en la sonda a valores típicos de la microbobina.

Cuando no se registra ninguna señal en el primer experimento, el campo de visión del análisis del localizador se puede ampliar para comprobar si se ve la muestra. A continuación, vuelva a comprobar si la bobina está sintonizada correctamente e intente realizar otro análisis del localizador. Es posible que la bobina presente modos resonantes no intencionales adicionales, en cuyo caso es necesario determinar el correcto. Si todavía no se puede obtener ninguna imagen, retire la muestra para comprobar su posición dentro del conjunto de microcoil y compruebe que la muestra está intacta (es decir, no hay burbujas de aire o fugas en los sellos presentes). Por último, se puede preparar una muestra con agua en lugar de PFD. En caso de que la muestra dé poca señal detectable en la exploración del localizador, el agua circundante en el capilar todavía se puede detectar.

Como las microcobalas están idealmente muy cerca de la muestra, las diferencias de susceptibilidad magnética entre el aire y el cable pueden causar pérdida de señal adicional, como se ve en la Figura 7B. Los artefactos potenciales incluyen desajuste espacial y variación anómala de la intensidad de la señal. Especialmente las secuencias de pulsos de tipo gradiente-eco se ven afectadas por esta pérdida de señal no uniforme. Por esta razón, presentamos una bobina de susceptibilidad, sumergiendo el alambre en líquido fluorinert (Fomblin o FC-43). El método de estimación B₁ incluido en este protocolo puede ayudar a determinar si las diferencias de susceptibilidad B₁ justifican la inclusión de estrategias de coincidencia de susceptibilidad en el diseño del ensamblaje de la bobina. Un enfoque alternativo para construir una bobina coincidente de susceptibilidad es utilizar el alambre²⁵de susceptibilidad. Además, sólo los problemas de susceptibilidad debido a la bobina se abordan con este enfoque. Las discrepancias de susceptibilidad dentro de la muestra (por ejemplo, debido a espacios aéreos) siguen siendo difíciles.

Las bolsas de aire o burbujas plantean un desafío experimental que causa una amplia pérdida de señal, causada por diferencias de susceptibilidad en la interfaz del aire y el fluido o la muestra¹⁹ (Figura 5A). Un aspecto crítico de la preparación exitosa de la muestra es la inmersión tanto de la muestra como del capilar. Sin embargo, incluso las burbujas pequeñas pueden causar pérdidas de señal, especialmente para secuencias de tipo de eco de gradiente. Las burbujas de aire móviles pueden migrar a través del capilar hasta que estén en contacto con la muestra. Algunos de estos efectos se pueden aliviar inclinando ligeramente el capilar para que un extremo sea más alto que el otro. La inclinación garantiza que las posibles burbujas de aire se mantienen en su lugar en el extremo superior, sin alterar la muestra. También es importante comprobar que la cera capilar forma un buen sello, ya que la deshidratación puede hacer que se formen grandes burbujas de aire.

Para los espacios de aire dentro de la muestra, PFD se utilizó para llenar los espacios de aire intercelulares sin penetrar las membranas celulares²⁶. Sin embargo, incluso con este enfoque, no pudimos eliminar todos los espacios aéreos. Además, este enfoque significa que necesitamos un agente adicional, que por lo general no se prefiere debido al deseo de estudiar un sistema de la manera más no invasiva posible.

La forma cilíndrica de los capilares significa que las configuraciones de perfusión deben ser viables, especialmente para los tejidos vulnerables a la caries, como las biopsias o el estudio de los procesos en el material radicular vivo. Dos pasos podrían realizar una configuración de perfusión. En primer lugar, conectar un tubo de alimentación medio, así como un tubo de drenaje a cada lado del capilar sería suficiente para crear un quimiostato. En segundo lugar, la adición de una sangría en el capilar de la muestra podría mantener la muestra en su lugar contra la dirección del flujo. Esto es análogo a un protocolo publicado para microbobinas planas¹⁰.

La naturaleza no invasiva de las imágenes por RMN, combinada con el líquido inerte utilizado en este protocolo (PFD o Fomblin) significa que después de la finalización de los experimentos, las muestras pueden ser retiradas de sus capilares para su estudio posterior. Las combinaciones incluyen microscopía óptica o electrónica y otras técnicas destructivas de imagen. Recientemente hemos demostrado una combinación con microscopía óptica en los nódulos de raíz truncatula de Medicago ²⁷.

Hemos demostrado un método para la toma de imágenes de material vegetal utilizando microcoflicciones dedicadas en un espectrómetro de RMN de campo ultra alto. Los volúmenes de muestra relativamente grandes se pueden estudiar a alta resolución con buena homogeneidad de RF. Además, las imágenes espectroscópicas se pueden realizar a resoluciones más altas de lo que sea factible. La adaptación del diseño de la microbobina a las muestras se facilita mediante un método eficiente para determinar las características de rendimiento de la bobina. El enfoque de la bobina solenoide también se puede aplicar fácilmente a otras muestras que no sean plantas, incluyendo tejido animal.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Preparación de solución de referencia
CuSO4	Sigma-aldrich	469130	Polvo cristalino para crear solución de referencia
D2O	Sigma-aldrich	151882	Líquido utilizado para preparar la muestra de referencia
Báscula	Sartorius	PRACTUM513-1S	para el pesaje de compuestos
Preparación de muestras
Capilar 1000 μ m (Diámetro exterior)	Hilbenberg GmbH	1408410	Capilares de muestra
Cera capilar	Hampton Research	HR4-328	Cera sólida utilizada para sellar muestras
Bisturí desechable	Swann-Morton	n.º 11	Se utiliza para extirpar muestras
Perfluorodecalina	Sigma-aldrich	P9900	Líquido utilizado para sumergir muestras
Microscopio estereoscópico	Olympus	SZ40	Microscopio binocular de mesa
Jeringa	genérica	:	se utiliza para aplicar PFD y manipular la muestra
Bomba de vacío	Vacuubrand	MZ2C	Bomba de vacío de membrana de dos etapas utilizada para eliminar las bolsas de aire de las muestras.
Bolígrafo de cera	Hampton Research	HR4-342 Bolígrafo de	cera de mano utilizado para derretir y aplicar cera capilar a muestras
Hardware de imagen22,3
T Imán	Bruker GmbH	950 US2	Diámetro estrecho Imán superconductor
Bruker	GmbH-Se	utiliza para regular la temperatura de la
sondaConsola	Bruker GmbH	Avance III HD	Controla el funcionamiento del espectrómetro
Bobinas de gradiente Micro5	Bruker GmbH	Mic5	Bobinas de gradiente extraíbles montadas en el cuerpo de la sonda Micro5
sonda Micro5	Bruker GmbH	Mic5	Sostiene microbobinas y bobinas de gradiente Microbobina
RF		casa Analizador
	de redes vectorial FomblinCopper Mountain Technologies	TR1300/1	Se utiliza para realizar la prueba de reflectancia S11, rango de frecuencia de 300 kHz a 1,3 GHz
Enfriador de agua	Bruker GmbH	BCU-20	Refrigeración por agua de circuito abierto para disipar el calor de la operación de la bobina de gradiente.